Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones K08NS065157 (al TAF) Además, el Centro Penn para los trastornos musculoesqueléticos, P30AR050950 Premio Número del Instituto Nacional de Artritis, Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel apoya este trabajo (TAF y Steven S. Scherer). Por último, Shriners Pediatric Research Center financiación inicial (TAF) apoya este trabajo. Nos gustaría agradecer al Dr. Young-Jin Hijo de un principio que demuestra todo el procedimiento de montaje y Amy A. Kim, por su asistencia en la elaboración de los bocetos de la figura 1.

1. Los sujetos animales 1,1. Tratamiento <ol><li> Todos los procedimientos con animales se debe realizar con la aprobación del Cuidado de Animales de la institución local y el Comité de Ética y de acuerdo con el uso y el Comité y de los Institutos Nacionales de Salud directrices, con las medidas adoptadas para minimizar el dolor y el malestar. </li><li> Nuestros animales fueron alojados en condiciones controladas de temperatura en una luz de marcha atrás de 12 horas y el ciclo oscuro, mientras que alimentó ratón chow y el agua ad libitum. </li><li> Para los estudios de regeneración de adultos, los ratones deben tener al menos 6 semanas de edad cuando el aplastamiento del nervio ciático, se lleva a cabo. Esta edad está más allá del momento en que la poda de las uniones neuromusculares polyneural llevará a cabo. </li><li> En estos experimentos, hemos utilizado de 6-8 semanas de edad C57BL / 6 ratones adquiridos de Charles River. Al comparar la regeneración después de aplastamiento del nervio ciático (es decir: tasa de crecimiento del axón) cepas de ratón debe ser la misma, como las diferencias en la regeneración axonal no han sidoed entre las diferentes cepas puras 15,16. Si los ratones manipulados genéticamente se van a utilizar, los controles littermate son los más apropiados. </li></ol> 1,2. Preparación quirúrgica <ol><li> Los animales son profundamente anestesiados para la cirugía usando un cóctel de ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) mediante inyección intraperitoneal. Cada animal recibe también una inyección subcutánea de meloxicam (10 mg / kg) para minimizar el dolor postoperatorio. </li><li> Tanto los cuartos traseros son cuidadosamente afeitado con un cortaúñas quirúrgicos (Roboz, RC-5903) y la depilación se ha completado con la crema de depilación Nair (que se encuentra en la farmacia local). </li><li> La piel se limpia con aplicadores de algodón estériles con punta y matorrales betadine quirúrgico (Fisher Scientific, 19066452). </li><li> Ungüento oftálmico (Fisher Scientific, 19082795) se aplica a los ojos, utilizando aplicadores de algodón estériles con punta. </li><li> El ratón se coloca sobre una placa de acero inoxidable limpio, en virtud del cual se ha colocado un homeot precalentadosistema de manta hermic (Harvard Apparatus, 507222F). Animales temperatura se mantiene a 37 ° C. </li><li> Todas las extremidades son grabadas hacia abajo, teniendo cuidado de situar las extremidades posteriores simétricamente de modo que la articulación de la rodilla hace un ángulo recto con el cuerpo (Figura 1, panel A). </li><li> El campo quirúrgico se cubre con un paño estéril. Todos los instrumentos se esterilizan en autoclave o la esterilización en caliente talón (Herramientas de Bellas Ciencias, 18000-45) y el cirujano usa una máscara, bata y guantes estériles. </li></ol> 2. Crush reproducible del nervio ciático <ol><li> Después de la preparación, una incisión semicircular a través de la línea media (Figura 1) se hace en la piel. La piel es suavemente disecados de la musculatura subyacente, y pliega para permanecer fuera del camino durante el procedimiento. Se mantiene húmedo el uso de aplicaciones de 0,1 ml de solución salina estéril (Hospira, 0409-4888-20) durante el procedimiento. </li><li> Abrir el plano fascial entre el glúteo mayor y el jefe anterior de la femori bícepss revela el nervio ciático (Figura 1, panel A). Para un control quirúrgico, el nervio ciático contralateral debe ser expuesto y movilizado, pero dejó intacta. La musculatura de los glúteos se vuelve a frente y se sutura con seda trenzada 6-0, suturas no absorbibles (Roboz, SUT-1073-11). </li><li> El nervio ciático experimental se expone entonces de la misma manera, con retractores en lugar de facilitar la visualización (Figura 1, el panel B). Los retractores se esterilizan antes de su uso. Nota: aunque los sistemas de retractores están disponibles comercialmente, a menudo son bastante caros. Hemos sido capaces de hacer un sistema de retracción satisfactoria el uso de fuentes de bajo costo de hardware y los pasadores de insectos (ver la sección de Materiales). </li><li> El nervio ciático está suavemente liberada del tejido conectivo que rodea el uso de tijeras iridectomía. </li><li> Uso de una multa de 5/45 (Herramientas de Bellas ciencia, 11.251-35) con fórceps, el nervio se coloca en la mandíbula inferior de unas pinzas hemostáticas super-fino (Ciencia bien tambiénls 13020-12). Los tres fascículos son secuencialmente alineado, no en la parte superior de la otra (figura 1, recuadro B). Las pinzas hemostáticas han sido grabadas con una marca de 1,5 mm de la punta. La porción más externa de la ciática se coloca en línea con esta marca antes de aplastamiento. Esto asegura un aplastamiento de anchura uniforme, y que el nervio no se extiende más allá de las mordazas de las pinzas hemostáticas cuando aplanada debido a la fuerza de aplastamiento. Si el nervio se extiende más allá de la punta fórceps el nervio sólo será parcialmente aplastado. </li><li> La aglomeración se hace perpendicular al nervio a 45 mm desde el tercer dedo, según se mide por un hilo que se aproxima a la trayectoria del nervio ciático. El nervio es aplastado una vez durante 15 segundos a 3 clics de las pinzas hemostáticas. Hay que tener cuidado de no estirar el nervio. Cuando las pinzas hemostáticas se volvió a abrir, todo el nervio óptico debe ser transparente en el sitio de aplastamiento. </li><li> Un segundo par de pinzas hemostáticas (idéntica a la primera) que ha sido pre-inmersión enpolvo de carbono (Fisher Scientific, C272-500) se utiliza para marcar el sitio de aplastamiento. El nervio es aplastado en el lugar de aplastar misma durante 15 segundos a 3 clics. No de carbono marcado debe extenderse más allá de los límites del enamoramiento inicial. Esto es particularmente importante si precisa marcado del sitio aplastamiento se requiere. Antes de su uso, el polvo de carbono se esteriliza por exposición a luz UV durante dos horas, y posteriormente se maneja utilizando una técnica estéril. <ol><li> Para pre-sumergir las pinzas en el carbono, pero excluye carbono generalizado en el sitio quirúrgico, las pinzas se abren en carbón en polvo, entonces suavemente cerrada (pero no hace clic) cerrado, y el carbono en el exterior de las pinzas hemostáticas se limpió con una gasa estéril . Las pinzas se observan bajo por lo menos 3 aumentos para verificar que las superficies de trituración se recubre uniformemente en carbón en polvo. Si es necesario, se sumergió de nuevo y se secó. </li></ol></li><li> La musculatura glútea es re-oposición y se sutura en la misma forma que el lado contralateral. </li><li> Por último, la incisión de la piel se cierra con 9 clips mm reflex (World Precision Instruments, 500346, 500345: Aplicador). Si 9 clips reflejas mm se encuentran para restringir el movimiento, más pequeños clips de reflejos o 6-0 suturas (Roboz, SUT-1073-11) se puede utilizar en su lugar. </li></ol> 3. Cuidados post-operatorios <ol><li> Siguiendo el procedimiento, los animales se colocan en una almohadilla térmica a 37 ° C hasta que muestren signos de movimiento. </li><li> Luego se trasladó de nuevo a su jaula, donde el agua y los alimentos son fácilmente accesibles en el suelo en forma de hidrogel y comida mojada. </li></ol> 4. Semi-delgadas Preparación <ol><li> Tras una sobredosis de pentobarbital (300 mg / kg), la musculatura de la pierna se retira para exponer el * nervio ciático. Con el nervio restante in situ, el cuarto trasero se sumerge en paraformaldehído al 2% y 2% glutaraldehído en tampón fosfato 0,1 M en hielo durante 30 minutos. * Si se completa la preparación muscular en todo el montaje, los músculos son la cosechaed antes de exponer el nervio ciático. </li><li> El nervio se retira cuidadosamente, teniendo cuidado de manejar solamente el extremo proximal. A continuación, el nervio es post-fija en el mismo fijador durante tres horas adicionales. </li><li> Después de la fijación del nervio se enjuaga tres veces en tampón fosfato 0,1 M. </li><li> El nervio se sumerge en tetróxido de osmio al 2% en tampón fosfato 0,1 M durante una hora. </li><li> El nervio es entonces deshidratada por inmersión secuencial en etanol cada vez más concentrada (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). Cada inmersión es de 15 minutos. </li><li> El nervio deshidratado se incuba dos veces en óxido de propileno durante tres minutos cada uno. </li><li> A continuación, el nervio se sumerge en una mezcla 1:1 de óxido de propileno y Embed 812 por lo menos 6 horas (normalmente durante la noche). </li><li> A continuación, el nervio se sumerge en una mezcla 2:1 de óxido de propileno y Embed 812 durante la noche. </li><li> Finalmente, el nervio se sumerge en pura Insertar 812 durante seis horas, a continuación, incrustado en el molde apropiado y BAked a 60 ° C durante 48 horas. </li><li> 1.0 micras secciones se cortan del tronco del nervio distal a una distancia determinada desde el sitio de aplastamiento con una Ultracut UCT ultramicrótomo (Leica), con una cuchilla de vidrio y se tiñeron con azul de toluidina. Secciones delgadas también pueden ser producidos por el examen de la ultraestructura por microscopía electrónica. </li></ol> 5. Todo el montaje en la preparación muscular <ol><li> Primeros ratones son sacrificados con una sobredosis de pentobarbital (300 mg / kg) y las extremidades posteriores se eliminan en las rodillas. </li><li> Cuatro músculos de la extremidad posterior se eliminan para el análisis: el tibial anterior (TA), el extensor largo de los dedos (EDL), soleo y peroneo lateral largo. </li><li> Todos los músculos se eliminan a través de una cuidadosa disección y fijado a través de su tejido conectivo a una Sylgard negro (Fisher Scientific, NC9492579) plato cubierto. Se enjuagaron en PBS, y se fija entonces en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos. </li><li> El TA se enjuaga en PBS, incrustado en octubre (Fisher Scientific, 14-373-65), y se congela rápidamente en un baño de hielo acetona y seco. <ol><li> Se almacena a -80 ° C para la sección delgada en el caso de toda la preparación de montaje no funciona. En general, la TA es demasiado grueso para montajes completos adecuados. </li></ol></li><li> La EDL, sóleo, peroneo largo y se enjuagó durante 3 x 10 minutos en PBS, colocados en 0,1 M de glicina * (Fisher Scientific, AC12007-0010; diluido en PBS) durante 30 minutos, y se enjuagó 3 x 10 minutos en PBS nuevo. Luego se enfrió en hielo frío metanol al 100% durante exactamente 5 minutos a -20 ° C, se enjuagó 3 x 10 minutos en PBS, y se bañó en fluorescentemente conjugado alfa-bungarotoxina (diluido 1:200 en PBS) durante 30 minutos. Los músculos se enjuagó durante 3 x 10 minutos en PBS, seguido por un bloque de 1-hora en 2% de BSA (KPL, 50-61-00) y 0,2% de Triton X-100 (Dot Científico Incorporated, 9002-93-1) en PBS *, y se incubaron durante la noche mientras se balancea a 4 ° C en un cóctel de anticuerpos primarios diluidos en el mismo bloque de 2% de Triton BSA/0.2%. * GLycine y soluciones de bloqueo se realizan en el mismo día que la cosecha músculo y se agitó durante 30-60 minutos a temperatura ambiente antes de su uso. <ol><li> Con motivo de los axones y las sinapsis neuromusculares, se utiliza una combinación de un marcador del ratón monoclonal neurofilamentos (Covance, SMI-312R, diluido 1:1000), un anticuerpo monoclonal de ratón marcador de las vesículas sinápticas (SV2 DSHB, diluido 1:1000), y alfa conjugada con rodamina -bungarotoxina (Sigma-Aldrich, diluido 1:200). Para marcar las células de Schwann reactivos que utilizamos de conejo anti-GAP-43 (Novus Productos Biológicos, NB300-143, se diluye 1/500). Los anticuerpos primarios se visualizan con una IgG1 subtipo específico de fluoresceína conjugado de cabra anti-anticuerpo secundario del ratón y DyLight 649 burro conjugado anti-conejo (Jackson ImmunoResearch, diluido 1:200). </li></ol></li><li> El día siguiente, los músculos se enjuagan en PBS durante 3 x 10 minutos, y se incubaron en secundaria de anticuerpos diluida 1:200 (en solución al 2% de Triton BSA/0.2% de bloqueo). Luego se enjuaga 2 x 10 minutos en PBS, FOllowed por una inmersión de 5 minutos en DAPI (Invitrogen, D3571; diluyó a 300 nM en agua desionizada), y otro 10-minutos enjuague en PBS. </li><li> Cada músculo se diseca en un Sylgard negro (Fisher Scientific, NC9492579) recubierto con placa de Petri. Inicialmente, los tendones se eliminan en sus puntos de inserción en el músculo, y luego los músculos se adelgaza por pelar las fibras musculares interiores (Figura 3, los paneles de CA). Se tiene cuidado de mantener la superficie exterior del músculo, incluyendo las bandas de placa terminal (Figura 3, los paneles DF). Los músculos resultantes se montaron en portaobjetos, además de (Fisher Scientific, 12-550-15) con Vectashield (Vector Laboratories, H-1000) y 22 x 40 mm cubreobjetos de vidrio (Fisher Scientific, 12-548-5C) sellados por clara esmalte de uñas en dos lados. Cuando está correctamente montado en la corredera los contactos de la banda placa terminal del cubreobjetos. </li></ol> 6. Medición de la regeneración <ol><li> La regeneración puede ser estimado en los tres músculos (peroneo, EDL y soleo). A menudo exla regeneración de amina catorce días después de aplastamiento del nervio, un momento en que son un porcentaje sustancial de NMJs re-inervación. Los dos puntos anteriores, y más tarde también son adecuados, dependiendo de la pregunta científica que se formula. En cada músculo, re-inervación de la banda de la placa terminal es examinado. Solamente EN NMJs superficie de la cara se anotó. De esta manera, por lo menos 200 NMJs por músculo puede ser rápidamente examinados. </li><li> Para marcar los músculos re-inervación se determina una &quot;re-inervación relación&quot;. El denominador es el número de uniones neuromusculares, como denervados etiquetados por GAP-43-α bungarotoxina une a las células de Schwann y la inmunorreactividad. El numerador es el número de re-inervados NMJs como etiquetados por neurofilament/SV2 inmunoreactividad. Si es necesario, NMJs puede ser clasificado como parcialmente (cobertura incompleta de α-bungarotoxina por SV2) o totalmente (cobertura completa de α-bungarotoxina por SV2) de re-inervado. Para ejemplos de NMJs inervados y de re-denervado véase la Figura 3, los grupos G y H. </li></ol> 7. Los resultados representativos <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la anatomía de las extremidades posteriores importante aplastamiento del nervio. A. Una incisión en la piel de medio punto se ha hecho revelando la musculatura subyacente. B. La musculatura glútea se ha separado, y puso de manifiesto el nervio ciático (paso 2.4). Una flecha indica el lugar aproximado de aplastamiento. Colocación retractor se muestra como una guía general, y se ajusta durante cada cirugía para aliviar la visualización del ciático y el enfoque de las pinzas hemostáticas para aplastar B (recuadro):. La colocación del ciático en la mandíbula inferior de las pinzas hemostáticas justo antes de aplastamiento (paso 2,5 supra). Fascículos separados están etiquetados para demostrar que son adyacentes en sentido horizontal, pero no verticalmente, durante el enamoramiento. Aunque tres fascículos están etiquetados en este diagrama, también se puede ver un fascículo en cuarto lugar, la rama articular del peroné. Para un dibujo anatómico más detallado de los patrones de ramificación de fascículos del nervio ciático distal hasta el punto de aplastamiento, por favor refiérase a la anatomía de Greene de la Rata, Figura 188 17. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig2.jpg" /> Figura 2. Un sitio aplastamiento de carbono marcado in situ y azul de toluidina-manchado, semi-delgadas secciones de nervio ciático triturado. A. Un ejemplo de un sitio aplastamiento in situ (extremidad posterior izquierda). El carbono negro indica el sitio de aplastamiento. El asterisco marca una rama del nervio tibial que inerva musculatura del muslo y sirve como un punto de referencia útil durante la cirugía por aplastamiento. La división tibial del nervio ciático se describe en el azul, el peroneo en verde, y el sural en amarillo. B. Semi-secciones delgadas demostrando un aplastamiento completo realizado por la fuerza hemostáticaps. C. Semi-secciones delgadas que muestran un aplastamiento incompleta realizó con fórceps angulados. En ambas imágenes degeneración perfiles de mielina están marcados con flechas. En el panel de flechas C marcar ejemplos de perfiles de la mielina en conserva y un conjunto de axones a salvo. Barra de escala es de 10 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig3.jpg" /> Figura 3 esquemática muscular en todo el montaje y NMJs representativas. AC:. Las imágenes renderizadas de EDL (A), del peroneo lateral largo (B) y sóleo (C) los músculos después de la eliminación de las extremidades posteriores. Los músculos se muestran son de la extremidad posterior derecha. Rodilla y orientación anatómica del tobillo también se incluyen como referencia. Los tendones son de color blanco y se describe en una línea de color negro sólido cuando se lo coloca en la parte superior del músculo. Ellos se resumen en una línea discontinua negro cuando se extienden por debajo del músculo. Los cortes se muestran en líneas discontinuas de color rojo.El músculo se despega de sitios de corte, como se indica por las flechas azules, y se diluyó posteriormente. Después de adelgazamiento, el músculo se separa de los pines, cortando todo lo que queda de los tendones anclados DF:. Las imágenes renderizadas de los músculos de montaje entero tras la eliminación del tejido conectivo y posterior adelgazamiento. Las bandas de placa terminal se exponen en cada músculo de GH:. El músculo sóleo de montaje toda catorce días después de aplastar el nervio ciático que demuestra de nuevo inervados (G) y denervado (H), las uniones neuromusculares. En estos paneles, NMJs, axones y células de Schwann son visualizados como se describió anteriormente en la sección 5.5.1. Los receptores de acetilcolina son de color rojo, verde axones y células de Schwann procesa azul. En el panel G, las flechas indican las zonas de la NMJ que han sido re-inervados por un axón. En el panel de puntas de flecha indican H GAP-43 procesos positivos de células de Schwann. Nótese la ausencia de los axones. Barra de escala es de 10 micras.

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Neurol. 207, 64-74 (2007).</li><li>Amado, S., Sim&#241;es, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Lu&#237;s, A. L., Shirosaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hybrid+chitosan+membranes+and+N1E-115+cells+for+promoting+nerve+regeneration+in+an+axonotmesis+rat+model.">Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model.</a> Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Sim&#240;es, M. 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No tenemos nada que revelar.

Hemos presentado un método para obtener un flechazo nervio ciático fiable completa con identificación exacta del sitio de aplastamiento. Como se mencionó anteriormente, aplastamiento del nervio ciático es un modelo común de lesión del nervio periférico en ratones y ratas. Aunque cada método de aplastamiento tiene sus ventajas y desventajas, nos pareció que este método produce un flechazo total que se marcó con facilidad con un mínimo de equipos especiales (por ejemplo, unas pinzas especiales, etc.) <p c...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Clipper Mini 0000 con el N º hoja </td><td> Roboz </td><td> RC-5903 </td></tr><tr><td> Nair depilación (9 oz.) </td><td> Iglesia y Dwight Co., Inc. </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Betadine lavado quirúrgico (1 galón) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19066452 </td></tr><tr><td> Ungüento oftálmico (1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19082795 </td></tr></tbody></table> Herramientas quirúrgicas: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> FST 250 Hot cordón esterilizador </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 18000-45 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Iris Tijeras (11 cm de largo) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500216 </td></tr><tr><td> Potts-Smith Pinzas (recta, 18 cm; 1x2 dientes) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11024-18 </td></tr><tr><td> McPherson Vannas Tijeras (5 cuchillas mm) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14124-G </td></tr><tr><td> Dumont # 5 Pinzas-Dumoxel Standard Tip </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11252-30 </td></tr><tr><td> Dumont º 5/45 Pinzas-Dumoxel Standard Tip </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-35 </td></tr><tr><td> Ultra Hemostats Bellas (recto; superficies lisas en su interior) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 13020-12 </td></tr><tr><td> Carbón activado en polvo (500 g) </td><td> Fisher Scientific </td><td> C272-500 </td></tr><tr><td> Tamaño 6-0 Suturas con aguja C-1 (Silk estéril, Negro, trenzado,No absorbible, 18 &quot;de longitud, caja de 36) </td><td> Roboz </td><td> SUT-1073-1011 </td></tr><tr><td> Reflejo de aplicador de clips (de 9 mm clips) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500345 </td></tr><tr><td> 9 mm de acero inoxidable Reflex Clips (caja de 100) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 500346 </td></tr></tbody></table> Cuidado de Animales: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De sodio al 0,9% de cloruro de inyección (sin conservantes; 20 ml) </td><td> Hospira </td><td> 0409-4888-20 </td></tr><tr><td> Sistema completo Manta homeotérmicos con sonda flexible (mediana, 115 VAC, 60 Hz) </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 507222F </td></tr></tbody></table> Platfor quirúrgicam, y retractores: (Comprada en la tienda local de hardware) <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción /) </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Plataforma de acero inoxidable (molido; ~ 12 &quot;x12&quot; x1 / 8 &quot;) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Botón de imanes (Ejemplo: Eclipse E825) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pernos de acero inoxidable (3 &quot;de largo, diámetro determinado por el imán de botón) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Tuercas de acero inoxidable (tamaño para adaptarse a los pernos) </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Las bandas de goma (tensión de Luz) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pasadores de insectos (ambos extremos doblados para formar ganchos) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Semi-Thins: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor &lt;/ Strong&gt; </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El paraformaldehído (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1kg </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio dibásico anhidro (500 g, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico anhidro (1 kg, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> Glutaraldehído (50%; 10 x 10 ml) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18431 </td></tr><tr><td> Tetróxido de osmio (4% acuoso, 10 x 10 ml) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18465 </td></tr><tr><td> Óxido de propileno (450 ml) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18601 </td></tr><tr><td> Insertar 812 (Kit, para los bloques de disco duro o alto contraste de imagen) </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> Toluidine Azul (25 g) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 19451 </td></tr></tbody></table> Todo el montaje en la preparación muscular y de inmunohistoquímica: <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre (descripción / cantidad) </td><td> Proveedor </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> El paraformaldehído (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1kg </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio dibásico anhidro (500 g, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Fosfato de sodio monobásico anhidro (1 kg, que se utiliza para preparar tampón fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> 10% de diluyente de BSA / solución de bloqueo (200 ml) </td><td> Kirkegaard &amp; Perry Laboratories, Inc. </td><td> 50-61-00 </td></tr><tr><td> Triton X-100 (100 ml) </td&gt; <td> Punto Científico Incorporated </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> La glicina, 98% (1 kg) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12007-0010 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryo-octubre Compuesto (Caja de 12, 4 botellas de oz) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-373-65 </td></tr><tr><td> Sylgard DOW 170 (2 Kit de libras) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9492579 </td></tr><tr><td> Pasadores de acero inoxidable de insectos, tamaño 1 (100/caja) </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 26001-40 </td></tr><tr><td> Tetrametilrodamina-A-bungarotoxina (0,5 mg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0195-.5MG </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal de ratón contra el SMI-312 (0,1 ml) </td><td> Covance </td><td> SMI-312R </td></tr><tr><td> Anticuerpo monoclonal de ratón contra SV2 (0,1 ml) </td><td> Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma (DSHB) </td><td> SV2 </td></tr><tr><td> Conejo Polyanticuerpo monoclonal contra el GAP-43 </td><td> Novus Productos Biológicos </td><td> NB300-143 </td></tr><tr><td> Fluoresceína conjugado de cabra anti-IgG de ratón, Fc gamma Subclase una específica </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=115-095-205&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">11 5-095-205</a> </td></tr><tr><td> DyLight 649 burro conjugado anti-IgG de conejo </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=711-495-152&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">711-495-152</a> </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diamino-2-fenilindol (DAPI, dilactato; 10 mg) </td><td> Invitrogen </td><td> D3571 </td&gt; </tr><tr><td> Medio de montaje Vectashield (10 ml) </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td></tr><tr><td> Superfrost Plus preparaciones para microscopio (Blanco, Tamaño: 75 x 25 mm, paquete de 144) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Fisherfinest gafas Premium Cover (Tamaño: 40 x 22 mm; Paquete de 1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5C </td></tr></tbody></table>

reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis

La regeneración en el sistema nervioso periférico (SNP) está ampliamente estudiada tanto por su relevancia para las enfermedades humanas y entender la respuesta contundente de regeneración montada por las neuronas del SNP por lo tanto, posiblemente, iluminando los fracasos de la regeneración del SNC 1. Aplastamiento del nervio ciático (axonotmesis) es uno de los modelos más comunes de lesión del nervio periférico en roedores 2. Triturado interrumpe todos los axones pero láminas de Schwann de células basales se conservan por lo que la regeneración es óptimo 3,4. Esto permite que el investigador para estudiar precisamente la capacidad de un axón en crecimiento para interactuar tanto con la célula de Schwann y láminas basales 4. Las ratas han sido por lo general los modelos animales preferidos para el aplastamiento del nervio experimental. Están ampliamente disponibles y su nervio ciático lesionado proporciona una aproximación razonable de las lesiones nerviosas humanas 5,4. Aunque de menor tamaño que los nervios de rata, el nervio del ratón tiene muchas cualidades similares. Pero lo más importante, los Memorandos de Entendimientomodelos e son cada vez más valiosa, debido a la amplia disponibilidad de líneas transgénicas ahora permite una disección detallada de las moléculas individuales fundamentales para la regeneración del nervio 6, 7. Antes los investigadores han utilizado varios métodos para producir un aplastamiento del nervio o lesión incluyendo simples pinzas de ángulo, pinzas frías, pinzas hemostáticas, pinzas vasculares, y las abrazaderas diseñadas por el investigador 8,9,10,11,12. Los investigadores también han utilizado diversos métodos para marcar el sitio de la lesión incluyendo la sutura, las partículas de carbono y perlas fluorescentes 13,14,1. Se describe nuestro método para obtener un flechazo nervio ciático reproducible completa con información precisa y persistente marcaje de la aglomeración de sitio, con una pinza hemostática y finas de carbono posteriores al aplastamiento marcar el sitio. Como parte de nuestra descripción del procedimiento del nervio ciático aplastar también hemos incluido un método relativamente simple de montar todo el músculo que utilizamos para cuantificar posteriormente la regeneración.

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Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

En este informe se describe un método para aplastar el nervio ciático del ratón. Este método usa unas pinzas hemostáticas fácilmente disponibles y fácilmente reproducible y produce aplastamiento completo del nervio ciático. Además, se describe un método para preparar soportes de músculo entero adecuadas para el análisis de la regeneración del nervio después de aplastamiento del nervio ciático.

Ratón reproducible aplastamiento del nervio ciático y posterior evaluación de la regeneración mediante el análisis de músculo entero Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

reproducible-mouse-sciatic-nerve-crush-subsequent-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.4K vistas.  Temple University. En este informe se describe un método para aplastar el nervio ciático del ratón. Este método usa unas pinzas hemostáticas fácilmente disponibles y fácilmente reproducible y produce aplastamiento completo del nervio ciático. Además, se describe un método para preparar soportes de músculo entero adecuadas para el análisis de la regeneración del nervio después de aplastamiento del nervio ciático.

Video: Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

Axoplasma de aislamiento de nervio ciático de rata

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Investigación

Neurociencias

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Preparación Todo el montaje del Adulto Drosophila Cordón nervioso ventral para inyección gigante tinte de fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Todo el montaje de imágenes de embriones de ratón Proyecciones sensorial Axon

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Todo el montaje La disección y de inmunofluorescencia del Adulto ratón cóclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

En Vivo Transferencia de genes a células de Schwann en el nervio ciático de roedores mediante electroporación

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Tinción, visualización y análisis de papilas gustativas fungiformes, circunvaladas y del paladar

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In addition, in the research field of movement disorders, sciatic crush injury has been employed to trigger a dystonia-like phenotype in genetically predisposed DYT-TOR1A rodent models of dystonia. To achieve consistent, reproducible and comparable results after a sciatic nerve crush injury, a standardized method for inducing the nerve crush is essential, in addition to a standardized phenotypical characterization. Attention must be paid not only to the specific assortment of behavioral tests, but also to the technical requirements, the correct execution and consecutive data analysis. This protocol describes in detail how to perform a sciatic nerve crush injury and provides a behavioral test battery for the assessment of motor deficits in rats that includes the open field test, the CatWalk XT gait analysis, the beam walking task, and the ladder rung walking task.

We provide a protocol for the assessment of motor behavior via a behavioral test battery in rats after sciatic nerve crush injury.

Evaluación Multifactorial Del Comportamiento Motor En Ratas Después De La Lesión Unilateral Por Aplastamiento Del Nervio Ciático

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high morphological and functional plasticity. In numerous nervous system disorders, NMJ is an early pathological target resulting in neurotransmission failure, weakness, atrophy, and even in muscle fiber death. Due to its relevance, the possibility to quantitatively assess certain aspects of the relationship between NMJ components can help to understand the processes associated with its assembly/disassembly. The first obstacle when working with muscles is to gain the technical expertise to quickly identify and dissect without damaging their fibers. The second challenge is to utilize high-quality detection methods to obtain NMJ images that can be used to perform quantitative analysis. This article presents a step-by-step protocol for dissecting extensor digitorum longus and soleus muscles from rats. It also explains the use of immunofluorescence to visualize pre and postsynaptic elements of whole-mount NMJs. Results obtained demonstrate that this technique can be used to establish the microscopic anatomy of the synapsis and identify subtle changes in the status of some of its components under physiological or pathological conditions.

The ability to accurately detect neuromuscular junction components is crucial in evaluating modifications in its architecture because of pathological or developmental processes. Here we present a complete description of a straightforward method to obtain high-quality images of whole-mount neuromuscular junctions that can be used to perform quantitative measurements.

Disección De Fibras Musculares Esqueléticas Individuales Para Análisis Inmunofluorescentes Y Morfométricos De Las Uniones Neuromusculares De Montaje Completo

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized point of contact between the motor nerve and the skeletal muscle. This peripheral synapse exhibits high ...