Agradecemos al Prof. Kazuki Saito en RIKEN PSC y el Dr. Björn Usadel en MPIMP útil para los debates. TT con el apoyo de una beca de la Fundación Alexander von Humboldt.

1. Preparación de la muestra <ol><li> Los materiales vegetales se cosechan y se congela inmediatamente. </li><li> Materiales congelados vegetales en polvo por el molino mezclador (o mortero) y se almacena en Falcon tubo o tubos Eppendorf a -80 ° C. </li></ol> 2. La extracción de perfiles de metabolitos <ol><li> Alícuota congelada material vegetal en un tubo Eppendorf de 2 ml. </li><li> Añadir 5 l de tampón de extracción por miligramo de peso fresco de material vegetal congelado. </li><li> Añadir un metal (o gilconia) pelota y homogeneizar de polvo congelado con el molino mezclador de 2 min a 25 ls-1. </li><li> Centrifugar 10 min a 12.000 rpm. </li><li> Transferir el sobrenadante a NANOSEP filtro centrífugo. </li><li> Centrifugar 2 min a 4.000 rpm. </li><li> Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf nuevo y almacenar a -20 ° C hasta su uso. </li></ol> 3. Metabolito de perfiles por LC-MS <ol><li> Establecer HPLC y compruebe la temperatura del horno de la columna y la bandeja de la muestra. </li><li> Establecer condiciones de MS y comprobar el estado de vacío y calefacción capilar. </li><li> Realizar m / z calibración del detector de MS. </li><li> La transferencia de 50 l de los extractos de vial de vidrio para LC-MS. </li><li> Inyectar 5 ml de los extractos de LC-MS. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Configurar Xcalibur o Metalign 4 y seleccione el análisis de datos para ser procesados. </li><li> Preparar una tabla de los picos detectados de su interés, de acuerdo con la clase de compuesto en la Tabla I. </li><li> Identificar picos por la co-elución de compuestos estándar. </li><li> Anotar detectado picos utilizando MS 2 análisis, estudio de la literatura, la búsqueda de base de datos metabolito (Figura 2, 12,13). </li></ol> 5. Predicción de la vía metabólica <ol><li> Construir un camino posible con compuestos detectados. Predicción de la vía el uso de anotaciones de pico debe basarse en la estructura química del compuesto detectados mediante la predicción de que une las funciones enzimáticas de la vía metabólica 13. Estructuración de la biosíntesis de los pasos deben llevarse a cabo con la anotación máxima precisión. Pero la determinación de la estructura química detallada, por ejemplo resto de azúcar, no es indispensable en este paso, porque la predicción de resto de azúcar y la posición de aducción es muy difícil de identificar por análisis EM. Determinación del tipo de azúcar, tal como hexoside y pentoside serán identificados mediante un ensayo enzimático de donante de azúcar en el último paso del proyecto. Sobre todo la construcción de la predicción de la vía debe realizarse lo más pequeña molécula es más grande intermedio de la molécula, excepto en los casos de algunos, como reacción de deshidratación. Lista de peso molecular atómica, por ejemplo 16 m / z para la diferencia entre-H y-OH resto (oxidación), 14 m / z (el átomo de carbono) por la diferencia entre-OH y-OMe (metilación) y 162 m / z ( MW-H 2 O) para hexosa (glicosilación), es útil para la predicción. Determinación deltipo de modificación con el análisis de correlación de las especificidades de los tejidos ayuda a la predicción de la vía metabólica. Base de datos de la vía metabólica general, como base de datos KEGG ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) y PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), es muy eficaz para la predicción de la vía metabólica de su interés. </li></ol> 6. Preparación de la lista de genes de Arabidopsis con la identificación de genes ortólogos <ol><li> Descargar lista de genes de identificación de la base de datos genómica. </li><li> Añadir Identificación de genes de Arabidopsis genes ortólogos, en el caso de la planta de destino no es la Arabidopsis. </li><li> Prepare una lista de los genes en la vía de interés. Anotación de los datos de la vía de Arabidopsis y los datos de la familia de genes están disponibles en el sitio web TAIR ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Si prepara una lista de genes de Arabidopsis ortólogos, que posteriormente pueden combine ellos. </li></ol> 7. Co-expresó Gene Análisis <ol><li> Pruebe con la lista de genes ID preparado para buscar la mejor base de datos para el control de la vía por la relación con los pares de genes bien conocidos en la vía de interés (Tabla II). Si la co-expresión base de datos o base de datos de expresión de los genes no están disponibles en la planta de su interés, Arabidopsis co-expresión de base de datos se debe utilizar con una lista de Arabidopsis genes ortólogos. En el caso de la cebada, arroz, álamo, trigo, soja y Medicago, co-expresión análisis de las especies de plantas se puede utilizar (Tabla II). </li><li> Construir el marco de su objetivo de co-expresión de red basado en las conexiones de los genes conocidos en su camino de intereses. </li><li> Añadir genes correlacionados candidatos (r &lt;0,4 ~ 0,90, en el valor aproximado del valor de coeficiente de correlación entre las conexiones de los genes conocidos en su camino de intereses) y comprobar su anotación de genes en su prfamilias edicted a las conexiones de esta red para encontrar las mejores genes candidatos (Figura 3). Umbral de valor del coeficiente debe ser coordinado de acuerdo con la estructura de red y la densidad de genes correlacionados. </li><li> Haga una lista de genes que son capaces de reducir el número como especializada para su camino de destino. </li><li> Compruebe la expresión génica de las especificidades de órganos y respuestas de estrés de los genes de sus candidatos. </li></ol> 8. Integración de toda la información para predecir Nuevos Caminos <ol><li> Añadir los genes bien caracterizados que se han utilizado para la consulta de análisis co-expresión de la vía metabólica predicho. </li><li> Revise las partes no caracterizados en esta vía, por ejemplo, no caracterizado pasos enzimáticos, proteínas de transporte y los factores de transcripción. </li><li> Predecir la anotación de genes más adecuados para estos pasos que faltan no caracterizados. </li><li> Combinar los resultados de perfiles metabólicos y genes candidatos de la in silico de GEne expresión basada en la vía prevista. </li><li> Arregle sus genes candidatos en la vía prevista de acuerdo con la función del gen, por ejemplo, para acetiltransferasa acetilado glicosiltransferasa metabolito, por glicósido, P450 para el compuesto oxidado. El análisis filogenético árbol de secuencias de aminoácidos es útil para algunos familia de genes de ancho como P450 y glicosiltransferasa. </li><li> Compruebe la consistencia de las especificidades del tejido o las respuestas de estrés entre la acumulación de metabolitos y la expresión génica de los genes candidatos. </li><li> Verifique las conexiones con el metabolismo de otros genes para proporcionar el sustrato y el estrés de respuesta. </li></ol> 9. Los experimentos para la identificación genética mediante el uso de Bio-recursos <ol><li> Verifique la disponibilidad de los recursos biológicos para la facilitación de la experimentación para la identificación de genes candidatos. </li><li> Lleve a cabo un experimento para la identificación de la función de genes usando los recursos biológicos, tales como KO biblioteca de mutantes y de larga duración biblioteca de cDNA. Texperimenta para la identificación funcional de los genes con la preparación de las plantas de la sobreexpresión y mutantes knock-out, ensayo enzimático de ensayo y promotor de unión, tienen que llevar a cabo para los genes mejores candidatos en su predicción. Ensayo de proteínas recombinantes para la caracterización de las propiedades de la proteína y la preparación de las plantas sobreexpresión mejor para llevar a cabo después de la confirmación de perfil metabolito utilizando KO mutante ya que toma mucho más tiempo para preparar la proteína recombinante y la clonación de genes para la transformación. </li></ol> 10. Los resultados representativos El procedimiento de análisis integrado se describe en este protocolo tiene muchas posibilidades dependiendo del propósito específico experimental y elección de las combinaciones biológicas y analíticas. Elección del procedimiento y el diseño experimental se llevó a cabo correctamente sobre la base de su vía de destino, los compuestos y las especies de plantas. La estrategia de integración descrito en este protocolo es foc<html> utilizada en la anotación de la función de genes de plantas y el descubrimiento de nuevas funciones génicas con un uso eficiente de varios bio-y los datos de los recursos. Resultado esperado se comprometió a proporcionar el único caso de la predicción concluyente. Este hecho indica que si suficientes evidencias no se pueden dar por los perfiles de la combinación, el experimento no se debe iniciar. Por esta razón, en cualquier caso, los experimentos preliminares adicionales, tales como perfiles de expresión génica dirigida por RT-PCR, se puede apoyar a su predicción de la función del gen. La precisión y la exactitud de la predicción se correlaciona más alto dependiendo de la diferencia cualitativa y número de la variación de la combinación. Además, los buenos candidatos y los resultados son válidos sólo puede venir de una predicción precisa de las vías. Anotación de pico debe llevarse a cabo mediante la combinación de varios enfoques, por ejemplo, la encuesta la literatura, el extracto de la planta de referencia, el análisis de MS n, la especificidad de órgano y el análisis de mutantes 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Descripción del flujo experimental de la anotación de genes a través de enfoque combinado. En algunos casos, los proyectos comienzan con el descubrimiento de un pico de la novela que se detecta en condiciones especiales o tejidos, y el deseo de comprender su papel dentro de su metabolismo. En otros casos, el objetivo del proyecto es la identificación de genes o el descubrimiento de los principales factores de regulación, tales como factores de transcripción. Diseño de experimento debe ser cepillada con un conjunto de datos que muestra claras diferencias de los niveles de metabolitos en la vía de destino, utilizando una amplia gama de muestras de tejidos de diferentes órganos, y para las plantas que crecen diferencialmente o plantas expuestas a condiciones de estrés, y sometiendo el material a perfiles de metabolitos. Las plantas mutantes y transgénicas, así como material de reproducción QTL acogida también representan un material adecuado para estos estudios genéticos. Predicción de la nueva vía se debe realizar con cuidado con precisiónanotación de pico y acercamiento de la combinación con diferentes tipos de metabolotype como los valores de órganos y respuestas de estrés de acuerdo a los datos de expresión génica de la vía de interés. En la última etapa, perfiles de metabolitos y la transcripción se debe realizar que a la larga, cuando se combina con análisis in silico de los recursos web y caracterización in vitro de la expresión génica a través de la expresión heteróloga, conducir a la confirmación del candidato de genes y la elucidación de su función y la posición dentro de una vía metabólica. Abreviaturas: Loci QTL, rasgo cuantitativo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Figura 2. El flujo de trabajo de aproximación mixta para la anotación del pico. Un procedimiento para la identificación de los picos y la anotación por el compuesto estándar, la comparación de tipo salvaje y mutantes knock out, multi-dimensional de espectrometría de masas del pico de destino se refiere a los espectros de masas de la comunidad purade libras de las 12 bases de datos. Abreviaturas: DB, base de datos; KO, knock-out, 1-D, de una dimensión; 2-D, de dos dimensiones, RMN, la resonancia magnética nuclear, IR, infrarrojo, MS n, de comunicación de masas spectrometries. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Figura 3. Ejemplo de análisis de co-regulación de la red de la vía de antocianina. Análisis de co-expresión se realizaron con el principal ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ), basado en el conjunto de datos de la versión 3 ATTEDII 8,2 con la Pajek programa ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Las correlaciones positivas (r &lt;0,5) se utilizan para hacer las conexiones de red. Red de nodos: doce genes de antocianina enzimáticos (At5g13930, CHS, T4T, la sintasa de chalcona, At3g55120, CHI, TT5, chalcona isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanona 3-hidroxilasa; At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonoide 3&#39;-hidroxilasa; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoide 3 - O-glucosiltransferasa, At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihidroflavonol reductasa; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, antocianidina synthése; At4g14090, A5GT, antocianinas 5 - O-glucosiltransferasa, At5g54060, A3G2 &quot;XT, supuesta antocianina 3 - O-glucósido 2&quot; - O - xilosiltransferasa; At3g29590, A5GMaT, antocianinas 5 - O-glucósido 6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antocianina 3 - O-glucósido 6 &quot;- O - P-coumaroyltransferase) y dos factores de transcripción para la producción de antocianinas (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) se utilizó para la búsqueda de genes candidatos genes candidatos fueron encontrados por una &quot;intersección de conjuntos&quot; de búsqueda con un valor umbral, con un coeficiente de r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 preguntó por la intersección de los conjuntos de todos los genes buscado (catorce genes de biosíntesis de antocianinas). Una red de co-expresión, incluida la correlación de los genes candidatos (68 genes) y los genes consultados (14 genes), fue reconstruido por una &quot;interconexión de los conjuntos de&quot; búsqueda con r&gt; 0,50 con la base de datos PRIME. Los archivos de salida que se ha dado formato con un archivo &#39;.&#39; Red de la base de PRIME y las redes se extrajeron utilizando el software Pajek. Nodo de color azul indica los genes candidatos que se correlacionaban con los genes de antocianina. <table border="1"><tbody><tr><td> especies </td><td> Mayor metabolito secundario </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolatos, flavonoides, antocianinas, derivado de sinapoyl </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonoles, antocianinas, derivado de salicilato de </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonoles, antocianinas, taninos, estilbeno </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonoles, antocianinas, glicoalcaloides, chrologenate relacionados, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonoles, antocianinas, nicotianamide, chrologenate relacionado, acylsugar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, antocianinas, derivados de esteroles </td></tr><tr><td> Zea mayo </td><td> Glycoflavone, antocianinas, benzoxazinona, derivados de esteroles </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavonas, antocianos, saponina, </td></tr><tr><td> Lotus japonica </td><td> Isoflavonas, flavonoides, antocianinas, saponina, </td></tr></tbody></table> Tabla I. Los principales metabolitos secundarios en especies de plantas modelo. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-expresión de base de datos </td><td> Dirección </td></tr><tr><td> Planta de cruz especificacioness </td><td></td></tr><tr><td> Conferencia de las Partes </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Las especies de plantas </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> Conferencia de las Partes </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Arroz de base de datos de matriz </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabla II. Base de datos disponible para la expresión génica en silico co-expresión de análisis.

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	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. L., Ishizaki, K., Nunes-Nesi, A., Larson, T. R., Tohge, T., Krahnert, I., Witt, S., Obata, T., Schauer, N., Graham, I. A., Leaver, C. J., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+2-Hydroxyglutarate+and+Isovaleryl-CoA+Dehydrogenases+as+Alternative+Electron+Donors+Linking+Lysine+Catabolism+to+the+Electron+Transport+Chain+of+Arabidopsis+Mitochondria.">Identification of the 2-Hydroxyglutarate and Isovaleryl-CoA Dehydrogenases as Alternative Electron Donors Linking Lysine Catabolism to the Electron Transport Chain of Arabidopsis Mitochondria.</a> Plant Cell. 22, 1549-1563 (2010).</li><li>De Vos, R. C. H., Moco, S., Lommen, A., Keurentjes, J. J. B., Bino, R. J., Hall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+large-scale+plant+metabolomics+using+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry.">Untargeted large-scale plant metabolomics using liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nat. Protoc. 2, (2007).</li><li>Hirai, M. Y., Sugiyama, K., Sawada, Y., Tohge, T., Obayashi, T., Suzuki, A., Araki, R., Sakurai, N., Suzuki, H., Aoki, K., Goda, H., Nishizawa, O. I., Shibata, D., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Omics-based+identification+of+Arabidopsis+Myb+transcription+factors+regulating+aliphatic+glucosinolate+biosynthesis.">Omics-based identification of Arabidopsis Myb transcription factors regulating aliphatic glucosinolate biosynthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 6478-6483 (2007).</li><li>Mutwil, M., Klie, S., Tohge, T., Giorgi, F. M., Wilkins, O., Campbell, M. M., Fernie, A. R., Usadel, B., Nikoloski, Z., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PlaNet:+Combined+Sequence+and+Expression+Comparisons+across+Plant+Networks+Derived+from+Seven+Species.">PlaNet: Combined Sequence and Expression Comparisons across Plant Networks Derived from Seven Species.</a> Plant Cell. 23, 895-910 (2011).</li><li>Mutwil, M., Ruprecht, C., Giorgi, F. M., Bringmann, M., Usadel, B., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Wiring+of+Cell+Wall-Related+Genes+in+Arabidopsis.">Transcriptional Wiring of Cell Wall-Related Genes in Arabidopsis.</a> Molecular Plant. 2, 1015-1024 (2009).</li><li>Obayashi, T., Kinoshita, K., Nakai, K., Shibaoka, M., Hayashi, S., Saeki, M., Shibata, D., Saito, K., Ohta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATTED-II:+a+database+of+co-expressed+genes+and+cis+elements+for+identifying+co-regulated+gene+groups+in+Arabidopsis.">ATTED-II: a database of co-expressed genes and cis elements for identifying co-regulated gene groups in Arabidopsis.</a> Nucleic Acids Research. 35, D863-D869 (2007).</li><li>Ogata, Y., Suzuki, H., Sakurai, N., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoP:+a+database+for+characterizing+co-expressed+gene+modules+with+biological+information+in+plants.">CoP: a database for characterizing co-expressed gene modules with biological information in plants.</a> Bioinformatics. 26, 1267-1268 (2010).</li><li>Persson, S., Wei, H. R., Milne, J., Page, G. P., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+required+for+cellulose+synthesis+by+regression+analysis+of+public+microarray+data+sets.">Identification of genes required for cellulose synthesis by regression analysis of public microarray data sets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 8633-8638 (2005).</li><li>Tohge, T., Yonekura-Sakakibara, K., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytochemical+genomics+in+Arabidopsis+thaliana:+A+case+study+for+functional+identification+of+flavonoid+biosynthesis+genes.">Phytochemical genomics in Arabidopsis thaliana: A case study for functional identification of flavonoid biosynthesis genes.</a> Pure and Applied Chemistry. 79, 811-823 (2007).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+resources+for+mass-spectrometry-based+metabolomics:+A+user's+guide.">Web-based resources for mass-spectrometry-based metabolomics: A user's guide.</a> Phytochemistry. 70, 450-456 (2009).</li><li>Tohge, T., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genetic+diversity,+informatics+and+metabolomics+to+facilitate+annotation+of+plant+gene+function.">Combining genetic diversity, informatics and metabolomics to facilitate annotation of plant gene function.</a> Nature Protocols. 5, 1210-1227 (2010).</li><li>Tohge, T., Kusano, M., Fukushima, A., Saito, K., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+metabolic+programs+following+exposure+of+plants+to+UV-B+irradiation.">Transcriptional and metabolic programs following exposure of plants to UV-B irradiation.</a> Plant Signal Behav. 6, (2011).</li><li>Tohge, T., Ramos, M. S., Nunes-Nesi, A., Mutwil, M., Giavalisco, P., Steinhauser, D., Schellenberg, M., Willmitzer, L., Persson, S., Martinoia, E., Fernie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Teniendo en cuenta que la transcriptómica y metabolómica tecnologías se han utilizado desde hace varios años, el proceso de integración de datos para la metabolómica asistidos anotación de genes en general, comienza con la identificación de un pico de la novela representa un metabolito desconocido. Este hecho lleva a la siguiente etapa que consiste en evaluar la variación cuantitativa en los picos de metabolitos o de los nuevos genes candidatos que se consideran responsables de su biosíntesis. La estrategia descrita en este protocolo, sin embargo, tiene tres problemas principales i) la dificultad de la anotación de pico, ii) la complejidad de la predicción de la vía, iii) Resolución de la información genética y la calidad de los datos de expresión génica. Para contrarrestar el problema en primer lugar, la anotación de pico debe llevarse a cabo con el co-elución de compuestos estándar o información utilizando enfoque combinatorio de la EM n análisis, extracto de referencia, el análisis de mutantes, de búsqueda de base de datos metabolito y el estudio de la literatura (Figura 2, 12). Para la sproblema egundo, la predicción de la vía sólo se puede obtener por medio de anotación de pico correcto. Sin embargo, perfiles de metabolitos de la especificidad tisular puede ser también la anotación de apoyo máximo, debido a la acumulación de metabolitos puede estar correlacionada con la expresión de genes de los genes relacionados. Por lo tanto los perfiles de la combinación de diferentes tejidos y condiciones de crecimiento puede ser útil para este segundo problema. El tercer problema relativo a la resolución de la información genética depende del progreso de la secuencia de datos. En el caso de la planta modelo sin la terminación de la secuencia del genoma, la co-expresión con el análisis de genes ortólogos en las plantas de otro modelo es útil. Comparación de la alineación y el análisis detallado árbol filogenético de la secuencia de aminoácidos puede apoyar para conectar organismos modelo para otras especies. Este protocolo es adecuado para todos los metabolismos. Es más eficiente en el análisis de los metabolismos intermedios y secundarios que son bien caracterizado para ser objeto de c transcripcional fuerteontrol 1,5,11,16. En algunos ejemplos, la co-expresión de análisis logrado que se realiza en la asimilación de azufre, los genes para β-oxidación, de cadena ramificada degradación de aminoácidos, desglose clorofila, y el catabolismo de lisina 3, el metabolismo celular pared 10,7 y la luz de señalización en cascada 14. Anotación de la función de genes a través de la genómica, la metabolómica y la combinación de la informática no es sólo para el gen de biosíntesis y el regulador directo del factor de transcripción, sino también para la comprensión de los procesos fisiológicos y la respuesta (véase el ejemplo de la Figura 3. 14). Para desarrollar este enfoque de las plantas modelo para las especies cultivadas, la comparación metabólico de todas las especies de plantas es el enfoque de gran alcance en algunos metabolismos generales. Por ejemplo, si mismo compuesto se detecta en las especies de plantas diferentes, y algunos genes ortólogos se encuentran en estas especies de plantas, especies cruzadas co-expresión análisis utilizando orthologous genes pueden proporcionar strong de soporte para su predicción. Este enfoque puede ser realizado en Arabidopsis, álamo, Medicago, además de cultivos importantes tales como cebada, arroz, trigo y la soja, mediante análisis de co-expresión de las especies de plantas (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,, 9, CP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ; ver un ejemplo, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Agua destilada ULC / MS de posgrado </td><td> Biosolve </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitrilo (ACN) ULC / grado MS </td><td> Biosolve </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> El metanol (MeOH) ULC / grado MS </td><td> Biosolve </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Ácido fórmico (HCOOH) ULC / MS de grado para cromatografía líquida </td><td> Biosolve </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Compuestos estándar </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Lineal trampa de iones (IT) ESI-MS sistema de Finnigan-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC Surveyor sistema de </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analítica Luna columna C18 (2), 2,0 mm de diámetro, 150 mm de longitud, 100 poro Åtamaño y las partículas esféricas de 3 mm </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Dado el número cada vez mayor de especies de plantas modelo para que las secuencias completas del genoma están disponibles y la abundancia de los recursos biológicos, tales como mutantes knockout, adhesiones y las poblaciones silvestres avanzadas para el cultivo, hay una creciente carga para la anotación funcional de genes. En este protocolo, la anotación de la función de genes de plantas utilizando combinado co-expresión de genes de análisis, la metabolómica y la informática se proporciona (Figura 1). Este enfoque se basa en la teoría de la utilización de los genes diana de función conocida para permitir la identificación de los genes anotados no propensos a estar involucrados en un proceso metabólico determinado, con la identificación de compuestos de interés a través de la metabolómica. Las estrategias se plantean para la aplicación de esta información en las poblaciones de ambos enfoques generados por la genética de avance y retroceso, a pesar de ninguno de ellos es sin esfuerzo. Como corolario este método también se puede utilizar como un método para caracterizar los picos desconocidos que representan nuevo o específico sícundaria metabolitos en los tejidos limitados, especies de plantas de tratamiento o el estrés, que es actualmente el juicio importantes para entender el metabolismo de las plantas.

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Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

La combinación de la genómica, la co-expresión de genes de análisis y la identificación de compuestos de interés a través del metabolismo dar anotación de genes funcionales.

Anotación de la función de genes de plantas a través de la genómica, la metabolómica combinados e Informática

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K vistas.  Max-Planck-Institut. La combinación de la genómica, la co-expresión de genes de análisis y la identificación de compuestos de interés a través del metabolismo dar anotación de genes funcionales.

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Inducida por el virus de silenciamiento génico (VIGS) en Nicotiana benthamiana Y tomate

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Investigación

Biología

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

A β-glucuronidasa (GUS), basada en células de ensayo Muerte

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Mediada por Agrobacterium inducida por el virus Gene ensayo silenciamiento en algodón

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of gene expression, miRNAs play key roles in various cellular pathways, including both development and response to a/biotic stress, such as drought and diseases. Having high-quality reference genome sequences enabled identification and annotation of miRNAs in several plant species, where miRNA sequences are highly conserved. As computational miRNA identification and annotation processes are mostly error-prone processes, homology-based predictions increase prediction accuracy. We developed and have improved the miRNA annotation pipeline, SUmir, in the last decade, which has been used for several plant genomes since then. 
This study presents a fully automated, new miRNA pipeline, mirMachine (miRNA Machine), by (i) adding an additional filtering step on the secondary structure predictions, (ii) making it fully automated, and (iii) introducing new options to predict either known miRNA based on homology or novel miRNAs based on small RNA sequencing reads using the previous pipeline. The new miRNA pipeline, mirMachine, was tested using The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, release of the Arabidopsis genome and the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) wheat reference genome v2.

Herein, we present a new and fully automated miRNA pipeline, mirMachine that 1) can identify known and novel miRNAs more accurately and 2) is fully automated and freely available. Users can now execute a short submission script to run the fully automated mirMachine pipeline.

mirMachine: Una ventanilla única para la anotación de miARN de plantas

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

Determinación de la interacción tripartita entre dos monómeros de un factor de transcripción MADS-box y una proteína sensora de calcio mediante ensayo BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.