Los autores agradecen a Victoria Carpintero por sus comentarios críticos de este protocolo.

Parte I - RNAi mediada desmontables gen en los mosquitos adultos Aedes aegypti. Para panorama experimento véase la figura 1. 1. dsRNA Síntesis <ol><li> Sintetizar ARN de doble cadena específicos contra de los genes de ARN de doble cadena de interés y el control. Nota: Se recomienda cebadores en desarrollo para fragmentos de PCR en el intervalo de 300 a 500 pares de bases situadas en el extremo 3 &#39;del ADNc específico y 2 con la secuencia del cebador T7 unido en el extremo 5&#39; (5&#39;-TAA TAC CAG TCA CTA TAG GG-3 &#39;). Singularidad de los fragmentos debe ser confirmado por análisis de BLASTN 3. </li><li> Utilice la Ambion Megascript T7 Alto Rendimiento Kit de transcripción (Ambion, tabla de reactivos) que utiliza la RNA polimerasa T7 para la reacción de transcripción para sintetizar ARN bicatenario. Nota: Los reactivos similares y kits están disponibles en otros lugares. </li><li> Para purificar el ARN bicatenario, precipitar con cloruro de litio siguiendo las instrucciones con el kit de Megascript. </li><li> Después de purificatiónico, disolver el precipitado dsRNA en agua estéril. Para asegurar una viscosidad adecuada para la microinyección, la concentración de ARN bicatenario no debe exceder de 2 g / l. </li></ol> 2. Preparación de la inyección <ol><li> Un simple inyector micro puede ser construido mediante el uso de tubos, tijeras, una aguja de metal, una jeringa de 1 ml y 1 ml de una pipeta de plástico de punta (ver Figura 2). El tubo debe ser cortado a ~ 40 cm de longitud. Alternativamente, un inyector automático de micro se puede utilizar como Drummond Nanojet II 4. <ol><li> Cortar la punta de la jeringa (cubo de la aguja) en 2 ml de marca de la escala y retirar la cabeza del émbolo de caucho del émbolo. </li><li> Haz un agujero con una aguja de metal en la cabeza del émbolo de caucho y el lugar de la cabeza del émbolo de caucho de nuevo en el cubo de la aguja. </li><li> Coloque el cubo de la aguja en un extremo de la tubería y colocar un 1 ml de punta de pipeta de plástico en el otro extremo, que se utiliza como la boquilla (alternativamente, un 10 ml SyRinge puede ser utilizado para producir la presión de aire necesaria para inyección). </li></ol></li><li> Colocar una aguja capilar de vidrio en el agujero en la cabeza del émbolo de caucho y romper la punta de la aguja de modo que el ancho es lo suficientemente grande para el líquido fluya a través. Nota: El tamaño óptimo de la punta de la aguja tiene que ser determinada empíricamente - si el ancho de la aguja es demasiado grande esto dará lugar a un trauma y una alta tasa de mortalidad de mosquitos, si la anchura de la aguja es demasiado pequeña, será imposible penetrar el exoesqueleto del mosquito. </li><li> Sumerja la aguja de inyección de la muestra preparada dsRNA y extraer la muestra de líquido en la aguja de inyección por la succión del líquido con la pieza en la boca (o una jeringa). Nota: Este paso es idéntica para todos los reactivos líquidos que se inyectan en los mosquitos, incluyendo tampón PBS, que se utiliza en el protocolo de ensayo in vivo la diuresis (véase más adelante). </li></ol> 3. Recoger y Anestesie mosquitos <ol><li> Colectat los mosquitos con un aspirador de potencia de la batería en un vial de recolección. Coloque una tapa sobre el tubo de recolección y coloque el frasco en una plataforma de CO 2 limpia para anestesiar a los mosquitos. Nota: También los mosquitos pueden ser anestesiados en el hielo. </li></ol> 4. Mosquito de inyección <ol><li> Abra el tubo de recolección y colocar los mosquitos directamente en la plataforma de CO 2 y espere a que los mosquitos que están anestesiadas. </li><li> Deseche todos los hombres. </li><li> Alinear los mosquitos en el lado para permitir un acceso más fácil para la inyección. </li><li> Coge los mosquitos por las patas o alas para evitar lesiones. También puede utilizar un pincel fino o una pluma para manipular los mosquitos. </li><li> Cuando esté listo para inyectar el mosquito primero, suavemente apoyar un lado del tórax con las pinzas e insertar la punta de la aguja en el otro lado del tórax (Figura 2). Es mejor inyectar en una porción delgada de la cutícula y no empujar la aguja ao profunda en el tórax. </li><li> Una vez que la aguja está en su lugar, sople el líquido en el mosquito. La cantidad deseada se puede determinar mediante la supervisión del menisco de líquido en la aguja. El número de milímetros necesarios para un volumen específico se puede determinar calculando el volumen del cilindro de la aguja capilar de vidrio (πr 2 h). La cantidad efectiva de dsRNA que se utiliza típicamente para la inyección es 1 g. </li><li> Una vez que el líquido se inyecta en los mosquitos, cuidadosamente retraer la aguja. Si se forma un líquido grandes gotas sobre la parte exterior del tórax, el mosquito debe ser desechado. A continuación, repita este proceso con el mosquito que viene. </li></ol> 5. Mosquito recuperación y almacenamiento <ol><li> Después de la inyección, colocar los mosquitos en un contenedor para el almacenamiento. Por ejemplo, una cera pinta alineados tazas de cartón (tazas de sopa) con malla revestimiento asegurado con la tapa de cartón. La tapa tiene una porción cortada para la malla que cubre a estar expuesto. Una vez que todo el MOsquitoes se colocan en el recipiente, colocar el recipiente en una cámara de ambiente controlado para la incubación y proporcionar a los mosquitos con una fuente de alimento, tales como bolas de sacarosa al 20% de algodón empapado colocados en la parte superior de la cubierta de malla. Antes de realizar el ensayo de la diuresis vivo, privar a los mosquitos dsRNA inyección de una fuente de agua durante 12 horas para normalizar el estado de hidratación de cada mosquito. </li><li> La eficiencia de gen desmontables dsRNA mediada puede ser variable. El silenciamiento génico podría comenzar un día después de la inyección y puede durar hasta 6 días después de la inyección 4. El tiempo óptimo para alcanzar gen desmontables máxima tiene que ser determinada empíricamente para cada gen utilizado. Generalmente, esperar 3 días después de la inyección de dsRNA antes de proceder. </li></ol> Parte II - En el ensayo de la diuresis vivo en adultos del mosquito Aedes aegypti Nota: Este protocolo ha sido desarrollado por los autores yutilizado para RNAi mediada desmontables de las proteínas acuaporinas en el mosquito de la fiebre amarilla Aedes aegypti 1. Para evitar la variabilidad entre los mosquitos individuales, los mosquitos deben ser analizados en los grupos. Por razones técnicas, se recomienda grupos de 5 mosquitos por el tratamiento - no hay una cantidad limitada de tiempo para realizar la medición de peso antes de los mosquitos comienzan a excretar la orina después de la inyección. 6. Recoger y Anestesie mosquitos <ol><li> Antes de la recolección de los mosquitos, registrar el peso de un frasco de colección vacía con una tapa con una balanza de precisión analítica. Este vial se utilizará para todas las mediciones subsiguientes. </li><li> Recoger 5 mosquitos hembra en el vial colección pesaron con un aspirador. Coloque la tapa sobre el tubo de recolección y dejar que repose en la plataforma de CO 2 durante varios segundos para anestesiar a los mosquitos. </li></ol> 7. Medición de peso inicial <ol><li> Tome tque la medición del peso inicial de los 5 mosquitos colocando el vial de recogida que contiene los mosquitos con la tapa en la balanza de precisión. </li><li> Calcular el peso del grupo de 5 mosquitos tomando el peso de los mosquitos y el vial de recogida con el casquillo y restando el peso del frasco con tapa colección vacía. </li><li> Abra el tubo de recolección y colocar los mosquitos directamente en la plataforma de CO 2 después de registrar el peso de los mosquitos. Si los mosquitos están empezando a despertar en las mediciones de peso, dejar reposar el vial en la plataforma de CO 2 durante varios segundos antes de abrirlo y colocar a los mosquitos en el teclado. </li></ol> 8. Preparación de la inyección <ol><li> Configure el inyector de micro siguiendo las instrucciones que figuran en el protocolo de genes mediante RNAi desmontables. </li><li> Colocar una aguja capilar de vidrio en el inyector de micro y romper la punta de la aguja de modo que el ancho es lo suficientemente grande para liquid para fluir a través. </li><li> Sumergir la aguja en tampón PBS y extraer el tampón en la aguja de inyección, la cantidad deseada a utilizar para este protocolo es de 1,25 l de PBS por cada mosquito. Nota: Esta cantidad imita la cantidad media de plasma de la sangre que se toma por un mosquito hembra 5. </li></ol> 9. Mosquito de inyección <ol><li> Alinear los mosquitos para permitir un acceso más fácil con el inyector de micro. </li><li> Una vez que la aguja está en su lugar, un golpe de tampón PBS en el mosquito. </li><li> Una vez que el líquido se inyecta en el mosquito, una gotita podría formar en la parte exterior del tórax. Este gota tiene que ser cuidadosamente eliminado antes de la etapa siguiente. </li><li> Repita este proceso de inyección con el mosquito que viene. Con la experiencia, la tasa de supervivencia de los mosquitos será casi el 100% después de la inyección. </li></ol> 10. Los mosquitos de pesaje <ol><li> Después de la inyección, coloque suavemente los mosquitos en el tubo de recoleccióny la tapa. Tomar la primera medición del peso de los 5 mosquitos colocando el vial de colección que contiene los mosquitos con la tapa en la balanza de precisión. </li><li> Calcular el peso del grupo de 5 mosquitos tomando el peso de los mosquitos y el vial de recogida con tapa y restar el peso del frasco con tapa colección vacía. Nota: los mosquitos comienzan a excretar la orina a los 2 minutos después de la eliminación de la almohadilla de la anestesia de CO 2, lo que es importante para tomar la medida de peso antes de comenzar a excretar. </li><li> Coloque los mosquitos en un pequeño recipiente donde se comienzan a excretar orina. </li></ol> 11. La segunda y subsiguientes mediciones de peso Nota: las mediciones de peso de los mosquitos se debe tomar en intervalos de 30 minutos, pero esto se puede ajustar a intervalos cortos o más largos, dependiendo de las tasas de excreción. <ol><li> Después de 30 minutos, recoge el Grouwp de 5 mosquitos con un aspirador en el vial de la misma colección con tapa. Tomar la medición siguiente peso de los mosquitos, colocando el vial colección que contiene los mosquitos con la tapa en la balanza de precisión. </li><li> Después de la medición, colocar los mosquitos en el contenedor misma explotación para los próximos 30 minutos. </li><li> Repetir este proceso para una cantidad de tiempo deseado. </li></ol> 12. Mosquito La determinación de la tasa de excreción <ol><li> La cantidad total de líquido que se inyecta en el grupo de 5 mosquitos puede ser calculado restando el peso inicial de los mosquitos a partir del peso inmediatamente después de la inyección. </li><li> La cantidad de orina que se excreta por el grupo de mosquitos en un punto específico de tiempo puede ser calculado restando el peso inicial de los mosquitos desde el peso de los mosquitos en el punto de tiempo específico. </li><li> La tasa de excreción en un punto específico de tiempo puede ser calculado por divisiónrepique la cantidad de orina excretada en este punto de tiempo por la cantidad total de líquido inyectado (Tabla 1). </li></ol> 13. Los resultados representativos RNAi mediada desmontables gen y en el ensayo de la diuresis in vivo han sido utilizados por el laboratorio de Hansen para estudiar los efectos de las acuaporinas en la diuresis Aedes aegypti mosquito. Tres acuaporinas que se expresan en los túbulos de Malpighi Aedes aegypti fueron derribados con efectos significativos en las tasas de excreción en comparación con el control de mosquitos 1. La figura 4 muestra los resultados representativos de un experimento en el que ha sido el ensayo de la diuresis utiliza para comparar las tasas de excreción entre el Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus a diferentes temperaturas. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diagrama de flujo del ensayo ARNi / diuresis. 5 grupos de 10 mosquitos eaCH son inyectados con ARNdc para un gen específico y otros cinco grupos de diez mosquitos son inyectados con el control dsRNA. Otro grupo de mosquitos inyectados con 200 HgCl 2 mM en PBS se utiliza como control positivo. Estos mosquitos se pesan antes de la inyección, y después de la inyección en intervalos de treinta minutos durante 3 horas. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un sencillo dispositivo de inyección de micro para la caída del gen mediante RNAi y en el ensayo de la diuresis vivo. A. Las agujas capilares de vidrio utilizada para la inyección. El triángulo gris representa los incrementos milimétricas dibujadas en la aguja para indicar la cantidad de inyección de líquido en el mosquito. B. 1 ml jeringa utilizada para construir el inyector de micro. El triángulo blanco representa el cubo de la aguja y el triángulo negro representa la cabeza del émbolo de goma en el émbolo de la jeringa. C. El tubo utilizado para fijar la boquilla parael inyector. D. 1 ml punta de la pipeta desechable (punta azul) que se utiliza como la boquilla del dispositivo de microinyección. E. El dispositivo de microinyección que incorpora partes de AD. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Mosquitos óptimo lugar de la inyección. A. Mujer mosquito Aedes aegypti inyecta con una aguja capilar de vidrio entre las grandes escalas en el tórax. La barra de color negro indica 1 mm para la comparación de tamaño. B. Un dibujo del tórax mosquito hembra y los puntos blancos representan las escamas blancas en el exoesqueleto de los mosquitos. La aguja de inyección debe perforar el mosquito entre los puntos para minimizar la tasa de mortalidad durante la inyección. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Efectos de la temperaturatura de Culex quinquefasciatus y la diuresis Aedes aegypti. El ensayo se llevó a cabo la diuresis con dos especies de mosquitos, Aedes aegypti y Culex quinquefasciatus, a diferentes temperaturas. La tasa de excreción durante la primera hora después de la inyección se da en tanto por ciento. <table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td> TARA (G) </td><td> no inyectada (G) </td><td> después de la inyección (G) </td><td> 1h después de la inyección (G) </td><td> peso medio (mg) </td><td> cantidad inyectada (L) </td><td> cantidad excretada (L) </td><td> % Se excreta </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7,5938 </td><td> 7,6057 </td><td> 7,6104 </td><td> 7,6096 </td><td> 2,38 </td><td> 0,94 </td><td> 0,16 </td><td> 17,0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7,8252 </td><td> 7,8349 </td><td> 7,8415 </td><td> 7,8403 </td><td> 1,94 </td><td> 1,32 </td><td> 0,24 </td><td> 18,2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7,8896 </td><td> 7,9026 </td><td> 7,9077 </td><td> 7,906 </td><td> 2.6 </td><td> 1,02 </td><td> 0,34 </td><td> 33,3 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Aedes aegypti en los resultados de ensayo in vivo de la diuresis. Los datos básicos del ensayo de la diuresis in vivo realizado con el Aedes aegypti hembra del mosquito a 4 ° C.

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	<li>Drake, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aquaporin+gene+family+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 5, e15578 (2010).</li><li>Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+quantitative+PCR+primer+location+for+short+interfering+RNA+efficacy+determination.">Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA efficacy determination.</a> Analytical biochemistry. 344, 287-288 (2005).</li><li>Altschul, S. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes.">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

El protocolo utilizado ARNi se ha desarrollado en el laboratorio de Alexander Raikhel en la Universidad de California Riverside 6,7 y es similar a un protocolo publicado por Garver y Dimopoulos 4. El método experimental se muestra en este protocolo de vídeo puede ser utilizado para estudiar los genes implicados en la diuresis de insectos en un entorno en vivo. Los órganos excretores de los insectos, los tubos de Malpighi, han atraído el interés de las generaciones de investigadores co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo o equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Megascript T7 Kit de Alto Rendimiento </td><td> Ambion, Inc. </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Tampón PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Los tubos de plástico </td><td> Proveedor local </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml de plástico de punta de la pipeta </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Azul extremo </td></tr><tr><td> 1 ml jeringa </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Tijeras </td><td> Proveedor local </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La aguja de metal </td><td> Carolina Productos Biológicos </td><td> 654307 </td&gt; <td> Tamaño 5 </td></tr><tr><td> Fly pad </td><td> Genesee Científico </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Aspirador a pilas w / colección vial </td><td> UPMA Labs </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas de punta fina </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Capilares de vidrio agujas </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección estéreo </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Balanza de precisión analítica </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Sacarosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Una pinta con cera alineados vasos de cartón </td><td> Proveedor local </td><td></td><td> Fabricado tazas de sopa </td></tr><tr><td> Malla de la red </td><td> Proveedor local </td><td></td><td> gasa mosca de plástico </td></tr></tbody></table>

rnai-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female aedes aegypti mosquitoes

Este protocolo vídeo muestra una técnica efectiva para derribar a un determinado gen en un insecto y llevar a cabo un bioensayo de la novela para medir la tasa de excreción. Este método puede utilizarse para obtener una mejor comprensión del proceso de la diuresis en insectos y es especialmente útil en el estudio de la diuresis en los artrópodos se alimentan de sangre que son capaces de tomar grandes cantidades de líquido en un solo harina de sangre. Esta caída de genes mediante RNAi en combinación con un ensayo in vivo la diuresis fue desarrollado por el laboratorio de Hansen para estudiar los efectos de RNAi mediada desmontables de genes acuaporina en Aedes aegypti, mosquito diuresis 1. El protocolo está configurado en dos partes: la primera demostración ilustra cómo construir un dispositivo simple inyección de mosquitos y cómo preparar e inyectar dsRNA en el tórax de los mosquitos para la caída de genes mediante RNAi. La segunda demostración ilustra cómo determinarlas tasas de excreción de los mosquitos utilizando un bioensayo in vivo.

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RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

En este protocolo se combinan RNAi mediada por silenciamiento de los genes con un<em&gt; En vivo</em&gt; Ensayo para estudiar la diuresis desmontables efectos de los genes de interés tiene sobre la excreción de fluido de mosquitos.

RNAi mediada por Gene y Derribo<em&gt; En Vivo</em&gt; Ensayo de diuresis en Mujeres Adultas<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Los mosquitos

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

JoVE Journal

Biology

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

13.5K vistas.  New Mexico State University. En este protocolo se combinan RNAi mediada por silenciamiento de los genes con un En vivo Ensayo para estudiar la diuresis desmontables efectos de los genes de interés tiene sobre la excreción de fluido de mosquitos.

Video: RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

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La inyección de dsRNA en Mujer A. aegypti mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Investigación

Biología

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocolo para las infecciones de dengue en mosquitos (Aedes aegypti) y determinación de fenotipo infección

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Dissection of Midgut and Salivary Glands from Ae. aegypti Mosquitoes

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol demonstrates dissection techniques for removal of the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes. 



The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for vector pathogens like Plasmodium falciparum and the dengue virus. This video demonstrates the dissection techniques for removing the midgut and salivary glands from Aedes aegypti mosquitoes.

La disección de las glándulas salivales y del intestino medio de Ae. aegypti

The mosquito midgut and salivary glands are key entry and exit points for pathogens such as Plasmodium parasites and Dengue viruses. This video protocol ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Usar secuencias de detención SecM como una herramienta para aislar Ribosome polipéptidos enlazados

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter implantation. The technical limitation of this surgical technique lies in the finesse of the hands. The injection is rapid, especially for a trained experimenter, and since tissue disruption with this technique is minimal, repeated injections are possible; moreover immune reaction to foreign tools (e.g. catheter) does not occur, thereby giving a better and more specific read out of spinal cord modulation. Since the application of the substance is largely limited to the target region of the spinal cord, drugs do not need to be applied in large dosages, and more importantly unwanted effects on other tissue, as observed with a systemic delivery, could be circumvented1,2. Moreover, we combine this technique with in vivo transfection of nucleic acid with the help of polyethylenimine (PEI) reagent3, which provides tremendous versatility for studying spinal functions via delivery of pharmacological agents as well as gene, RNA, and protein modulators.

In Vivo SiRNA Transfection and Gene Knockdown in Spinal Cord via Rapid Noninvasive Lumbar Intrathecal Injections in Mice

This report describes a simple and rapid technique of intrathecal needle puncture for a localized transfection of siRNA in the lumbar spinal cord in mouse under short lasting light anesthesia.

En Vivo transfección siRNA y Gene Derribo en la médula espinal a través de Rapid no invasiva lumbar intratecal inyecciones en ratones

This report describes a step-by-step guide to the technique of acute intrathecal needle injections in a noninvasive manner, i.e. independent of catheter ...

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect fat body tissue is usually distributed throughout the insect body. However, it is often concentrated in the abdomen and attached to the abdominal body wall.
The mosquito fat body is the sole source of yolk proteins, which are critical for egg production. Therefore, the in vitro culture of mosquito fat body tissues represents an important system for the study of mosquito physiology, metabolism, and, ultimately, egg production. The fat body culture process begins with the preparation of solutions and reagents, including amino acid stock solutions, Aedes physiological saline salt stock solution (APS), calcium stock solution, and fat body culture medium. The process continues with fat body dissection, followed by an experimental treatment. After treatment, a variety of different analyses can be performed, including RNA sequencing (RNA-Seq), qPCR, Western blots, proteomics, and metabolomics.
In our example experiment, we demonstrate the protocol through the excision and culture of fat bodies from the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, a principal vector of arboviruses including dengue, chikungunya, and Zika. RNA from fat bodies cultured under a physiological condition known to upregulate yolk proteins versus the control were subject to RNA-Seq analysis to demonstrate the potential utility of this procedure for investigations of gene expression.

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

The fat body is the central metabolic organ in insects. We present a live organ culture system that enables the user to study the responses of isolated fat body tissue to various stimuli.

Sistema de cultivo de órganos de grasa corporal en Aedes Aegypti, Vector del Virus Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando 24 placas de cultivo de tejidos de pozos (placas EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...