This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

1 Preparación de ARN Moléculas por Single-molécula Tweezing <ol><li> La clonación de la secuencia de interés. Clonar la secuencia de ADN correspondiente a la estructura de ARN en un vector. </li><li> Síntesis y purificación de la plantilla de la transcripción. Sintetizar una plantilla de transcripción por PCR. [Lugar de la tabla 1 aquí] A continuación, purificar los productos de PCR utilizando un kit de purificación de PCR, y concentrar la muestra de&gt; 200 ng / l. Debido a que el ADN purificado se utiliza para la transcripción, RNasa libre de agua se debe utilizar en las etapas de elución y concentración. </li><li> Transcripción in vitro. Sintetizar ARN por transcripción in vitro a 37 ° C durante la noche para maximizar el rendimiento de ARN. [Lugar de la tabla 2 aquí] Después de la transcripción, añadir 1 l de DNasa I para digerir el molde de ADN durante 15 minutos a 37 ° C. Se purifica el ARN utilizando una columna de centrifugación de sílice. </li><li> Síntesis de la manija biotinilado A. En primer lugar, producir el mango no modificada A por PCR usando los cebadores Af y Ar y HCl concEntrate el ADN amplificado a&gt; 200 ng / l. A continuación, incorporar modificaciones de biotina en el producto de PCR usando una reacción de extensión del cebador. [Lugar de la tabla 3 aquí] NOTA: El mango biotinilada (biotina-HA) se puede utilizar directamente en el recocido sin purificación. A medida que la biotina-HA ha de recocido con el ARN, es fundamental utilizar RNasa libre de agua en ambas etapas. </li><li> Síntesis del mango modificado digoxigenina B. Sintetizar digoxigenina modificado mango B (dig-HB) por PCR usando el cebador Bf y oligo modificado digoxigenina-Dig-Br (Figura 3). A continuación, purificar el producto de PCR y concentrar la muestra a&gt; 200 ng / l. </li><li> Hibridación de ARN a los mangos. Recocer el ARN con asas. [lugar los cuadros 4 y 5 aquí] </li><li> Purificar muestra recocida. Añadir 3 volúmenes de etanol de la muestra recocida y mezclar bien. Guarde la mezcla a -70 ° C durante al menos 1 hora. Centrifugar a 15.800 xg y desechar el sobrenadante. Secar la pella utilizando un liofilizador. Disolver el precipitado en100 l de agua libre de RNasa. NOTA: La muestra está listo para ser utilizado y se puede almacenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Calibración y Operación de las pinzas ópticas <ol><li> Calibrar Tamaño de píxel de monitor de vídeo <ol><li> Utilice la trampa óptica para atrapar un cordón con diámetro conocido (tamaño estándar). </li><li> Capturar imágenes de un cordón atrapado usando un software de imagen (Figura 4). </li><li> Determinar el diámetro de la perla usando el software de imágenes basada en el método centroide. </li><li> Repita este procedimiento para determinar diámetros de granos de diferente tamaño. </li><li> Montar los diámetros medidos y conocidas de las perlas mediante una regresión lineal para obtener el tamaño físico de un píxel. </li></ol></li><li> Verifique Distancia Calibración <ol><li> Utilice la trampa óptica para atrapar un cordón. </li><li> Determine la posición de píxel de su centro de gravedad por el software de captura de imágenes y grabar su posición usando los Minitweezers. </li><li> Dirigir el talón a dife<html> alquilar posiciones y repetir la determinación de la posición. </li><li> Convertir las posiciones X e Y de la perla de los píxeles a la unidad de m usando el tamaño de píxel calibrado. </li><li> Comparar la X e Y entre las posiciones medidas por vídeo y por los Minitweezers. Los dos conjuntos de valores deben estar de acuerdo. A medida que la resolución de la imagen es de&gt; 0,1 m, mover el grano más de 1 m entre las medidas para asegurar la exactitud. Si la calibración de la distancia no es comparable a la que está almacenada en los Minitweezers, vuelva a calibrar el instrumento. </li></ol></li><li> Trampa Rigidez Calibración <ol><li> Capturar un cordón usando la trampa óptica y mantenerla quieta. </li><li> Registre la fuerza de la trampa usando una adquisición de datos rápida derivación a una velocidad&gt; 5 kHz durante 3 segundos. </li><li> Generar un espectro de potencia de la grabación del movimiento de talón utilizando el software. Montar el espectro de potencia de un Lorentz (Figura 5) 38: 542 / 51542eq1.jpg &quot;width =&quot; 200 &quot;/&gt; (Eq. 1) en la que S (f) es la potencia en la frecuencia de f, f c es la frecuencia de corte, y S 0 es la potencia asintótica. La frecuencia de esquina, f c, es la frecuencia donde el poder de movimiento térmico ha disminuido a la mitad del valor asintótico. Como f c varía con la potencia del láser y el tamaño del grano, calibre cada talón atrapados individualmente. </li><li> Calcular la constante de resorte de la trampa, κ, desde f c: <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq2.jpg" width="100" /> (Ec. 2) en la que γ es el coeficiente de arrastre de la perla (. ecuación 3). Utilice la constante del resorte para determinar los cambios de extensión de un ARN de cambio vigente. </li></ol></li><li> Prueba de la Ley de Stokes <ol><li> Capturar un cordón usando la trampa óptica. Mueva el talón hacia atrás y la fuerza a diferente velocidad. </li><li> Registre el movimiento del talón y forzar utilizando los Minitweezers. </li><li> Calcular el radio de la perla. NOTA: La fuerza de rozamiento, F d, generada por el movimiento de una partícula esférica en un fluido puede ser descrita por la ley de Stokes: <img alt="Ecuación 3" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/51542/51542eq3.jpg" width="150" /> (. La ecuación 3) en la que r es el radio de la esfera, v es la velocidad, y h es la viscosidad dinámica del fluido, que se puede encontrar en las tablas de referencia. El uso de la fuerza medida como F d, el radio de la perla puede ser calculado usando la ecuación. 3 (Figura 6) y debe estar de acuerdo con el determinado por el software de adquisición de imágenes. Prueba de la ley de Stokes pone a prueba de manera efectiva las calibraciones y el rendimiento del instrumento en general. </li></ol></li></ol> 3. Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN <ol><li> Hacer fluidos. <ol><li> Taladre seis agujeros (2 mm de diámetro cada uno) en una cubierta de vidrio No. 2 (Figura 7a) y cortar tres ranuras (ancho de 2 mm) en la cinta de doble cara poliimida (Figura 7b) usando un grabador láser. </li><li> Hacer una cámara de flujo intercalando dos de vidrio cubierta con dos capas de cinta de doble cara Kapton. Inserte una micropipeta y dos tubos de derivación entre la cinta (Figura 7c). </li><li> Montar la cámara de flujo sobre una estructura de metal, haciendo coincidir los agujeros de fluidos (Figura 7d). </li><li> Conecte los canales fluidos de la cámara a 10 ml jeringas llenas con tampón de elección a través de tubos de polietileno (Figura 7e). </li><li> Montar toda la cámara sobre las pinzas ópticas entre los dos objetivos. Asegúrese de que el lado frontal de la cámara con los canales fluídicos se enfrenta a la derecha. Repliegue el objetivo correcto y conecte las clavijas de bronce del bastidor (Figura 7e) para agujeros de montaje en tél pinzas. Apriete los tornillos para fijar la posición de la cámara. </li></ol></li><li> La mezcla de la muestra y perlas de recocido. Mezclar la muestra recocida con perlas recubiertas con anti-digoxigenina (DIG-perlas), y dejar que la mezcla para permanecer a temperatura ambiente durante 5-10 min. Típicamente, 1 l de muestra recocida se mezcla con 5 l DIG-perlas en 1 ml de tampón. NOTA: La cantidad de los granos que se carga en la cámara de flujo se debe elegir para asegurar una cantidad razonable de las cuentas que se entregarán a partir del tubo de derivación. La relación de la muestra recocida a las perlas no se puede cuantificar fácilmente. En un caso ideal, la mayoría de los granos no tienen ARN de tal manera que sólo una pequeña fracción de las perlas puede tener sólo una molécula de ARN por perla. Como las muestras recocidas y la suspensión de cuentas son difíciles de cuantificar, la mejor y única manera actualmente es variar la proporción de mezcla y probar la mezcla de las pinzas. </li><li> Entregar perlas para el sitio de reacción en la cámara de flujo (es decir, unos pocos micrómetros en la parte superior de la micropipette punta, Figura 7c). <ol><li> Cargue una suspensión de perlas recubiertas con estreptavidina (strep-perlas) en una jeringa de 1 ml. </li><li> Conectar la jeringa al tubo de fluido que conduce a la parte inferior del canal de la cámara de flujo (Figura 7a). </li><li> Empuje la jeringa a fluir los estreptococos-cuentas en la cámara. </li><li> Mueva toda la cámara utilizando el software de control del motor para colocar la trampa óptica cerca de la abertura del tubo de derivación inferior (Figura 7b). Entonces operar la trampa óptica por un trackball para capturar un strep-perla. </li><li> Mueva el cordón cerca de la punta de la micropipeta mediante el software de control del motor. </li><li> Tire de la jeringa conectada a la micropipeta a chupar la gota sobre la micropipeta. </li><li> Aplicar flujo presionando suavemente la jeringa para el canal central para eliminar perlas de Strep-extra. </li><li> Del mismo modo, suministrar la mezcla de la muestra y los dig-cuentas (véase el paso 3.2) en el canal superior de la cámara. </li><li> Capturar una dig-talón y lo acercan a la strep-grano utilizando la trampa óptica. </li><li> Limpie el canal central mediante la aplicación de flujo. NOTA: El estreptocócica y DIG-cuentas son elegidos para ser de diferentes tamaños para que puedan distinguirse visualmente bajo la visión microscópica (Figura 4). </li></ol></li><li> Pesca &quot;una sola molécula de inmovilización entre un par de talones. <ol><li> Coloque la dig-bead verticalmente en la parte superior de la Strep-talón (Figura 4). </li><li> Mueva la dig-talón hacia el strep-grano dirigiendo la trampa. Abra una ventana gráfica fuerza-distancia en el ordenador para visualizar los cambios de fuerza. </li><li> Tras el contacto de los dos talones, mover la dig-bead verticalmente lejos de la Strep-perla. </li><li> Si no se realiza ningún contacto específico, la fuerza se mantiene casi cero. Si los dos talones están conectados por las moléculas, la fuerza aumenta significativamente cuando los dos talones separados. Este procedimiento, conocido comúnmente como &quot;pesca&quot;, es a menudo perfOrmed varias veces en cada par de talones para encontrar un amarre efectivo de una sola molécula. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<html> Modificación y resolución de problemas en la preparación de muestras Tweezing Elección de clonación del vector. Aunque el esquema general descrito aquí (Figura 3) no requiere un vector de clonación especial, se prefiere el vector no tener T7 intrínseca o promotor T3 para la facilidad de la transcripción de tal manera que un promotor puede ser introducido a través de PCR en las posiciones deseadas. Sec...

El desarrollo de la técnica de las pinzas ópticas mucho tiempo se ha acompañado de su aplicación en la investigación biológica. Cuando el efecto de atrapamiento óptico fue descubierto por primera vez, Arthur Ashkin observó que las bacterias en el agua contaminada podrían quedar atrapados en el foco de láser 1. Desde entonces, las bacterias trapping se ha convertido en una, divertido experimento no intencional para las generaciones de estudiantes biofísica, así como una herramienta de investigación serio para estudiar la fisiología microbiana 2,3. La técnica de captura óptica utiliza rayo láser enfocado para inmovilizar un objeto microscópico 1. Prácticamente, una Trampa de láser funciona como un resorte óptico, que también mide la fuerza (F) en el objeto atrapado por su desplazamiento desde el centro de la trampa (Delta X). Dentro de un corto rango, F = κ x Delta X, en κ es la constante del resorte de la trampa. La trampa óptica se puede utilizar para ejercer la fuerza en picoNewton (PN) a una precisión microsobjeto copic y medir su posición con nanómetros (nm) de precisión. En las últimas dos décadas, las pinzas ópticas se han convertido en una de las técnicas de una sola molécula más utilizados en biofísica. La técnica se ha empleado para estudiar el plegado y la mecánica de ADN 4-6, 7-9 ARN, y proteínas 10,11. Las pinzas ópticas también se han utilizado para observar la replicación del ADN 12, la transcripción del RNA 13, y la síntesis de proteínas 14,15, así como muchos otros eventos biomoleculares 16-18. Se emplean enfoques sola molécula en investigación estructural ARN principalmente para explorar el paisaje de energía plegable resistente de ARN. Una secuencia de ARN normalmente puede plegarse en múltiples estructuras estables, mutuamente excluyentes, debido a la composición química y de pelado de base de reglas simples de ARN. Durante mucho tiempo se ha sabido que el ARN polimorfismo estructural, como la que se produce en riboswitches 19,20, juega un papel importante en la regulación génica. Una recent encuesta en todo el genoma ha revelado que las variaciones de temperatura de hasta unos pocos grados influyen en gran medida la estructura y la síntesis de proteínas de una gran parte del transcriptoma celular 21. Este ejemplo sugiere que el papel biológico de ARN plegables alternativa es tal vez más importante y generalizada que se suponía. Polimorfismo estructural, sin embargo, plantea un desafío para los enfoques bioquímicos y biofísicos tradicionales, que examinan las propiedades promedio de muchas moléculas. Por ejemplo, el &quot;on&quot; y conformaciones &quot;off&quot; de un riboswitch son mutuamente excluyentes. Una estructura de un promedio de derivado de estructuras heterogéneas no es probable que se asemejan a cualquiera de los confórmeros biológicamente relevantes. Por otra parte, ARN no traducido del ARNm y generalmente se forman estructuras. Su interacción con las proteínas y ARNs reguladores comúnmente requiere despliegue de la estructura existente como parte de la interacción. Por lo tanto, el estudio de RNA de desplegamiento / replegamiento se convierte en un pertinentecuestión de la biología de ARN. Para afrontar este reto, el enfoque de una sola molécula se ha empleado para desentrañar ARN polimorfismo estructural mediante el estudio de una molécula a la vez 22-27. En comparación con el método de fluorescencia de una sola molécula popular, pinzas basados ​​despliegue mecánico ofrece la ventaja de que las conformaciones de las moléculas individuales se pueden manipular por la fuerza aplicada y ser medidos con precisión nanométrica. Esta capacidad nanomanipulación puede ser utilizado para controlar el despliegue / plegado de dominios estructurales individuales tales que el plegado jerárquica de un gran ARN puede ser disecado 28. Alternativamente, una sola hebra puede ser dirigida a plegarse en uno de varios confórmeros; o una estructura existente puede ser inducida mecánicamente a replegarse en una conformación diferente 29. Bajo condiciones biológicas, una estructura de ARN puede ser alterado al cambiar la temperatura o la unión del ligando. La capacidad de manipular directamente s molecularestructure abre un nuevo espacio de estudio estructural del ARN. En principio, otras técnicas mecánicas, tales como microscopio de fuerza atómica y pinzas magnéticas, también se pueden utilizar para estudiar el plegado de las moléculas de ARN individuales. Sin embargo, tales aplicaciones se limitan en gran parte debido a la relativamente baja resolución espacial 30. El empleo de pinzas ópticas permite estructuras de ARN que se desplegaron por la fuerza mecánica. La ventaja de mecánica despliegue es varias veces. La fuerza puede ser utilizado para desplegar tanto estructuras secundarias y terciarias, mientras que los iones de metal y ligando inducida plegado se limitan principalmente a estructuras terciarias. La temperatura y la desnaturalizante pueden afectar significativamente las actividades de agua y solutos. En contraste, la fuerza se aplica localmente para perturbar las estructuras moleculares; el efecto de la fuerza sobre el medio ambiente circundante es despreciable. Además, se utiliza mejor de fusión térmico para estudiar la termodinámica de plegado de las pequeñas estructuras de ARN,mientras que las pinzas ópticas se han utilizado para estudiar las estructuras de ARN con diversos tamaños, que van desde un tetraloop horquilla de siete pares de bases 28 a un ribozima 400-31 nucleótidos. Además, las estructuras de ARN se pueden desplegar mecánicamente a temperaturas mesófilas. En contraste, se desarrolle ARN en un experimento de fusión térmica, la temperatura se eleva típicamente muy por encima de las temperaturas fisiológicas, lo que aumenta significativamente la hidrólisis de ARN, especialmente en presencia de iones Mg 2 +. Es importante señalar que el efecto mecánico de la fuerza depende de cómo se aplica a una estructura. La fuerza aplicada inclina el plegado panorama energético. Por ejemplo, cuando se aplica una fuerza a una horquilla, los pares de bases se rompen secuencialmente, uno a la vez (Figura 1a). El tenedor rasga progresa a lo largo del eje de la hélice, que es perpendicular a la fuerza aplicada. En contraste, cuando un complejo mínima besos está bajo tensión, los dos besarpares de bases, que son paralelas a la fuerza aplicada, comparten la carga de fuerza (figura 1b). Las diferentes geometrías de la horquilla y besar complejo relativa al resultado fuerza aplicada en su diferente respuesta mecánica, que puede ser utilizado para distinguir plegado secundaria y terciaria 28,32. El aspecto teórico de la mecánica despliegue ha sido revisado previamente 8,9,30. Este trabajo describe los enfoques básicos para configurar y realizar una sola molécula de ensayo de desarrollo mecánico. Configuración Experimental. En nuestro experimento tracción mecánica, la muestra de ARN para la depilación con pinzas consiste en el ARN de interés flanqueada por dos asas de doble hebra de ADN / ARN (Figura 2) 7. La molécula entera puede ser atado a dos perlas de micras de tamaño con recubrimiento de superficie (Spherotech) a través de estreptavidina-biotina y digoxigenina interacciones anticuerpo-anti-digoxigenina, respectivamente. Un grano está en manos de un tr óptico de medición de fuerzaap, mientras que el otro se mantiene en la punta de una micropipeta. La distancia relativa entre las perlas se puede cambiar por cualquiera de dirigir la trampa o mover la micropipeta. Usando este enfoque, una sola molécula de ARN tethering las perlas puede ser estirado y relajado. Preparación de las muestras. La síntesis de RNA de muestras para la depilación con pinzas incluye algunos pasos (Figura 3). En primer lugar, la secuencia de ADN correspondiente al ARN de interés se clona primero en un vector plasmídico. A continuación, tres reacciones de PCR se llevan a cabo para generar las dos asas y una plantilla para la transcripción. La plantilla de la transcripción abarca las regiones de la manija y las secuencias insertadas. El ARN de longitud completa se sintetiza por transcripción in vitro. Por último, el ARN y las manijas modificados químicamente son recocidos juntos para generar las moléculas para la depilación con pinzas. Calibración y Operación de pinzas. El diseño básico de la utilización Minitweezersd en este trabajo se desprende que de las pinzas ópticas de doble haz 33. Con muchas mejoras, los Minitweezers mostrar una estabilidad extraordinaria en comparación con las pinzas ópticas primera generación. Un número de grupos de investigación en varios países utilizan las Minitweezers en sus investigaciones de una sola molécula 14,15,34-37. Los detalles de construcción, calibración y operación del dispositivo, incluyendo videos de instrucción, están disponibles en el sitio web &quot;Pinzas Lab&quot; (http://tweezerslab.unipr.it). Aquí, las mejoras y los procedimientos de calibración que deban llevarse a cabo en bases diarias se describen en detalle.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Minitweezers</td>
			<td style="width:211px;">Steven B. Smith Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"><a href="http://tweezerslab.unipr.it/">http://tweezerslab.unipr.it</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Data acquisition card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">USB-6351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Video card</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">PCI-1407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Labview programming software</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">NI Vision Builder</td>
			<td style="width:211px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Laser engraver</td>
			<td style="width:211px;">Epilogue laser systems</td>
			<td style="width:119px;">Zing-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:211px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">MEGAscript T7 kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">MEGAclear kit</td>
			<td style="width:211px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Biotin-11-UTP</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td>FERR0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">T4 DNA polymerase</td>
			<td style="width:211px;">New England Labs</td>
			<td style="width:119px;">M0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">Streptavidin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">SVP-20-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Antidigoxigenin coated microsphere</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">DIGP-20-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Size standard microspheres</td>
			<td style="width:211px;">Spherotech</td>
			<td style="width:119px;">PPS-6K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Kapton tape</td>
			<td style="width:211px;">Kaptontape.com</td>
			<td>KPPTDE-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">No. 2 cover glass</td>
			<td style="width:211px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-543D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanomanipulation of single rna molecules by optical tweezers

Una gran parte del genoma humano se transcribe pero no se traduce. En esta era post genómica, las funciones de regulación de ARN se ha demostrado ser cada vez más importante. Como la función del ARN a menudo depende de su capacidad para adoptar estructuras alternativas, es difícil predecir de ARN estructuras tridimensionales directamente de secuencia. Single-molécula se acerca mostrar potenciales para resolver el problema de la ARN polimorfismo estructural mediante el control de las estructuras moleculares de una molécula a la vez. Este trabajo presenta un método para manipular con precisión el plegamiento y la estructura de las moléculas de ARN individuales utilizando pinzas ópticas. En primer lugar, los métodos para sintetizar moléculas adecuadas para una sola molécula trabajo mecánico se describen. Se discuten, varios procedimientos de calibración siguientes para garantizar las operaciones propias de las pinzas ópticas. A continuación, se explican varios experimentos. Para demostrar la utilidad de la técnica, los resultados de desplegar mecánicamente horquillas de ARN y un único ARN kissing complejo se utilizan como evidencia. En estos ejemplos, se utilizó la técnica nanomanipulación para estudiar el plegado de cada dominio estructural, incluyendo secundaria y terciaria, de forma independiente. Por último, se discuten las limitaciones y futuras aplicaciones del método.

Limitado por el espacio, nanomanipulación de moléculas de ARN individuales se demuestra mostrando sólo ejemplos mecánicos se desarrollan de ARN horquillas y un ARN con estructura terciaria. Manipular Individual horquilla moléculas Una vez que se estableció una correa de sujeción entre las perlas, la extensión y la fuerza de sujeción en el se pueden manipular usando un protocolo definido por el usuario. Cuatro protocolos de manipulación ...

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Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

nanomanipulation-of-single-rna-molecules-by-optical-tweezers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K vistas.  University at Albany, State University of New York. Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules. 

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Investigación

Bioingeniería

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Estiramiento secuencias cortas de ADN con fuerza constante pinzas axial óptico

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology, with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 and wound healing3. In each of these examples, cells both exert force on their surroundings and simultaneously enzymatically remodel the extracellular matrix (ECM). The effect of forces on ECM has thus become an area of considerable interest due to its likely biological and medical importance4-7.
	Single molecule techniques such as optical trapping8, atomic force microscopy9, and magnetic tweezers10,11 allow researchers to probe the function of enzymes at a molecular level by exerting forces on individual proteins. Of these techniques, magnetic tweezers (MT) are notable for their low cost and high throughput. MT exert forces in the range of ~1-100 pN and can provide millisecond temporal resolution, qualities that are well matched to the study of enzyme mechanism at the single-molecule level12. Here we report a highly parallelizable MT assay to study the effect of force on the proteolysis of single protein molecules. We present the specific example of the proteolysis of a trimeric collagen peptide by matrix metalloproteinase 1 (MMP-1); however, this assay can be easily adapted to study other substrates and proteases.

In this article we describe the use of magnetic tweezers to study the effect of force on enzymatic proteolysis at the single molecule level in a highly parallelizable manner.

Multiplexado de una sola molécula de mediciones de la Fuerza proteólisis utilizando pinzas magnéticas

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

La síntesis in vitro de Espaciado nativo, y colágeno fibroso Long Long segmentaria Espaciado

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

El uso de biosensores ópticos sin etiqueta para Detectar la modulación de los canales de potasio por la proteína G-receptores acoplados

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques include so-called force spectroscopy approaches such as atomic force microscopy, optical tweezers, flow stretching, and magnetic tweezers. Amongst these approaches, magnetic tweezers have distinguished themselves by their ability to apply torque while maintaining a constant stretching force. Here, it is illustrated how such a &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers experimental configuration can, through a straightforward modification of its field configuration to minimize the magnitude of the transverse field, be adapted to measure the degree of twist in a biological molecule. The resulting configuration is termed the freely-orbiting magnetic tweezers. Additionally, it is shown how further modification of the field configuration can yield a transverse field with a magnitude intermediate between that of the &#8220;conventional&#8221; magnetic tweezers and the freely-orbiting magnetic tweezers, which makes it possible to directly measure the torque stored in a biological molecule. This configuration is termed the magnetic torque tweezers. The accompanying video explains in detail how the conversion of conventional magnetic tweezers into freely-orbiting magnetic tweezers and magnetic torque tweezers can be accomplished, and demonstrates the use of these techniques. These adaptations maintain all the strengths of conventional magnetic tweezers while greatly expanding the versatility of this powerful instrument.

Magnetic tweezers, a powerful single-molecule manipulation technique, can be adapted for the direct measurements of the twist (using a configuration called freely-orbiting magnetic tweezers) and torque (using a configuration termed magnetic torque tweezers) in biological macromolecules. Guidelines for performing such measurements are given, including applications to the study of DNA and associated nucleo-protein filaments.

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Single-molecule techniques make it possible to investigate the behavior of individual biological molecules in solution in real time. These techniques ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluorescencia Biomembranas Fuerza Sonda: La cuantificación simultánea de Cinética-Receptor ligando y encuadernación inducida Señalización Intracelular en una sola célula

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Individual Detección Molecule-Label gratis con Microtoroid ópticos Resonadores

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated polymers display several optimal properties as substrates for biological systems, such as good biocompatibility, excellent mechanical properties, cheap and easy processing technology, and possibility of deposition on light, thin and flexible substrates. These materials have been employed for cellular interfaces like neural probes, transistors for excitation and recording of neural activity, biosensors and actuators for drug release. Recent experiments have also demonstrated the possibility to use conjugated polymers for all-optical modulation of the electrical activity of cells. Several in-vitro study cases have been reported, including primary neuronal networks, astrocytes and secondary line cells. Moreover, signal photo-transduction mediated by organic polymers has been shown to restore light sensitivity in degenerated retinas, suggesting that these devices may be used for artificial retinal prosthesis in the future. All in all, light sensitive conjugated polymers represent a new approach for optical modulation of cellular activity.
In this work, all the steps required to fabricate a bio-polymer interface for optical excitation of living cells are described. The function of the active interface is to transduce the light stimulus into a modulation of the cell membrane potential. As a study case, useful for in-vitro studies, a polythiophene thin film is used as the functional, light absorbing layer, and Human Embryonic Kidney (HEK-293) cells are employed as the biological component of the interface. Practical examples of successful control of the cell membrane potential upon stimulation with light pulses of different duration are provided. In particular, it is shown that both depolarizing and hyperpolarizing effects on the cell membrane can be achieved depending on the duration of the light stimulus. The reported protocol is of general validity and can be straightforwardly extended to other biological preparations.

A method for stimulation of in-vitro cell cultures electrical activity with visible light, based on the use of organic semiconducting polymers is described.

Control óptico de células vivas Actividad Eléctrica por conjugadas Polímeros

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...