Queremos agradecer especialmente a Monique Nenniger Tosato por su excelente apoyo técnico, así como Chatton Jean-Yves de su asesoramiento científico y la plataforma de imagen CIF de la UNIL para el equipo de microscopio. El financiamiento fue proporcionado por la Fundación Nacional Suiza de Ciencia.

1. La disección de la VNO ratón <ol><li> Use los ratones adultos. Como la detección de feromonas está implicado en multimodalidades, cuidadosa distinción entre las cepas, los genotipos, sexos y edades es importante e influirá en los resultados. Aquí, elegimos ratones adultos VG 30 anteriormente utilizados para la identificación de un par de feromona-receptor (2-heptanona V1rb2) 31 (Fig. 1A). </li><li> Antes de comenzar la disección, preparar dulce frío artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF, NaCl 118 mM, NaHCO3 25 mM, D-glucosa 10 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 2 mM, NaH 2 PO 4 1,2 mM, CaCl2 2 mM, pH 7,4), saturado de oxycarbon (95% O 2, 5% CO 2). Para ello, mezclar todos los componentes excepto ACSF CaCl2. Saturar la solución directamente con burbujas oxycarbon. Al final, añadir el CaCl2 y ajustar con ddH 2 0 hasta el volumen deseado. Mantenga la solución ACSF en hielo hasta use. </li><li> La eutanasia del ratón debe ser preferentemente realizada por dislocación cervical o por inhalación de CO 2 antes del experimento. </li><li> Cortar la cabeza del ratón. Colócalo debajo de un microscopio de disección en frío ACSF continuamente oxycarbonated. </li><li> Cortar la mandíbula inferior y la posición de la cabeza con el fin de visualizar el paladar (Fig. 1B). </li><li> Hacer una incisión horizontal en la parte superior del paladar (Fig. 1B) con unas tijeras micro y quitar la membrana paladar con micro pinza de disección. Hidratar y limpiar la cavidad expuesta con ACSF (Fig. 1C). </li><li> Cortar la parte superior y la parte inferior del tabique nasal (Fig. 1C). Delicadamente extraer el tabique nasal que contiene el VNO y colocarlo directamente en ACSF en el hielo (Fig. 1D). </li><li> Separados verticalmente las dos partes del VNO utilizando micro pinza de disección y delicadamente quite la cápsula cartilaginosa del VNO (Fig. 1E). Asegúrese de que todas las piezas cartilaginosas se retiran. </li></ol> 2. Tejido VNO rebanada preparación El tejido VNO rebanada preparación se describe en esta sección 2) se debe principalmente a las investigaciones de imágenes de calcio. Rodajas de VNO también puede ser utilizado para immunohistostainings en rodajas flotando para comprobar la integridad estructural de los tejidos (ver sección 3) del Protocolo). <ol><li> Prepare bajo punto de fusión de agar (3% en PBS estándar) y su lugar de trabajo. Usted tendrá que ACSF, un microtomo y soportes, micro pinza de disección, la incorporación de los moldes (22 x 22 x 20 mm), toallitas de precisión, cepillos, placas de cultivo tisular, cyanacrylat cola, hielo y un termómetro. </li><li> Rellene el molde con la incorporación de bajo punto de fusión de agar al 3%. Asegúrese de que la temperatura no sea superior a 41 ° C antes de colocar verticalmente el poco borrado VNO (Fig. 2A) para poder obtener cortes coronales. </li><li> Coloque el molde de la incrustación en el hielodurante 1 minuto hasta que la solidificación y luego separado del bloque de agar. Cortar el bloque de agar en una forma piramidal y el lugar con pegamento con el apoyo del microtomo (Fig. 2B). </li><li> Corte coronal rebanadas VNO con el micrótomo, con una velocidad de 0,5 mm / s, con una amplitud de 0,7 mm y un espesor de 100 micras en frío ACSF y recoger los cortes de tejido con un cepillo antes de colocarlos en una placa de cultivo de tejidos llenos de frío ACSF. </li><li> Si su rebanadas contienen fluorescencia endógena como GFP (en genes específicos neuronas), puede seleccionar en un microscopio estereoscópico de fluorescencia (Fig. 2C). </li></ol> 3. Inmunohistoquímica en cortes VNO flotante El objetivo de este procedimiento es verificar la integridad de las secciones de tejidos VNO obtenido en el apartado 2). -Tubulina acetilada es un marcador de microtúbulos / citoesqueleto se expresa en las dendritas de las neuronas y microvellosidades VNO sensorial. Para los experimentos de imagen de calcio, vaya direcciónTLY a la sección 4) del Protocolo. El método de flotación immunohistostaining rebanadas VNO puede ser adaptado a la evaluación de la expresión de la proteína de interés. Para ello, le recomendamos que fijar el VNO durante 1 hora a 4 ° C en una solución fijadora (paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,6) después de que el punto 1.7) del Protocolo y el uso de este punto en PBS pH 7,6 en lugar de ACSF solución. <ol><li> En la placa de cultivo de tejidos, arreglar sus tajadas de interés en una solución fijadora (paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,6) 1h a 4 ° C. </li><li> Bloquear su cortes de tejido durante la noche a 4 ° C en una solución de PBS que contiene NGS (suero de cabra normal) 10% y Triton X-100 al 0,5%. </li><li> Incubar las rebanadas con el anticuerpo primario (anti-tubulina acetilada, ratón, 1:2000) de 16h a temperatura ambiente (TA) en una solución de PBS que contiene NGS 5% y Triton X-100 en el 0,25%. </li><li> Lavar 3 veces durante 5 minutos con una solución de PBS que contenía 2% de NGS. </li><li> Incubar en la oscuridad con el secoanticuerpos Ndary (Cy5-conjugado de cabra anti-ratón, 1:200) en una solución de PBS que contenía 2% de NGS 1h a temperatura ambiente. </li><li> Lavar 3 veces durante 5 minutos con PBS que contenía 2% de NGS, NGS PBS 1% y PBS. </li><li> Monte su rebanadas en un medio fluorescente de montaje (que contienen o no DAPI), colocándolos en el centro de las zonas delimitadas hidrofóbica (usar un lápiz hidrofóbico) y cubrir los cortes con cubreobjetos. </li><li> Hacer observaciones y adquisiciones con microscopía confocal y un software que permite reconstrucciones en 3D (Fig. 2D-F). </li></ol> 4. El calcio de imágenes en rodajas VNO <ol><li> Los siguientes procedimientos se llevarán a cabo en la oscuridad. Incubar VNO rodajas de 1 hora a 37 ° C en una solución de carga compuesto por frío ACSF con Fura-2AM (7 M; solución madre de 1 mM en DMSO) y 0,1% Pluronic (w / v; solución madre al 20% en ddH 2 O). </li><li> Mantenga los segmentos cargados en el hielo con oxycarbonation hasta su uso. Rodajas de carga se puede mantener durante3-4h. </li><li> Colocar las rebanadas de carga con un pincel en una cámara de perfusión que contiene ACSF y mantener las rebanadas con un ancla de lámina de tejido (Fig. 3). </li><li> Coloque la cámara de perfusión sobre la platina de un microscopio de imagen de calcio (Fig. 3B) y continua con perfusión oxycarbonated ACSF a temperatura ambiente. La temperatura puede ser adaptada con el uso de un controlador de temperatura bipolar. </li><li> Observaciones de la carga rebanadas VNO (Fig. 3C-E) se llevan a cabo con un microscopio de fluorescencia invertido, con un objetivo de 25x o 63x y una cámara de frío SNAP-HQ. La iluminación se realiza de forma secuencial (340/380 nm) con un instrumento policromador y grabarla a una frecuencia de 5 Hz. Emisión de filtrado se realiza a 510 nm. Intracelular de calcio cambios de relación (Df = 340 nm/380 nm) son controlados con un software apropiado. </li><li> Chemostimulation deben ser seleccionados de acuerdo a sus fines experimentales. En este caso, la perfusión de ACSF que contiene una feromona mix (ISOBUTILAMINA, 2-heptanona, 4-heptanona, 2 heptanol, pentylacetate, dimetilpirazina, α / β-farneseno, 10 -6 M), 2-heptanona (10 -6 M) o recién extraído hombres y mujeres (1: 1) la orina del ratón (1:100) se llevan a cabo 32. La perfusión de ATP (125 M) se utiliza como una prueba de viabilidad en el final de los experimentos (Fig. 3F) y deben indicar una proporción de aproximadamente el 80% neuronas viables. En estas condiciones, las rebanadas se pueden utilizar hasta 2 horas. </li><li> Subpoblaciones GFP-etiquetado de las neuronas sensoriales son visualizados por la iluminación específica (en este caso las neuronas que expresan V1rb2) y se puede analizar con precisión (Fig. 3G-I). </li></ol> 5. Los resultados representativos: Para establecer un ensayo funcional para investigar la transducción de múltiples vías que tienen lugar en el OVN ratón, o para identificar nuevos receptores de feromonas-pares, nos aprovechamos de la línea de VG ratón (Fig. 1A </strong&gt;). En esta línea, uno de cada 240 receptores de V1Rs, el receptor es V1Rb2 GFP-etiquetado que permite la fácil visualización de una subpoblación particular de vomeronasal las neuronas sensoriales. Después de la extracción y disección del VNO (Fig. 1E), nos preparamos agudas rodajas de VNO (Fig. 2C). Fijamos una fracción de ellos, con el fin de comprobar y validar la integridad tisular de la preparación mediante la realización de immunohistostainings contra la proteína tubulina acetilada-(Fig. 2D-F). La otra fracción de los cortes es utilizado para los experimentos de imagen de calcio. Para ello, los segmentos están cargados con Fura-2AM (Fig. 3C-E) y el nivel de calcio intracelular de cada neurona se controla como una relación de Df (Fig. 3F). La viabilidad de las neuronas es evaluada por la perfusión de la ATP (125 M), tras lo cual aumento rápido y transitorio de la relación de Df se espera (Fig. 3F). La orina es una importante fuente de feromonas, la perfusión de agua dulcemente recogido la orina del ratón (1:100) se utilizó como control endógeno. Se dispara transitorios de calcio en aproximadamente el 50% de las neuronas registradas (casilla 1 y 2, fig. 3F). En virtud de las buenas prácticas agrarias iluminación, V1Rb2 neuronas positivas son observables, y la perfusión de su ligando conocido feromonal, 2-heptanona, inicia la activación celular (la celda 1, fig. 3I). Curiosamente, las activaciones neuronales se observa también en una fracción de las neuronas que no expresan el receptor de V1Rb2 (neuronas GFP negativas) (la celda 2, fig. 3I), lo que demuestra la complejidad de la codificación de feromonas en el OVN. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig1.jpg" /> Figura 1. Disección del órgano vomeronasal del ratón. (A) Un ratón en la línea de VG. (B) Después de la eutanasia con el ratón, la cabeza llena se coloca bajo un microscopio binocular y la mandíbula inferior se retira con el fin de visualizar el paladar. Una pequeña incisión horizontal se hace(Línea discontinua negro). (C) Después de la extirpación del paladar, el tabique nasal alineadas con el VNO se corta en la parte superior y la parte inferior (líneas discontinuas blancas) para facilitar la extracción VNO. (D) El VNO se coloca en una solución de ACSF y separados (insertar: mayor poder ver de las dos partes). (E) La cápsula cartilaginosa del VNO es delicadamente retirado, y el OVN, sin su cápsula cartilaginosa se utiliza para el resto de los experimentos. Las barras de escala son los siguientes: BE, 1 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig2.jpg" /> Figura 2. Vomeronasal del ratón rebanada preparación aguda y la integridad tisular. (A) El VNO ratón verticalmente integrados en una solución de agar al 3%. La temperatura del agar debe ser inferior a 41 ° C. (B) El bloque de agar se corta en forma piramidal y 100 micras secciones VNO (línea discontinua negro) se generan en ACSF. (C) rebanadas VNO puede ser seleccionado en un microscopio estereoscópico fluorescente para visualizar un determinadopoblación de etiquetado neuronas sensoriales. (DF) la integridad tisular puede ser evaluada por immunohistostainings contra la proteína tubulina acetilada-, a fin de poder más alto de la V1rb2 de genes diana, las neuronas muestran la perfecta conservación de la preparación. Las neuronas con sus dendritas largo alcance la superficie de la luz (E), así como la expresión de la proteína estructural en los mandos dendríticas y microvellosidades se puede observar (F). Las barras de escala son: B, 5 mm; C, 60 micras; D, 40 m; EF, de 20 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3311/3311fig3.jpg" /> Figura 3. Calcio de imágenes y detección de las feromonas en vomeronasal cortes de tejido aguda. (A) Después de un Fura-2AM fase de carga, las rebanadas de VNO se colocan en una cámara de perfusión y se mantienen con un ancla adaptado (ver alta potencia). (B) Los experimentos se realizan en los cortes oscuros y VNO están continuamente perfundidos con ACSF a temperatura ambiente con un sistema de vacío. La temperatura se puede chosen el uso de un sistema regulador de temperatura compuesto por un elemento bipolar Pelletier y una sonda térmica. Este experimento se llevó a cabo a temperatura ambiente. (CE) rodajas de VNO se pueden observar en contraste de fase Hoffman (C, Hv) o Fura 380 nm antes de la iluminación (D) y durante la activación neuronal (E, aquí con el ATP). (F) la viabilidad neuronal se evalúa con la perfusión de la ATP (125 M). Aquí, chemostimulation se hace con la orina (orina, 1:100) o con una mezcla de las feromonas del ratón (pH de la mezcla., 10 -6 M) con un caudal constante de 165 ml / h. Los niveles intracelulares de calcio (Df) se pueden grabar de forma individual para cada celda (celda 1 a 3). (G) Una neurona V1Rb2 se visualiza en las buenas prácticas agrarias de iluminación (1). (H) La carga de esta neurona (1), así como una neurona no V1rb2 expresar (2) se muestra. (I) La neurona V1rb2 es capaz de responder a la 2-heptanona con un aumento del calcio intracelular. Este particular no V1rb2 neuronas que expresan también responde a la 2-heptanona (casilla 2). Las barras de escala son: CE, 20 m; GH,15 micras, Df = 340 nm / 380 nm. (F e I) Duración de la aplicación de estímulo se indica mediante las barras en cada trazo. La escala de color arbitraria representa la intensidad de la fluorescencia.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grueneberg+ganglion+cells+mediate+alarm+pheromone+detection+in+mice.">Grueneberg ganglion cells mediate alarm pheromone detection in mice.</a> Science. 321, 1092-1095 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El método de imágenes de calcio que aquí se presenta permite grabar, en una rebanada preparación aguda, la respuesta feromonal del ratón neuronas del OVN. Con este enfoque, la disección del animal a las neuronas vomeronasal es decir, con un poco de práctica, fácil de lograr y proporciona una preparación de tejidos de larga vida. Permite tiempo experimentos como las investigaciones farmacológicas o el estudio de la codificación de feromonas. Con esta técnica fisiológica, las grandes poblaciones, así como precisa subpoblaciones neuronales pueden ser analizados en particular. Además, este método puede ser fácilmente adaptada a los planteamientos de inmunohistoquímica o experimentos basados ​​en colorantes calcio. El uso de estas metodologías combinadas seguramente permitirá la identificación de nuevos ligandos feromonal de los quimiorreceptores huérfano muchos expresaron en el órgano vomeronasal del ratón.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Adenosina-5&#39;-trifosfato disódico solución salina (ATP) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A6559-25UMO </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7002-100G </td><td> Preferentemente para inmunohistoquímica </td></tr><tr><td> Agar (bajo punto de fusión) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A0701-25G </td><td> Preferencial en el caso de imágenes de calcio </td></tr><tr><td> CL-100 Bipolar controlador de temperatura </td><td> Warner Instrumentos </td><td> W64-0352 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Confocal </td><td> Leica Microsystems </td><td> SP5 AOBS </td><td></td></tr><tr><td> Cy5-AffiniPure cabra anti-ratón IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 115-175-071 </td><td> Protegerlo de la luz </td></tr><tr><td> DMSO (dimetilsulfóxido) </td><td> Merck </td><td> 317275-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Incorporación de los moldes, Peel-A-Way </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td> 22 x 22 x 20 mm </td></tr><tr><td> Fluorescentes medios de montaje (Vectashield con DAPI, 10 ml) </td><td> Rectolab </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> FURA-2AM </td><td> Teflabs </td><td> 0103 </td><td> Protegerlo de la luz </td></tr><tr><td> Glisseal N (grasa de vacío, 60 g) </td><td> Barrenador Chemie </td><td> Glisseal N </td><td></td></tr><tr><td> Baño grande cámara de registro (RC-26G) </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0235 </td><td></td></tr><tr><td> MetaFluor (software de imágenes de calcio; v.7.6.5.0) </td><td> Visitron Sistemas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Monoclonal anti-tubulina, acetylated anticuerpos de ratón </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6793-.2ML </td><td></td></tr><tr><td> Normales de suero de cabra (NGS, 10 ml) </td><td> Interchim </td><td> UP379030 </td><td></td></tr><tr><td> Plataforma de cámaras (P-1) </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0277 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127, 2 g </td><td> Invitrogen </td><td> P-6867 </td><td></td></tr><tr><td> Roti Coll (botella de dosificación, 10 g) </td><td> Carl Roth </td><td> 0258.1 </td><td></td></tr><tr><td> SC-20 Dual In-line calentador de solución / Cooler </td><td> Warner Instrumentos </td><td> W64-0353 </td><td></td></tr><tr><td> Rebanada de anclaje (SHD-26GKIT) </td><td> Warner Instrumentos </td><td> 64-0266 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio Stereofluorescence </td><td> Leica Microsystems </td><td> MZ16FA </td><td></td></tr><tr><td> Super Pen PAP (hidrofóbicospluma) </td><td> Pelco Internacional </td><td> 22309 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Fluka </td><td> 93420-250ML </td><td></td></tr><tr><td> Vibrante hoja microtomo VT 1200S </td><td> Leica Microsystems </td><td> 14048142066 </td><td></td></tr><tr><td> VisiChrome de alta velocidad del sistema policromador </td><td> Visitron Sistemas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3D Visualización de Datos (Imaris; v.6.3.1) </td><td> Bitplane Scientific Software </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging pheromone sensing in a mouse vomeronasal acute tissue slice preparation

Peter Karlson y Martin Lüscher utiliza el término feromona, por primera vez en 1959 para describir una de las sustancias químicas utilizadas dentro de una especie de comunicación. Las feromonas son volátiles o no-de corta duración moléculas secretadas 2 y / o contenidos en los fluidos biológicos 3,4, como la orina, un líquido conocido por ser la principal fuente de feromonas 3. La comunicación feromonal está implicado en una variedad de modalidades de animales clave, tales como las interacciones familiares 5,6, las organizaciones jerárquicas 3 y 7,8 interacciones sexuales y, en consecuencia, directamente relacionada con la supervivencia de una especie dada 9,10,11. En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (VNO) 10,12, una estructura de pares situados en la base de la cavidad nasal, y encerrado en una cápsula cartilaginosa. Cada OVN tiene una forma tubular con una luz 13,14 permitiendo el contacto con el exteriormundo de la química. El neuroepitelio sensorial se compone principalmente de vomeronasal neuronas sensoriales bipolares (VSNs) 15. Cada VSN se extiende una dendrita única a la luz que termina en una perilla dendríticas que soportan hasta 100 microvellosidades implicados en la detección de productos químicos 16. Subpoblaciones de numerosos VSNs están presentes. Se diferencian por el quimiorreceptores expresan y por lo tanto, posiblemente, por el ligando (s) que reconocen 17,18. Dos familias principales de los receptores vomeronasal, V1Rs y V2Rs 19,20,21,22, están compuestos respectivamente por 240 y 23 120 24 miembros y se expresan en diferentes capas de la neuroepithelium. Los receptores olfativos (OR) 25 y los receptores de formil péptidos (FPRs) 26,27 se expresan también en VSNs. Si estas subpoblaciones neuronales utilizan la misma vía de señalización corriente abajo de las feromonas de detección es desconocida. A pesar de una importante función desempeñada por un canal de calcio-permeable (TRPC2) presentes en las microvellosidades de las neuronas maduras TRPC2 28 canales de transducción independientes han sugerido 6,29. Debido al elevado número de subpoblaciones neuronales y la peculiar morfología de los órganos, las investigaciones farmacológicas y fisiológicas de los elementos de señalización presente en el VNO son complejas. A continuación, presentamos una preparación de tejido rebanada aguda del VNO ratón para realizar las investigaciones de calcio de imágenes. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas, en el medio natural de un tejido vivo, de las subpoblaciones de carácter general o individual de VSNs previamente cargadas con Fura-2 am, un colorante de calcio. Este método es también conveniente para el estudio de los receptores de GFP-etiquetados de feromonas y se adapta para el uso de otras sondas fluorescentes de calcio. A modo de ejemplo, se utiliza aquí un VG ratón la línea 30, en la que está vinculada la traducción de los receptores de feromonas V1rb2 a la expresión de GFP de una estrategia de polycistronic. </p&gt;

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Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (OVN). Aquí, una rebanada de preparación de tejidos aguda de VNO para la realización de imágenes de calcio se describe. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas de las subpoblaciones y / o las neuronas individuales en un tejido vivo y es conveniente para la identificación del receptor-ligando.

Imágenes de detección de feromonas en una preparación de ratón Vomeronasal aguda lámina de tejido

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

imaging-pheromone-sensing-mouse-vomeronasal-acute-tissue-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.1K vistas.  University of Lausanne. En ratones, la capacidad de detectar las feromonas está mediado por el órgano vomeronasal (OVN). Aquí, una rebanada de preparación de tejidos aguda de VNO para la realización de imágenes de calcio se describe. Este enfoque permite a las observaciones fisiológicas de las subpoblaciones y / o las neuronas individuales en un tejido vivo y es conveniente para la identificación del receptor-ligando.

Video: Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Multielectrode Array Recordings of the Vomeronasal Epithelium

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is planar multielectrode array (MEA) recording. Here we document the use of MEAs to study the mouse vomeronasal organ (VNO), which plays an essential role in the detection of pheromones and social cues via a diverse population of sensory neurons expressing hundreds of types of receptors. Combining MEA recording with a robotic liquid handler to deliver chemical stimuli, the sensory responses of a large and diverse population of neurons can be recorded. The preparation allows us to remove the intact neuroepithelium of the VNO from the mouse and stimulate with a battery of chemicals or potential ligands while monitoring the electrical activity of the neurons for several hours. Therefore, this technique serves as a useful method for assessing ligand activity as well as exploring the properties of receptor neurons. We present the techniques needed to prepare the vomeronasal epithelium, MEA recording, and chemical stimulation.

Multielectrode array (MEA) recordings provide a method for studying the electrical activity of large populations of neurons. Here, we present the details of a MEA preparation to record from the mouse vomeronasal epithelium while simultaneously stimulating the tissue.

Grabaciones multielectrodo matriz del epitelio vomeronasal

Understanding neural circuits requires methods to record from many neurons simultaneously. For in vitro studies, one currently available technology is ...

Investigación

Neurociencias

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Imagen crónica de la corteza visual del ratón usando una preparación de Diluido-cráneo

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the anterior hypothalamus. The clock is directly synchronized by light via the retina and optic nerve. Circadian oscillations are generated by interacting negative feedback loops of a number of so called "clock genes" and their protein products, including the Period (Per) genes. The core clock is also dependent on membrane depolarization, calcium and cAMP 1. The SCN shows daily oscillations in clock gene expression, metabolic activity and spontaneous electrical activity. Remarkably, this endogenous cyclic activity persists in adult tissue slices of the SCN 2-4. In this way, the biological clock can easily be studied in vitro, allowing molecular, electrophysiological and metabolic investigations of the pacemaker function.
The SCN is a small, well-defined bilateral structure located right above the optic chiasm 5. In the rat it contains ~8.000 neurons in each nucleus and has dimensions of approximately 947 &mu;m (length, rostrocaudal axis) x 424 &mu;m (width) x 390 &mu;m (height) 6. To dissect out the SCN it is necessary to cut a brain slice at the specific level of the brain where the SCN can be identified. Here, we describe the dissecting and slicing procedure of the SCN, which is similar for mouse and rat brains. Further, we show how to culture the dissected tissue organotypically on a membrane 7, a technique developed for SCN tissue culture by Yamazaki et al. 8. Finally, we demonstrate how transgenic tissue can be used for measuring expression of clock genes/proteins using dynamic luciferase reporter technology, a method that originally was used for circadian measurements by Geusz et al. 9. We here use SCN tissues from the transgenic knock-in PERIOD2::LUCIFERASE mice produced by Yoo et al. 10. The mice contain a fusion protein of PERIOD (PER) 2 and the firefly enzyme LUCIFERASE. When PER2 is translated in the presence of the substrate for luciferase, i.e. luciferin, the PER2 expression can be monitored as bioluminescence when luciferase catalyzes the oxidation of luciferin. The number of emitted photons positively correlates to the amount of produced PER2 protein, and the bioluminescence rhythms match the PER2 protein rhythm in vivo 10. In this way the cyclic variation in PER2 expression can be continuously monitored real time during many days. The protocol we follow for tissue culturing and real-time bioluminescence recording has been thoroughly described by Yamazaki and Takahashi 11.

The procedure of preparing slices containing the adult mouse hypothalamic suprachiasmatic nucleus (SCN), and a rapid way to culture the SCN tissue in organotypic culture condition, are reported. Further, the measurement of oscillatory clock gene protein expression using dynamic luciferase reporter technology is described.

Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

Las respuestas de imagen neuronal en los preparativos de la rebanada del órgano vomeronasal Expresando un sensor de calcio genéticamente codificados

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural progenitor cells with astrocytic features (called SVZ astrocytes), neuroblasts, and intermediate progenitor cells. Neuroblasts born in the SVZ tangentially migrate a great distance to the olfactory bulb, where they differentiate into interneurons. Intercellular signaling through adhesion molecules and diffusible signals play important roles in controlling neurogenesis. Many of these signals trigger intercellular calcium activity that transmits information inside and between cells. Calcium activity is thus reflective of the activity of extracellular signals and is an optimal way to understand functional intercellular signaling among SVZ cells.
Calcium activity has been studied in many other regions and cell types, including mature astrocytes and neurons. However, the traditional method to load cells with calcium indicator dye (i.e. bath loading) was not efficient at loading all SVZ cell types. Indeed, the cellular density in the SVZ precludes dye diffusion inside the tissue. In addition, preparing sagittal slices will better preserve the three-dimensional arrangement of SVZ cells, particularly the stream of neuroblast migration on the rostral-caudal axis.
Here, we describe methods to prepare sagittal sections containing the SVZ, the loading of SVZ cells with calcium indicator dye, and the acquisition of calcium activity with time-lapse movies. We used Fluo-4 AM dye for loading SVZ astrocytes using pressure application inside the tissue. Calcium activity was recorded using a scanning confocal microscope allowing a precise resolution for distinguishing individual cells. Our approach is applicable to other neurogenic zones including the adult hippocampal subgranular zone and embryonic neurogenic zones. In addition, other types of dyes can be applied using the described method.

A method to load subventricular zone (SVZ) cells with calcium indicator dyes for recording calcium activity is described. The postnatal SVZ contains tightly packed cells including neural progenitor cells and neuroblasts. Rather than using bath loading we injected the dye by pressure inside the tissue allowing better dye diffusion.

Preparación de agudos Slices zona subventricular for Imaging Calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments that largely determines the quality of results. It has been shown that omitting the cooling step during cutting procedure is beneficial in obtaining healthy slices and cells, especially when dealing with highly myelinated brain structures from mature animals. Even though the precise mechanism whereby elevated temperature supports neural health can only be speculated upon, it stands to reason that, whenever possible, the temperature in which the slicing is performed should be close to physiological conditions to prevent temperature related artifacts. Another important advantage of this method is the simplicity of the procedure and therefore the short preparation time. In the demonstrated method adult mice are used but the same procedure can be applied with younger mice as well as rats. Also, the following patch clamp experiment is performed on horizontal cerebellar slices, but the same procedure can also be used in other planes as well as other posterior areas of the brain.

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Slice It Hot: Agudo cerebrales en adultos rebanar en la temperatura fisiológica

Here we present a protocol for preparation of acute brain slices. This procedure is a critical element for electrophysiological patch-clamp experiments ...