Agradecemos al Dr. Yih-Fan Chen para ayudar con las pinzas ópticas axial y para contribuir a algunos de sus datos se extiende a este manuscrito. Este trabajo fue patrocinado por la NSF conceder PHY-0957293 y FOCUS conceder PHY-0114336.

1. Pinzas de configuración <ol><li> El haz de un láser de 1064 nm se divide en dos rayos polarizados ortogonalmente. Uno se utiliza para manipular la biomolécula, mientras que el otro se usa para fines de calibración (ver fig. 2). </li><li> La intensidad del haz de la manipulación se controla mediante un deflector acústico-óptica (AOD), mientras que la posición y la orientación de cada haz se controla de forma independiente por los espejos de orientación del haz y los telescopios ópticos, respectivamente. </li><li> Los rayos se recombinan con otro divisor de haz polarizante y más condicionada por un conjunto final de la óptica telescópica se llene demasiado poco de la apertura posterior del objetivo del microscopio. Un sobrellenado del 50% para el haz de calibración conduce a una trampa óptica estrecha, mientras que uno ligeramente más pequeño para el haz de la manipulación, aproximadamente el 20%, da un enfoque más superficial que se traduce en una región más grande viable del potencial lineal. Las vigas están muy enfocados en un objetivo 60x/1.4 PlanApo microscopio de inmersión en aceite en la celda de muestra. </li><li> Esta configuración pinzas se combina con un microscopio de campo claro casa construida que proporciona la iluminación de una lámpara halógena se centró en la cámara de la muestra por un condensador. La imagen de campo claro está separada de la luz láser por un espejo dicroico y luego imágenes de dos cámaras CCD. Un CCD actúa como nuestro medio principal de adquisición de datos y software provocado para obtener tasas precisas de muestreo, mientras que los otros CCD se utiliza para la imagen de una sola de las microesferas pegado de referencia cuya posición sirve como un sistema de retroalimentación de control para compensar la deriva en el microscopio. </li><li> La muestra es gruesa posicionada con respecto al objetivo de una etapa de XY, a continuación, pueden posicionar con precisión por un piezo integrado en tres dimensiones del escenario. </li><li> La luz del láser hacia el dispersada y transmitida es recogida por el condensador de campo claro y centrado en un fotodetector. La señal resultante se filtra a través de un filtro anti-aliasing de 100 kHz, se amplifica y adquirido a 200 kHz con una tarjeta de adquisición de datos. </li></ol> 2. Calibrar el tamaño aparente de la posición axial de bolas de <ol><li> Carga una cámara de muestra 9 con una solución de dispersar a 800 nm microesferas de poliestireno de diámetro diluido en tampón fosfato salino. Deje reposar durante 10-15 minutos y luego enjuague con tampón ligeramente para eliminar el exceso de microesferas. </li><li> Localice una microesfera azar pegado a la cubreobjetos y ajustar la altura de la cámara de la muestra hasta la microesfera es de aproximadamente 1 m por debajo del foco para generar una imagen desenfocada. </li><li> Para medir el tamaño aparente de la imagen, en primer lugar encontrar el centro de la microesfera con el patrón geométrico correspondiente función en LabVIEW. </li><li> A continuación, generar un perfil de intensidad radiales de la microesfera por un promedio de 360 ​​° sobre el centro de cada sección transversal. El perfil radial, que se corresponde con un anillo blanco en cada una de las imágenes de campo claro, puede ser equipado con una función cuadrática para encontrar un pico de brillo. La distancia entre el pico y el centro se puede utilizar como una medida del tamaño aparente de la cuenta. </li><li> Utilizando el piezostage calibrado, aumentar gradualmente la posición axial de la microesfera y adquirir una imagen en cada posición axial con la cámara CCD. </li><li> Repita el análisis de imagen para cada imagen sucesiva de correlacionar el tamaño aparente de la microesfera con su ubicación axial (ver Fig. 3).. La resolución axial obtenida por el método es de alrededor de 1,4 nm 7. </li></ol> 3. Cartografía del potencial óptico del haz de manipulación <ol><li> Comience por collinearly alinear el haz de la manipulación y el haz de calibración. El haz de calibración debe estar alrededor de 50 mW en la apertura posterior del objetivo, mientras que el haz de la manipulación debe ser mucho más débil, por ejemplo, 10 mW. </li><li> Con el haz de la manipulación de apagado, confinar una microesfera libre dentro de la trampa mucho más dura de la viga de calibración. </li><li> Ahora, a su vez en la viga de la manipulación. Puesto que el haz de la manipulación es mucho más débil que el haz de calibración, la posición axial de la microesfera será un poco perturbado. El cambio resultante en la posición axial se puede medir a partir de las imágenes de campo claro desenfocado como ya se describió. </li><li> Apague el haz de la manipulación y con la microesfera que siguen atrapados en el haz de calibración, cambiar el enfoque axial del haz de calibración mediante el ajuste de la mira telescópica. A su vez en la viga de la manipulación, medir el desplazamiento posterior de la microesfera y repetir. </li><li> El Dx desplazamientos se pueden trazar en contra de la posición axial del foco del haz de calibración. La posición axial que corresponde a la mayor cilindrada de la microesfera determina el centro de la región lineal de la trampa óptica (ver fig. 4). </li><li> El último paso en la obtención de la fuerza óptica de la viga de la manipulación en función de la posición axial requiere una cuidadosa medición de la rigidez de lacalibración del haz. Para lograr esto, mover la microesfera, atrapado por el haz de calibración, a alrededor de un micrómetro encima de la superficie mediante el ajuste de la mira telescópica, mientras que el haz de la manipulación se apaga. </li><li> Registrar el movimiento térmico axial de la microesfera, midiendo la intensidad de luz transmitida con un fotodetector. </li><li> La autocorrelación de la señal puede ser equipado con una función exponencial decreciente única para dar a la constante de tiempo de las fluctuaciones,. Τ z </li><li> El coeficiente de rozamiento hidrodinámico ζ, de la microesfera puede ser corregida por la proximidad de microesferas a un 5,10 de la superficie. La rigidez de la trampa de calibración está dada por κ z = ζ / τ z (ver materiales complementarios A y B). </li><li> Conociendo la rigidez de la trampa de calibración permite convertir los desplazamientos medidos previamente axial en una fuerza ƒ z = z κ Integración Dx de esta curva de rendimientos de una cartografía espacial del potencial axial óptico del haz de la manipulación (ver fig. 4). </li></ol> 4. Estirar una muestra de ADN <ol><li> Monte la cámara de 9 que contiene moléculas de la superficie atados ADN (&lt;1 kpb) y, mientras observa la imagen de campo claro, el lugar en el centro de la viga de la manipulación ligeramente por encima de la estirada microesferas mediante el ajuste del telescopio. A continuación, ajuste la posición de la etapa hasta que una de las microesferas se encuentra atrapada. </li><li> Más o menos la posición de la microesfera en el centro del plano XY de la trampa óptica. Generar una serie de ondas cuadradas en LabView y los envían a la AOD a su vez, repetidamente el rayo láser encendido y apagado. Con cuidado, el control de la intensidad del láser y la duración del estado a evitar el calentamiento de la cámara de la muestra. Por lo general, el uso alrededor de 2 MW de potencia del láser (medida a la apertura posterior del objetivo) y enviar pulsos de 200 ms (a) y 500 ms (apagado). La amplitud de la onda cuadrada enviado a la AOD debe ser alrededor de 0,5 V. </li><li> Mira la microesfera que la trampa se dirigió en repetidas ocasiones dentro y fuera y observe si el láser induce una dirección preferencial de movimiento de la microesfera. Mientras iterativa para ajustar la posición de las microesferas, tanto en la dirección X y Y, por el control de la piezostage, el movimiento aleatorio de la microesfera debe ser isótropa en el plano XY, aunque notablemente más restringido cuando el láser está encendido. </li><li> Luego, alinee el talón en la dirección Z. Una vez más el pulso del rayo láser y fuera al mismo tiempo, esta vez, al mismo tiempo medir el desplazamiento axial de microesferas en tiempo real. Centro de la escena de la región lineal, que es el punto donde el desplazamiento Z es mayor. </li><li> Después de una cuidadosa alineación en la dirección Z, es imprescindible comprobar que la trampa está centrado aún en el plano XY. Si la alineación XY ha cambiado, tanto en la X, Y y Z la alineación debe ser repetido hasta que la microesfera se centra correctamente en los tres ejes. </li><li> Para estirar el ADN, la rampa de la intensidad del láser mediante el envío de una señal de voltaje a la AOD, de 0 V a 0,5 V en incrementos de 0,025 V. En cada paso, grabar 400 imágenes a 100 fps y el promedio de ellos para obtener el desplazamiento axial. </li><li> Las curvas del recorrido de fuerzas ahora se pueden trazar y el ajuste a un modelo modificado de WLC 11 (ver Materiales de apoyo B). </li></ol> 5. Los resultados representativos: Se presentan las curvas de fuerza de extensión de dos secuencias de ADN: un pb 1298 y una secuencia de 247 pb, siendo esta última la más corta secuencia que hemos sido capaces de estirar de forma reproducible. Para tramos cortos de ADN, la convencional forma de gusano de la cadena (WLC) modelo no explica la relación del recorrido de fuerzas, porque en estas escalas de longitud uno debe tener en cuenta para efectos de tamaño finito y extensión de la fuerza cero derivadas de las restricciones de frontera. Las medidas de extensión de la fuerza, por lo tanto, tiene que estar en forma con un modelo modificado de WLC, que tiene una longitud de persistencia efectiva y una extensión de fuerza cero como parámetros de ajuste, se describe más adelante en el material complementario. Para longitudes de curvas de nivel grande de ADN de doble cadena, la persistencia de longitud efectiva es simplemente la longitud de la persistencia nominal (~ 50 nm) y la extensión de la fuerza de cero puede ser despreciada. Sin embargo, como la longitud del contorno se acorta la longitud de la persistencia efectiva disminuye por debajo de 50 nm y el ADN, incluso por la fuerza a cero, muestra una importante ampliación. Los datos y los ajustes correspondientes de las curvas de fuerza de extensión se muestra en la figura. 5 para las dos secuencias. Desde el WLC modificado se ajusta, se ha determinado la duración efectiva de la persistencia de 35 nm para el ADN de 1.298 pb y 25 nm de 247 bp de ADN. Para fines ilustrativos, se plantean medidas individuales de las curvas de fuerza de extensión para cada secuencia. En la práctica, se podría repetir las mediciones varias veces y obtener los resultados medios, junto con los errores estándar. También debe tenerse en cuenta THAt después de la obtención de cada curva es imprescindible para asegurar que la microesfera y queda atrapado en la posición correcta dentro de la región lineal, de lo contrario la microesfera debe ser reajustado según lo descrito anteriormente en el protocolo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig1.jpg" /> Figura 1 Principio de Axial pinzas ópticas. (Izquierda) trampa de pinzas ópticas convencionales cerca del foco. El talón se mueve entonces por fuera del cubreobjetos para ejercer tensión. (Derecha) En axial pinzas ópticas, una microesfera está atrapado desde el foco, en la región lineal del potencial óptico. En esta configuración, el polímero se lleva a cabo bajo una tensión constante para una amplia gama de extensiones. Por otra parte, el aumento de la intensidad del láser se mueve la microesfera en la dirección axial. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig2.jpg" /> Figura 2 Representación esquemática de Axial Pinzas Ópticas láser de luz (1064 Nd: YVO4). Se divide en dos haces al pasar por un separador de haz de polarización (PBS). El haz de la manipulación, pasa a través de un deflector acústico-ópticos (AOD) y el haz de calibración se pueden ajustar independientemente el uso de lentes telescópicos. Los dos rayos se recombinan con otro PBS y se centró en la muestra por un objetivo de alto NA. Al mismo tiempo, campo claro iluminación utilizada para realizar un seguimiento de la microesfera, pasa a través de la muestra, es la radiación infrarroja (IR), se filtró y luego fotografiada por las dos cámaras CCD, uno de los cuales toma la presión mientras el otro actúa como parte de un sistema de control de retroalimentación. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig3.jpg" /> Figura 3 calibración de la posición axial. Para calibrar la posición axial, adquirimos imágenes desenfocadas de un cordón pegado a la cámara de cubreobjetos en diferentes posiciones de los ejes de la etapa. El tamaño de las microesferas es dada por la distancia entre el centro y la posición de máxima intensidad sobre el anillo brillante formado alrededor de la imagen de la microesfera. En el recuadro se presenta la distribución de intensidad radial que da el tamaño de la cuenta. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig4.jpg" /> Figura 4 principio detrás de Cartografía del potencial óptico. Para un mapa de la fuerza óptica de la viga de la manipulación, el desplazamiento axial que se produce en una de las microesferas atrapadas dentro de un haz de calibración mucho más fuerte que se mide. El centro de la región lineal en este desplazamiento es de un máximo se encuentra. El grupo de óptica frente a la curva posición axial se pueden integrar para encontrar el potencial óptico. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3405/3405fig5.jpg" /> Figura 5 Curva de Extensión de la Fuerza. Los datos se muestran de forma aleatoria 1.298 pb y 247 pb (recuadro) segmento de ADN de doble cadena se extendía por axial pinzas ópticas. Los puntos de datos se ajuste al modelo modificado WLC de la ecuación. 3 (línea continua) y cedió la longitud efectiva la persistencia de 34 nm y 25 nm, respectivamente, para el 1298bp y 247bp.

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Matter. 19, 293-302 (2006).</li><li>Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-encoded+nucleosome+organization+of+a+eukaryotic+genome.">The DNA-encoded nucleosome organization of a eukaryotic genome.</a> Nature. 458, 362-366 (2009).</li><li>Garcia, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+Consequences+of+Tightly+Bent+DNA:+The+Other+Life+of+a+Macromolecular+Celebrity.">Biological Consequences of Tightly Bent DNA: The Other Life of a Macromolecular Celebrity.</a> Biopolymers. 85, 115-130 (2006).</li><li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+trapping.">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li><li>Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+optical+tweezers.">Recent advances in optical tweezers.</a> Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).</li><li>Chen, Y. F., Blab, G. A., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+submicron+biomolecules+with+constant-force+axial+optical+tweezers.">Stretching submicron biomolecules with constant-force axial optical tweezers.</a> Biophys. J. 96, 4701-4708 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Wilson, D. P., Raghunathan, K., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entropic+boundary+effects+on+the+elasticity+of+short+DNA+molecules.">Entropic boundary effects on the elasticity of short DNA molecules.</a> Phys. Rev. E. 80, 020903-020903 (2009).</li><li>Chen, Y. F., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tethered+Particle+Microscopy+(TPM)+Protocol.">Tethered Particle Microscopy (TPM) Protocol.</a> Meiners Lab. , (2011).</li><li>Brenner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+slow+motion+of+a+sphere+through+a+viscous+fluid+towards+a+plane+surface.">The slow motion of a sphere through a viscous fluid towards a plane surface.</a> Chem. Eng. Sci. 16, 242-251 (1961).</li><li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretching+DNA.">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).</li><li>Greenleaf, W. J., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule,+motion-based+DNA+sequencing+using+RNA+polymerase.">Single-molecule, motion-based DNA sequencing using RNA polymerase.</a> Science. 313, 801-801 (2006).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-mediated+DNA+loop+formation+and+breakdown+in+a+fluctuating+environment.">Protein-mediated DNA loop formation and breakdown in a fluctuating environment.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 258103-258103 (2010).</li><li>Chen, Y. F., Milstein, J. N., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Femtonewton+entropic+forces+can+control+the+formation+of+protein-mediated+DNA+loops.">Femtonewton entropic forces can control the formation of protein-mediated DNA loops.</a> Phys. Rev. Lett. 104, 048301-048301 (2010).</li><li>Raghunathan, K., Milstein, J. N., Juliar, B., Blaty, J., Meiners, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+Dependent+Effects+on+the+Elasticity+of+Short+DNA+Molecules.">Sequence Dependent Effects on the Elasticity of Short DNA Molecules.</a> , (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Pinzas ópticas convencionales se basan en información ya sea analógico o controlados por ordenador para aplicar una fuerza constante en un objeto refractantes. Estos sistemas de captación activa tiene dificultades para realizar en condiciones en que los cambios repentinos en la extensión de la muestra se producen, por ejemplo, de la unión de una proteína en el ADN o la intensificación rápida de un motor molecular a lo largo de un filamento. Varios métodos pasivos para la aplicación de fuerzas constantes se ha...

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Reagent/Equipment</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalog number</th>
			<th>Comments </th>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nd:YVO4 laser</td>
			<td>Spectra Physics</td>
			<td>T40-Z-106C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acousto-optic deflector</td>
			<td>IntraAction</td>
			<td>DTD-274HA6</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>PlanApo </td>
			<td>60X, NA 1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo stage</td>
			<td>Mad City Labs</td>
			<td>Nano-LP100</td>
			<td>XYZ stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD camera</td>
			<td>PixeLink</td>
			<td>PL-A741</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photodetector</td>
			<td>Electro-Optics Tech</td>
			<td>ET-3020</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-08-10</td>
			<td>800nm, streptavidin coated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-digoxigenin</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11333089001</td>
			<td>From sheep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>MWG operon</td>
			<td>Custom oligos</td>
			<td>One primer: biotin 
Other : digoxigenin 
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR reagents</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>TAQ polymerase, dNTPs</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other chemicals for buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Supplementary Materials
A. Hydrodynamic Friction Coefficient
For determining the hydrodynamic friction coefficient of the microsphere near a surface one can use the following expansion5,10: 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq1.jpg" alt="Equation 1" />
where the following shorthand has been introduced: 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq2.jpg" alt="Equation 2" />
The friction coefficient is defined in terms of the fluid viscosity &eta; and the radius of the microsphere, with the microsphere's center located a distance &eta; above the surface. The summation converges reasonably well when expanded to about ten terms.
B. Influence of Axial Position on Stiffness Calibration
The calibration of the trap stiffness involves a tradeoff between the accuracy of the calibration, which increases with increasing distance from the surface, and the actual axial position where the trap is used experimentally. In general, the trap is calibrated at around 800-1000 nm from the surface, which is higher than the actual experimental condition.
C. Modified Worm-Like Chain (WLC) Model
The force extension curves can be fit to a modified WLC model that accounts for volume exclusion effects at zero optical force as follows: 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq3.jpg" alt="Equation 3" />
where Fopt is the optical force, xo is a fit parameter for the zero force extension,xopt is the extension under force, l is the contour length of the DNA, and l*p is a second fit parameter for an "effective" persistence length. Fwlc is given by the usual WLC model11 
<img src="/files/ftp_upload/3405/3405eq4.jpg" alt="Equation 4" /> 
where &epsilon; is the relative DNA extension.

stretching short sequences of dna with constant force axial optical tweezers

Una sola molécula de técnicas para estirar el ADN de longitudes de curvas de nivel a menos de un kilobase están llenos de dificultades experimentales. Sin embargo, muchos eventos interesantes biológicos tales como la unión de histonas y proteínas mediada por un bucle de ADN 1,2, se encuentran en esta escala de longitud. En los últimos años, las propiedades mecánicas de ADN han demostrado que desempeñan un papel importante en los procesos celulares básicos como el empaquetamiento del ADN en los nucleosomas compacto y fibras de cromatina 3,4. Es evidente, entonces es importante entender las propiedades mecánicas de los tramos cortos de ADN. En este artículo, ofrecemos una guía práctica de una técnica de depilación de una sola molécula óptica que hemos desarrollado para estudiar el comportamiento mecánico de ADN con una longitud de contorno tan corto como unos pocos cientos de pares de bases. El principal obstáculo en el estiramiento segmentos cortos de ADN, es que las pinzas ópticas convencionales generalmente están diseñados para aplicar la fuerza en una dirección lateral a la etapa de 5,6, (véase la Fig. 1.). En esta geometría, el ángulo entre el talón y el cubreobjetos, a la que el ADN está conectado al ordenador, se hace muy fuerte de ADN de longitud submicron. La posición axial ahora deben tenerse en cuenta, que puede ser un desafío, y, puesto que la extensión se prolonga la microesfera más cerca del cubreobjetos, efectos estéricos se han mejorado. Por otra parte, como resultado de la asimetría de las microesferas, extensiones laterales se generan distintos niveles de torque debido a la rotación de la microesfera dentro de la trampa óptica desde la dirección de la variación de la fuerza reactiva en la extensión. Métodos alternativos para el estiramiento de ADN submicron ejecutar en contra de sus propias barreras. Por ejemplo, una trampa de doble haz óptico está limitado a un estiramiento del ADN de alrededor de una longitud de onda, en la que los efectos punto de interferencia entre las dos trampas y de dispersión de la luz entre las microesferas empiezan a plantear un problema importante. Sustitución de una de las trampas con una micropipeta más probable es que sufren de problemas similares. Mientras que uno podría utilizar directamente el potencial axial para estirar el ADN, un esquema de retroalimentación activa sería necesario aplicar una fuerza constante y el ancho de banda de esta será muy limitado, especialmente en las fuerzas bajo. Nos evitar estos problemas fundamentales directamente tirar el ADN fuera del cubreobjetos con una fuerza axial constante pinzas ópticas 7,8. Esto se logra atrapar la bola en una región lineal de la posibilidad de óptica, donde la fuerza óptica es constante, la fuerza de la que se pueden ajustar mediante el ajuste de la potencia del láser. Atrapando dentro de la región lineal también sirve como una fuerza todas las ópticas-clamp en el ADN que se extiende por cerca de 350 nm en la dirección axial. Simultáneamente, compensar la desviación térmica y mecánica finamente ajustar la posición de la etapa para que una microesfera de referencia pegado a la cubreobjetos se mantiene en la misma posición y el enfoque, lo que permite un período de observación prácticamente ilimitadas.

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Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Se ilustra el uso de una fuerza constante pinzas ópticas axial para explorar las propiedades mecánicas de las moléculas cortas de ADN. Por el estiramiento del ADN axialmente, podemos minimizar los obstáculos estéricos y artefactos procedentes de la manipulación lateral convencional, lo que nos permite estudiar las moléculas de ADN tan corto como ~ 100 nm.

Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

stretching-short-sequences-dna-with-constant-force-axial-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.0K vistas.  University of Michigan. Se ilustra el uso de una fuerza constante pinzas ópticas axial para explorar las propiedades mecánicas de las moléculas cortas de ADN. Por el estiramiento del ADN axialmente, podemos minimizar los obstáculos estéricos y artefactos procedentes de la manipulación lateral convencional, lo que nos permite estudiar las moléculas de ADN tan corto como ~ 100 nm.

Video: Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Investigación

Bioingeniería

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor para la detección de antibióticos Las bacterias estafilococo resistentes

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Microscopía óptica cuantitativa: Medición de Biofísica Celular Características con un microscopio óptico estándar

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Cuantificación de la organización del colágeno fibrilador con herramientas basadas en curvelet transform

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...