This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).

NOTA: Manejo de animales y los experimentos se llevaron a cabo tal como fue aprobado por el Comité de la Universidad de Göttingen para la Ética en la Experimentación Animal. 1. Preparación de Instrumentos y pipeta Fabricación <ol><li> Asegúrese de que la configuración de la electroporación consiste en un estereomicroscopio con una gran distancia de trabajo y está equipado con iluminación y conjuntos de filtros fluorescentes para el colorante utilizado. </li><li> Para la electroporación utilizar un electroporador sola célula dedicado o un generador de pulso cuadrado genérico conectado a un osciloscopio. Conecte las salidas electroporador a un soporte de pipetas y un electrodo de baño. Conectar el terminal positivo del generador de impulsos a la titular de la micropipeta y el terminal negativo al electrodo de baño. Asegurar tanto el soporte de pipeta y el electrodo de baño contienen alambres de plata recubiertas con una fina capa de cloruro de plata. </li><li> Monte el soporte de la pipeta en un micromanipulador para permitir un posicionamiento exacto. </li&gt; <li> Fabrique micropipetas de electroporación de capilares de vidrio borosilicato con filamento interno. </li><li> Use un extractor de micropipeta horizontal y aplicar un protocolo modificado para la fabricación de pipetas para experimentos de patch clamp como se describe por Bestman et al. 13. </li><li> Adaptar los parámetros para producir una caña más larga y una abertura de la punta más pequeña que resulta en una resistencia superior de la pipeta de alrededor de 15 a 20 MOhm para electroporación sola célula. La resistencia de la pipeta debe ser inferior, por ejemplo, 3-4 MOhm, para el etiquetado de los grupos de células. </li><li> Medir la resistencia de la pipeta ya sea directamente con un electroporador de una sola célula dedicada o calcularla con la Ley de Ohm después de medir el flujo de corriente con un osciloscopio después de la aplicación de un pulso de voltaje definido. </li></ol> 2. Preparación de la solución de electroporación <ol><li> Disolver dextrano fluoróforo acoplado en el timbre de la rana (98 mM NaCl, 2 mM KCl, CaCl2 1 mM, 2 mM MgC2 l, glucosa 5 mM, 5 mM Na-piruvato, 10 mM HEPES, ajustado a pH 7,8, la osmolaridad era de 230 mOsmol / l) a una concentración de 3 mM. Las células pueden no ser tan brillantemente etiquetados si se utilizan concentraciones de colorante inferiores. Preparar una solución de gran volumen de existencias y dividirla en pequeñas alícuotas. Congelarlos para el almacenamiento (estable durante meses). NOTA: Los dextranos están disponibles en diferentes tamaños y una variedad de emisión / espectros de excitación (por ejemplo, Alexa 488-dextrano 10 kD, Alexa 546-dextrano 10 kD, Alexa 568-dextrano 10 kD, Alexa 594-dextrano 10 kD, TMR-dextrano 3 kD.). </li><li> Rellene la micropipeta con una punta de pipeta alargada con un pequeño volumen de solución de dextrano (1-5 l). Flick cuidadosamente la micropipeta con el dedo para eliminar las burbujas de aire residuales de la punta de la pipeta. </li><li> Monte la micropipeta en el soporte de la pipeta. Asegúrese de que el alambre de plata dentro de la pipeta está en contacto con la solución de colorante. </li></ol> 3. Selección de larvas X. laevis &lt;/ Em&gt; <ol><li> Utilice larvas albino de X. laevis para los experimentos. El tipo de animales salvajes poseen melanóforos pigmento llena que muestran emisión de autofluorescencia en imagen confocal / multifotónica y por lo tanto no son adecuados para los experimentos descritos. </li><li> Etapa renacuajos premetamorphotic después de Nieuwkoop y Faber 14. Seleccione los renacuajos de las etapas 45 a 53 para los experimentos. </li></ol> 4. Electroporación de dextranos acoplados fluoróforo <ol><li> Coloque un pequeño pedazo de tejido en una placa de Petri y se cubre con un pequeño volumen de agua que contiene 0,02% tricaína (etil metanosulfonato 3-aminobenzoato, ajustado a pH 7). </li><li> Anestesiar los renacuajos en el agua que contienen 0,02% tricaína. Después de algunos minutos, los animales dejan de moverse. Confirme la anestesia adecuada tocando renacuajos. Deben ser no responde. </li><li> Transferir cuidadosamente el renacuajo de la anestesia a la cubierta de tejido placa de Petri. </li><li> Asegúrese de que el coc bañooda cierra el circuito de la electroporación. Asegúrese de que el electrodo está en contacto con el tejido húmedo; un contacto directo con el renacuajo no es necesario. </li><li> Coloque la punta de la micropipeta cerca del órgano olfativo utilizando el micromanipulador. </li><li> Penetran en la piel que cubre el órgano olfativo con la punta de pipeta y cautelosamente avanzar la punta en la capa de neurona sensorial situado en el centro de la epitelio olfativo principal o epitelio vomeronasal. </li><li> Dispare impulsos de tensión cuadrada positiva para transferir líquido de contraste en las neuronas sensoriales. Aplicar un pulso de tensión (por ejemplo., 25 V, longitud de pulso de 25 ms) o trenes de pulsos múltiples (por ejemplo., 50 V, longitud de pulso de 300 microsegundos, 400 duración de tren ms a 200 Hz). NOTA: Determinar los parámetros del pulso de tensión óptimas para el que desee ampliar de etiquetado. Reducir la amplitud del pulso de voltaje, duración y el número de repeticiones para reducir el número de células marcadas. Aplicar mayor amplitud de pulso de voltaje, duración y número de pulses para un etiquetado más generalizada. </li><li> Visualice extrusión tinte éxito y la electroporación por impulsos desencadenados utilizando iluminación fluorescente del microscopio estereoscópico. El tinte se propaga rápidamente en el cuerpo celular y las dendritas después de la electroporación éxito. </li><li> Repita los pasos 4.5 a 4.9 para el segundo órgano olfativo del renacuajo. </li><li> Transferir el renacuajo en un vaso lleno de agua fresca para la recuperación. Después de ca. 5 min de los renacuajos se despiertan de la anestesia y comienzan los movimientos normales de natación. </li><li> Después de 24 horas el medio de contraste a electroporación se propaga en las neuronas sensoriales y, finalmente, llega al bulbo olfativo a través del transporte axonal. </li></ol> 5. Los animales de montaje para En Vivo visualización de las células y axones <ol><li> Anestesiar los renacuajos en el agua que contienen 0,02% tricaína. </li><li> Transferir cuidadosamente renacuajos en una cámara de formación de imágenes, por ejemplo, una pequeña cubierta de caucho de silicona placa de Petri con un receso de renacuajo tamaño. &lt;/ Li&gt; <li> Corte un pequeño rectángulo en una franja de Parafilm. Cubrir el renacuajo con el Parafilm, dejando el telencéfalo anterior expuesta a través de la ventana de corte. Fijar el Parafilm con agujas en el plato sin dañar el renacuajo. </li><li> Asegúrese de que el renacuajo se sumerge en el agua suficiente que contiene 0,02% tricaína. </li><li> Monte la cámara de imágenes en el escenario de un microscopio multifotónica en posición vertical o un microscopio confocal. </li><li> Adquirir una pila de tres dimensiones de imágenes de la bulbo olfatorio. Asegúrese de que el procedimiento de formación de imágenes es lo más corta posible y no excede de 10-15 min. </li><li> Devolver el renacuajo en agua normal en un tanque separado y evitar la exposición a la luz. Después de 5 min, el renacuajo se despierta de la anestesia. </li><li> Repita los pasos 5.1 a 5.7 ​​después de intervalos de tiempo especificados, por ejemplo., Todos los días. </li></ol> 6. Los animales de montaje para Ex Vivo visualización de las células y axones <ol><li> Como alternativa a la sección 5del protocolo, utilizar una preparación de cerebro extirpado para visualizar las neuronas sensoriales etiquetados. </li><li> Anestesiar y matar al renacuajo por la transección del cerebro en la transición a la médula espinal. Escindir un bloque de tejido que contiene los órganos olfatorios, los nervios olfatorios y el telencéfalo anterior. </li><li> Transferir el bloque de tejido a la solución del timbre de la rana y eliminar el tejido conectivo con tijeras finas para exponer la parte ventral del cerebro. </li><li> Transferir el bloque de tejido a una cámara de imágenes y fijarla con un marco de platino cuerdas con hilos de nylon. </li><li> Monte la cámara de imágenes en el escenario de un microscopio confocal / multifotónica. </li><li> Adquirir una pila de tres dimensiones de imágenes de la bulbo olfatorio. </li></ol> 7. Procesamiento de Imágenes y Evaluación de Datos <ol><li> Optimizar y medios no locales de filtrado para mejorar la calidad de la imagen y la visualización de las estructuras neuronales como se describe por Coupé, P. et al. 15. NOTA: Los datos de los experimentos de imagen en capas de tejido más profundas de especímenes vivos son a menudo ruidoso. </li><li> Crear proyecciones de máxima intensidad de las pilas de imagen para una visión general. </li><li> Por lapso de tiempo la pantalla experimentos de imagen de los conjuntos de datos individuales axones inequívocamente identificables de las neuronas sensoriales. </li><li> Reconstruir la morfología celular a través del software asistida por el rastreo de los procesos neuronales como se describe por Peng et al. 16. </li></ol>

<ol>
	<li>Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+olfactory+epithelium+contains+multipotent+progenitors+that+give+rise+to+neurons+and+non-neural+cells.">Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells.</a> J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).</li><li>Schwob, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+regeneration+and+the+peripheral+olfactory+system.">Neural regeneration and the peripheral olfactory system.</a> Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).</li><li>Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. 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Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).</li><li>Nezlin, L. P., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+olfactory+sensory+neurons+project+into+more+than+one+glomerulus+in+Xenopus+laevis+tadpole+olfactory+bulb.">Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb.</a> J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).</li><li>Nagayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+simultaneous+tracing+and+Ca2++imaging+of+local+neuronal+circuits.">In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits.</a> Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El procedimiento experimental descrito aquí permite etiquetado neuronas sensoriales del órgano olfativo de X. larval laevis por electroporación de dextranos fluoróforo acoplado y la posterior visualización de crecimiento axonal sensorial en el animal vivo. Mediante la variación de los parámetros de la electroporación in vivo es posible controlar el número de neuronas sensoriales etiquetados. Es por lo tanto posible etiquetar grandes grupos de neuronas de un epitelio sensorial, muy pocos o incluso células individuales. Para asegurar la deseada extensión de etiquetado neuronal es importante ser particularmente cauteloso sobre las características de micropipeta y los pulsos de electroporación. Resistencias más altas de pipeta y la reducción de la amplitud de pulso de voltaje, duración y número de repeticiones pueden reducir la cantidad de células marcadas, mientras que la disminución de las resistencias de las pipetas y una mayor amplitud de pulso de voltaje, duración y número de pulsos puede conducir a un etiquetado más generalizada. The uso de dextranos fluorescentes para la electroporación proporciona retroalimentación visual inmediata si los ajustes aplicados son apropiados. Tenga cuidado de que el uso de parámetros de amplitud, duración y número de pulsos que exceden los valores previstos en el protocolo puede potencialmente conducir a daño celular o incluso la muerte celular 17. Consejos obstruidos o rotos de micropipetas también pueden dificultar la electroporación éxito. En electroporación in vivo en el órgano olfativo de X. laevis se limita a estadios larvarios ya que la piel de ranas postmetamorphotic es más dura y no puede ser fácilmente penetrado con una micropipeta. La visualización en vivo de los procesos neuronales puede verse obstaculizado por la dispersión de la luz de excitación / emisión en las zonas más profundas del cerebro o por los vasos sanguíneos. Este problema se hace especialmente evidente en estadios larvarios más altos debido a un cerebro más grande y puede dar lugar a señales ruidosas haciendo la clara identificación de los procesos axonales finas más difícil. <pclass = &quot;&quot;&gt; jove_content permisos El protocolo presentado para visualizar las neuronas sensoriales en el sistema olfatorio intacto sin disección del animal, dañando las células durante el etiquetado, preparación de cortes de tejido o la fijación del tejido que sea necesario para los métodos alternativos, como el etiquetado en el parche de células enteras experimentos -clamp 18. Cuando se combinan el etiquetado de los pocos o individuales con las neuronas sensoriales en vivo de imágenes de lapso de tiempo, es posible visualizar las conexiones glomerulares de las neuronas sensoriales maduros individuales durante intervalos de tiempo largos. De esta manera también es posible monitorizar el desarrollo de los patrones de proyección axonal de las neuronas sensoriales inmaduros durante varias semanas. Esta última opción es particularmente interesante ya que permite el seguimiento de los patrones de crecimiento de los axones individuales en el animal vivo. Esto abre la posibilidad de investigar los mecanismos celulares y moleculares que controlan la orientación axón y búsqueda de caminos. Varios factores, incluyendo la expresión del receptor odorante, varios Axomoléculas de orientación y n / actividad espontánea olor inducida de las neuronas sensoriales han sido demostrado que regulan el hallazgo de destino de los axones de las neuronas sensoriales 4,5. La aplicación del protocolo no se limita a las neuronas sensoriales olfativas, pero también se puede aplicar para estudiar otros tipos de células, por ejemplo., Las células madre / progenitoras de las zonas neurogénicos del cerebro en desarrollo o las células mitrales del bulbo olfativo. Además, la técnica mostrada también se puede utilizar en combinación con dextranos de calcio sensibles o se inyecta colorantes de calcio de membrana permeable para obtener información funcional sobre la neurona marcado y / o el sistema de circuitos conectado 7,19. La disponibilidad de una amplia gama de fluoróforos acoplados a dextranos permite el etiquetado de múltiples células individuales o poblaciones con diferentes colores. También plásmido solución de ADN, por ejemplo de codificación para las proteínas fluorescentes, es adecuado para la electroporación y se puede mejorar aún más la versatiliTy y utilidad de la técnica 6. El protocolo puede ser mejorado aún más para permitir que la electroporación combinada de dextranos y ADN o morfolinos cargadas para manipular la expresión génica 13,17. El método descrito sin duda representa una nueva herramienta para investigar la compleja y procesos aún no se entiende completamente que regulan la guía axonal en el sistema olfativo de los vertebrados.

The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="589">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:100px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">SZX16</td>
			<td style="width:100px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">stereomicroscope with fluorescent illumination</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Axon Axoporator 800A</td>
			<td style="width:100px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">single cell electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">ELP-01D</td>
			<td style="width:100px;">npi electronic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">MMJ</td>
			<td style="width:100px;">M&#228;rzh&#228;user Wetzlar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">manual micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">P-1000</td>
			<td style="width:100px;">Sutter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Horizontal micropipette puller</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:203px;">G150F-4</td>
			<td style="width:100px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 488-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22910</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 546-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22911</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 568-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22912</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Alexa 594-dextran 10kD</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D22913</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">TMR-dextran 3kD (micro-Ruby)</td>
			<td style="width:100px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D7162</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">microloader pipette tips</td>
			<td style="width:100px;">eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">930001007</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:203px;">tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)</td>
			<td style="width:100px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E10521</td>
			<td style="width:167px;">anesthetic; use gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">A1-MP</td>
			<td style="width:100px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">multiphoton microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:203px;">LSM 780</td>
			<td style="width:100px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:203px;">Imaris</td>
			<td style="width:100px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">alternative software for neuronal tracing</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the olfactory system as a model to study axonal growth patterns and morphology in vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

El protocolo descrito puede aplicarse con éxito para la electroporación y la visualización en vivo de los procesos axonales de las neuronas sensoriales del sistema olfativo de X. anestesiado laevis, usando confocal láser de barrido o microscopía multifotónica (Figura 1). La electroporación permite dextranos fluoróforo acoplado a entrar y se extendieron rápidamente dentro de las células del órgano olfativo. Es útil aplicar iluminación fluorescente para verificar etiquetado con éxito después de la activación de pulsos de voltaje. Dependiendo de los parámetros de electroporación, por ejemplo., Resistencia a la pipeta, grupos de células (Figura 2A, B) o células individuales (Figura 2C) del órgano olfativo están etiquetados. Los axones de las neuronas sensoriales etiquetados pueden ser visualizados en el nervio olfatorio (Figura 2D) y los procesos axonales se pueden observar también en el bulbo olfatorio, generalmente 24 horas después de la electroporación con éxito(Figura 3). Electroporación de grupos de neuronas sensoriales permite visualizar los patrones de cableado gruesos en el bulbo olfatorio (Figura 3A). Electroporación de células individuales se puede aplicar para investigar los patrones individuales de proyección axonal, bifurcaciones axonal y la conectividad a las estructuras glomerulares en el bulbo olfatorio (Figura 3C-E). Renacuajos albinos transparentes de X. permiso laevis en confocal in vivo o formación de imágenes multifotónica de las neuronas sensoriales marcadas en el cerebro intacto de renacuajo anestesiado. El desarrollo de los patrones de crecimiento axonal se puede seguir durante varios días / semana por repetido en la visualización in vivo de la misma neurona sensorial marcado (Figura 4). Dependiendo de la madurez de la neurona sensorial en el punto de tiempo de la electroporación el patrón axonal en el bulbo olfatorio puede variar considerablemente. Neuronas maduras ya poseen ramas axonales elaborados que cuentan con penachoáreas ed conectados a glomérulos. El patrón de crecimiento axonal de las neuronas maduras es bastante estable, pero la elongación de las ramas de los axones y refinamientos de mechones glomerulares son observables (Figura 4A-E). Las neuronas sensoriales pueden observarse in vivo durante períodos de tiempo prolongados, por ejemplo., Más de tres semanas (Figura 4F-I). Por otro lado, los axones de las neuronas inmaduras se encuentran todavía en el proceso de crecimiento inicial, no poseen arborizaciones con pelo insertado y aún no se han conectado a sus objetivos glomerulares finales. El protocolo experimental permite el seguimiento del desarrollo de estas neuronas durante la maduración, por ejemplo., El alargamiento del axón, bifurcaciones y el establecimiento de arborizaciones mechón insertado (Figura 4J-L). Para más ejemplos, vea también Hassenklöver y Manzini 12. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig1highres.jpg" width="500"/&gt; Figura 1. Esquema general del protocolo experimental. (A) las neuronas sensoriales en el epitelio olfativo principal (MOE) u órgano vomeronasal (OVN) del órgano olfativo de X. anestesiado larvas laevis se etiquetan mediante electroporación utilizando una pipeta de vidrio lleno de solución de dextrano fluorescente. Los axones de neuronas marcadas se pueden seguir a través del nervio olfatorio (ON) y, finalmente, alcanzan el bulbo olfatorio (OB). (B) El renacuajo se anestesiaron y las neuronas marcadas se investigaron varias veces utilizando un microscopio confocal multifotónica o en intervalos de tiempo específicos. (C) El desarrollo incremental de patrones de crecimiento axonal de las células marcadas se puede seguir a través de períodos de tiempo de días a semanas. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Electroporation de las neuronas sensoriales en el órgano olfativo. (A) La electroporación con pipetas de baja resistencia conduce a etiquetado de múltiples células en el órgano olfativo. En este ejemplo representativo se tiñeron múltiples neuronas receptoras olfativas (ORNs, puntas de flecha rellenos) y dos células en forma de columna de soporte (SC, asteriscos). Las líneas discontinuas demarcan las fronteras del epitelio olfatorio (OE). (B) Perfeccionamiento de los parámetros de electroporación, por ejemplo., El aumento de la resistencia a la pipeta, restringe el número de células marcadas. En este ejemplo, una sola neurona sensorial (puntas de flecha llenas) y uno adyacente de soporte celular (asterisco) se tiñeron después de la electroporación. Tenga en cuenta el solo axón dejando el epitelio olfativo (puntas de flecha abiertas). (C) El éxito de la electroporación de células individuales conduce a etiquetado exclusiva de una neurona individual sensorial (punta de flecha llena) y su axón conectado (puntas de flecha abiertas) en el epitelio olfativo. <strong&gt; (D) El axón de marcaje único (puntas de flecha abiertas) se puede seguir a través del nervio olfatorio (ON) en el bulbo olfativo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig3highres.jpg" width="400" /> Figura 3. Visualización de las proyecciones de los axones olfativos en el bulbo olfatorio extirpado. (A) La topología grueso de las proyecciones axonales de las neuronas sensoriales en el bulbo olfativo puede ser visualizado utilizando pipetas de electroporación más bajos de resistencia. Un hemisferio bulbo olfatorio y su nervio olfatorio asociado (ON) se representan. Cuatro dextranos acoplados a diferentes fluoróforos se sometieron a electroporación en cuatro lugares distantes del órgano olfativo: lateral (verde), medio (amarillo), medial MOE (rojo) y el OVN (naranja). Esto permite visualizar el bulbo olfativo accesorio (AOB) y los tres campos principales de proyección del bulbo olfatorio principal (MOB). <strong&gt; (B) Diferentes patrones de crecimiento axonal de las neuronas sensoriales olfativas individuales superpuestas en la estructura del bulbo olfatorio. Representado se combinan tres reconstrucciones tridimensionales de múltiples tinciones de células individuales derivados de diferentes muestras de larvas. (CE) Ejemplos de axones olfativos individuales que sobresalen en el bulbo olfativo y que forman arborizaciones mechón insertado / sinapsis en los glomérulos esférica (puntas de flecha rellenas). Nótese que en X. laevis axones olfativos bifurcan regularmente (puntas de flecha en blanco) antes de conectar a una, dos o múltiples glomérulos (puntas de flecha llenos, también ven Hassenklöver y Manzini 12). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52143/52143fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. En vivo de imágenes de lapso de tiempo de los axones de las neuronas individuales olfativo. (AE)Después de la electroporación de células individuales éxito el axón marcado puede ser visualizado en repetidas ocasiones en el bulbo olfatorio (OB). Este ejemplo muestra un axón individuo que fue investigado durante una semana. La morfología general no cambia considerablemente y dos importantes puntos de ramificación puede ser identificado (puntas de flecha abierta). Tenga en cuenta que en el transcurso del tiempo, un penacho glomerular sufre reducción continua (punta de flecha llena), mientras que los otros dos mechones glomerulares permanecen estables (asteriscos). (FI) Este ejemplo muestra representativa de la viabilidad de las observaciones a largo plazo, ya que esto axón específica fue investigado durante más de tres semanas. No aparente cambio de su patrón de crecimiento puede ser detectado. (JL) Un ejemplo de un axón sensorial inmaduros en el proceso de crecimiento se representa. Todavía no se ha conectado a los glomérulos y mechones glomerulares característicos están desaparecidos. Después de 5 días las ramas axonales son alargadas, el axón bifurcado en múltiples ocasiones y arborizaciones finos sonestablecida.

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The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

El sistema olfativo como un modelo para estudiar los patrones de crecimiento axonal y Morfología<em&gt; En Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

10.8K vistas.  University of Göttingen. We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

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A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

La<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema Modelo para el Estudio Amylopathy

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Investigación

Neurociencias

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo la Producción de la Bombilla órgano vomeronasal y accesorios olfativa Intacto

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

A Free-breathing fMRI Method to Study Human Olfactory Function

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, evaluation of the functions of the human central olfactory system with functional magnetic resonance imaging (fMRI) is still a challenge because of several technical difficulties. There are some significant variables to take into account when considering an effective method for mapping the function of the central olfactory system using fMRI, including proper odorant selection, the interaction between odor presentation and respiration, and potential anticipation of or habituation to odorants. An event-related, respiration-triggered olfactory fMRI technique can accurately administer odorants to stimulate the olfactory system while minimizing potential interference. It can effectively capture the precise onsets of fMRI signals in the primary olfactory cortex using our data post-processing method. The technique presented here provides an efficient and practical means for generating reliable olfactory fMRI results. Such a technique can ultimately be applied in the clinical realm as a diagnostic tool for diseases associated with olfactory degeneration, including Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s disease, as we begin to further understand the complexities of the human olfactory system.

We present the technical challenges and solutions for obtaining reliable functional magnetic resonance imaging (fMRI) data from the human central olfactory system. This includes special considerations in olfactory fMRI paradigm design, descriptions of fMRI data acquisition with an MRI-compatible olfactometer, odorant selection, and a special software tool for data post-processing.

Un método fMRI de respiración libre para estudiar la función olfativa humana

The study of human olfaction is a highly complex and valuable field with applications ranging from biomedical research to clinical evaluation. Currently, ...

Facial Nerve Surgery in the Rat Model to Study Axonal Inhibition and Regeneration

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial nerve can be manipulated along its entire length, from its intracranial segment to its extratemporal course. There are three primary types of nerve injury used for the experimental study of regenerative properties: nerve crush, transection, and nerve gap. The range of possible interventions is vast, including surgical manipulation of the nerve, delivery of neuroactive reagents or cells, and either central or end-organ manipulations. Advantages of this model for studying nerve regeneration include simplicity, reproducibility, interspecies consistency, reliable survival rates of the rat, and an increased anatomic size relative to murine models. Its limitations involve a more limited genetic manipulation versus the mouse model and the superlative regenerative capability of the rat, such that the facial nerve scientist must carefully assess time points for recovery and whether to translate results to higher animals and human studies. The rat model for facial nerve injury allows for functional, electrophysiological, and histomorphometric parameters for the interpretation and comparison of nerve regeneration. It thereby boasts tremendous potential toward furthering the understanding and treatment of the devastating consequences of facial nerve injury in human patients.

This protocol describes a reproducible approach to facial nerve surgery in the rat model, including descriptions of various inducible patterns of injury.

Cirugía de nervios faciales en el modelo de rata para estudiar la inhibición y regeneración axonal

This protocol describes consistent and reproducible methods to study axonal regeneration and inhibition in a rat facial nerve injury model. The facial ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

Generación de hidrogeles a base de colágeno 3D para analizar el crecimiento y el comportamiento axonal durante el desarrollo del sistema nervioso

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

Utilización de electroporación postnatal in vivo para estudiar la morfología de la neurona del gránulo cerebeloso y el desarrollo de la sinapsis

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

Optimización de la configuración y las condiciones del electrorretinograma ex vivo para estudiar la función de la retina en ojos pequeños y grandes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones -the sensory structures located at the distal tips of developing axons- execute this process. Studying the structure and dynamics of the growth cone is crucial to understanding axonal development and the interactions with the surrounding central nervous system (CNS) that enable it to form neural circuits. This is essential when devising methods to reintegrate axons into neural circuits following injury in fundamental research and pre-clinical contexts. Thus far, the general understanding of growth cone dynamics is primarily founded on studies of neurons cultured in two dimensions (2D). Although undoubtedly fundamental to the current knowledge of growth cone structural dynamics and response to stimuli, 2D studies misrepresent the physiological three-dimensional (3D) environment encountered by neuronal growth cones in intact CNS tissue. More recently, collagen gels were employed to overcome some of these limitations, enabling the investigation of neuronal development in 3D. However, both synthetic 2D and 3D environments lack signaling cues within CNS tissue, which direct the extension and pathfinding of developing axons. This protocol provides a method for studying axons and growth cones using organotypic brain slices, where developing axons encounter physiologically relevant physical and chemical cues. By combining fine-tuned in utero and ex utero electroporation to sparsely deliver fluorescent reporters along with super-resolution microscopy, this protocol presents a methodological pipeline for the visualization of axon and growth cone dynamics in situ. Furthermore, a detailed toolkit description of the analysis of long-term and live-cell imaging data is included.

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

This protocol demonstrates a straightforward and robust method to study in situ axon growth and growth cone dynamics. It describes how to prepare ex vivo physiologically relevant acute brain slices and provides a user-friendly analysis pipeline.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...