Nous tenons à remercier le professeur Saito Kazuki dans RIKEN CFP et le Dr Bjoern Usadel dans MPIMP pour des discussions utiles. TT est soutenu par une bourse de la fondation Alexander von Humboldt.

1. Préparation de l&#39;échantillon <ol><li> Les matières végétales sont récoltés et congelés immédiatement. </li><li> Matières végétales congelées sont pulvérisés par vibro-broyeur (ou mortier) et stockées dans Falcon tube ou tube Eppendorf à -80 ° C. </li></ol> 2. Extraction pour le profilage des métabolites <ol><li> Aliquote congelée matériel végétal dans un tube Eppendorf de 2 ml. </li><li> Ajouter 5 pi de tampon d&#39;extraction par milligramme de poids frais de matériel végétal congelé. </li><li> Ajouter un métal (ou gilconia), le ballon et homogénéiser la poudre de gelée avec le Mixer Mill pendant 2 min à 25 ls -1. </li><li> Centrifuger 10 min à 12000 rpm. </li><li> Transférer le surnageant dans un filtre centrifuge Nanosep. </li><li> Centrifuger 2 min à 4000 rpm. </li><li> Transférer le surnageant dans de nouveaux tube Eppendorf, et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à son utilisation. </li></ol> 3. Profilage des métabolites par LC-MS <ol><li> Mettre en place HPLC et vérifier la température du four à colonne et plateau d&#39;échantillons. </li><li> Mettre en place l&#39;état de SP et de vérifier l&#39;état de vide et de chauffage capillaire. </li><li> Effectuer m / z d&#39;étalonnage du détecteur MS. </li><li> Transfert de 50 ul d&#39;extraits de flacon en verre pour LC-MS. </li><li> Injecter 5 ul d&#39;extraits de la LC-MS. </li></ol> 4. Analyse des données <ol><li> Configurer Xcalibur ou Metalign 4 et sélectionnez l&#39;analyse des données à traiter. </li><li> Préparer une table des pics détectés de votre intérêt en conformité avec classe de composés dans le Tableau I. </li><li> L&#39;identification des pics par la co-élution de composés standard. </li><li> Annoter détecté des pics en utilisant MS 2 analyse, étude de la littérature, la recherche de base de données métabolite (figure 2, 12,13). </li></ol> 5. Prédiction de la voie métabolique <ol><li> Construire une voie possible avec des composés détectés. Prédiction de la voie en utilisant les annotations de pointe devrait être basée sur la structure chimique du composé détectés en prédisant lien entre les fonctions enzymatiques sur la voie métabolique 13. Étapes de biosynthèse de structuration devraient être menées avec l&#39;annotation de pointe précis. Mais la détermination de la structure chimique détaillée, pour les fragment de sucre par exemple, n&#39;est pas indispensable dans cette étape, parce que la prédiction de la fraction de sucre et de la position adduction est très difficile d&#39;identifier par analyse MS. Détermination du type de sucre tels que hexoside et pentoside seront identifiés par un test enzymatique de donneur de sucre à la dernière étape du projet. La plupart du temps la construction de la prédiction de la voie doivent être effectués que petite molécule est intermédiaire de molécule plus grande, sauf dans les cas certains comme une réaction de déshydratation. Liste des poids moléculaire atomique, par exemple 16 m / z pour la différence entre-H et-OH fraction (oxydation), 14 m / z (l&#39;atome de carbone) pour la différence entre-OH et-OMe (méthylation) et 162 m / z ( MW-H 2 O) pour hexose (glycosylation), est utile pour la prédiction. Détermination de laType de modification avec l&#39;analyse de corrélation des spécificités des tissus aide de prédiction de la voie métabolique. Base de données de la voie métabolique général comme base de données KEGG ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) et PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), est très efficace pour la prédiction de la voie métabolique de votre intérêt. </li></ol> 6. Préparation de la liste des gènes avec l&#39;ID gène d&#39;Arabidopsis orthologues <ol><li> Télécharger la liste des ID du gène de la base de données génomique. </li><li> Ajouter ID du gène d&#39;Arabidopsis gène orthologue, dans le cas de votre plante cible n&#39;est pas Arabidopsis. </li><li> Préparez une liste de gènes dans votre voie d&#39;intérêt. Annotation des données de la voie d&#39;Arabidopsis et de données de familles de gènes sont disponibles dans le site Web TAIR ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Si vous avez préparé une liste de gènes orthologues Arabidopsis, vous pouvez ensuite combine eux. </li></ol> 7. Co-exprimés analyse génétique <ol><li> Testez l&#39;aide de la liste de gènes préparée ID pour rechercher la meilleure base de données pour votre voie en vérifiant la corrélation en utilisant des paires de gènes bien connus dans votre voie d&#39;intérêt (tableau II). Si la co-expression de base de données ou base de données l&#39;expression des gènes ne sont pas disponibles dans l&#39;installation de votre intérêt, Arabidopsis co-expression de base de données doit être utilisé avec une liste de gènes orthologues d&#39;Arabidopsis. Dans le cas de l&#39;orge, le riz, le peuplier, le blé, le soja et Medicago, la co-expression analyse des espèces végétales peuvent être utilisées (tableau II). </li><li> Construire le cadre de votre cible co-expression de réseau basée sur les connexions des gènes bien connus dans votre voie d&#39;intérêt. </li><li> Ajouter gènes candidats corrélation (r &lt;0,4 ~ 0,90, au sein de valeur approximative de la valeur du coefficient entre les connexions des gènes bien connus dans votre voie d&#39;intérêt) et de vérifier leur annotation des gènes dans votre prfamilles édictées aux connexions de ce réseau pour trouver des gènes meilleur candidat (Figure 3). Seuil de valeur de coefficient doivent être coordonnées selon l&#39;une structure de réseau et la densité de gènes corrélés. </li><li> Faire une liste de gènes dont vous êtes en mesure d&#39;affiner comme étant spécialisée à votre voie cible. </li><li> Vérifiez l&#39;expression des gènes des spécificités d&#39;organes et les réponses au stress de vos gènes candidats. </li></ol> 8. L&#39;intégration de toutes les informations pour prédire Nouveaux Sentiers <ol><li> Ajouter gènes bien caractérisés qui ont été utilisés pour la requête de la co-expression de l&#39;analyse à la voie métabolique prédit. </li><li> Vérifier les pièces non caractérisées dans cette voie, par exemple non caractérisés étapes enzymatiques, des protéines de transport et les facteurs de transcription. </li><li> Prédire l&#39;annotation des gènes les plus adaptés à ces étapes manquantes non caractérisés. </li><li> Combiner les résultats de profilage des métabolites et des gènes candidats de in silico gel&#39;expression ne basée sur la voie prévue. </li><li> Organisez vos gènes candidats sur la voie prédite selon la fonction des gènes, par exemple, pour acétyltransférase acétylé métabolite, glycosyltransférase pour glycoside, P450 pour le composé oxydé. Analyse de l&#39;arbre phylogénétique des séquences d&#39;acides aminés est utile pour une famille de gènes gamme tels que P450 et glycosyltransférase. </li><li> Vérifier la cohérence des spécificités des tissus ou des réactions de stress entre l&#39;accumulation de métabolites et niveau d&#39;expression génique de gènes candidats. </li><li> Vérifiez les connexions au métabolisme d&#39;autres pour fournir des gènes substrat et le stress sensibles. </li></ol> 9. Des expériences pour l&#39;identification de gènes grâce aux bio-ressources <ol><li> Vérifiez la disponibilité de ressources biologiques pour la facilitation de l&#39;expérience pour l&#39;identification de gènes candidats. </li><li> Effectuer une expérience pour l&#39;identification de la fonction des gènes en utilisant des bio-ressources, telles que KO mutant bibliothèque et pleine longueur banque d&#39;ADNc. Til expérimente pour l&#39;identification fonctionnelle des gènes avec la préparation des plantes et la surexpression de mutants knock-out, le dosage enzymatique et dosage promoteur contraignant, doivent être effectuées pour les meilleurs gènes candidats dans votre prédiction. Dosage protéine recombinante pour la caractérisation des propriétés de protéines et de préparation de plantes surexpression mieux être effectuée après la confirmation de profil métabolite utilisant KO mutante étant donné qu&#39;il est considérablement plus long à préparer une protéine recombinante et le clonage du gène pour la transformation. </li></ol> 10. Les résultats représentatifs La procédure d&#39;analyse intégrée décrite dans ce protocole offre de nombreuses possibilités en fonction de fins expérimentales spécifié et le choix des combinaisons biologiques et analytiques. Choix des procédures et la conception expérimentale doit être effectuée correctement sur la base de votre voie cible, composés et les espèces végétales. La stratégie d&#39;intégration décrites dans le présent protocole est foc<html> utilisé sur l&#39;annotation de la fonction des gènes des plantes et la découverte des fonctions des gènes nouveaux avec un usage efficace de plusieurs bio-et les données des ressources. Résultat escompté est promis de fournir avec le seul cas de la prédiction concluante. Ce fait indique que si des preuves suffisantes ne peut être donnée par les profils de combinaison, l&#39;expérience ne devrait pas être démarré. Pour cette raison, dans tous les cas, d&#39;autres expériences préliminaires telles que le profilage d&#39;expression génique ciblée par RT-PCR, peuvent soutenir votre prédiction de la fonction des gènes. Précision et exactitude de la prédiction est en corrélation plus élevée en fonction de la différence qualitative et le numéro de la variation de la combinaison. En outre, les bons candidats et les résultats valides ne peut venir que de la prédiction précise des voies. Annotation de pointe devrait être menée par la combinaison de plusieurs approches, pour étude de la littérature, par exemple, extrait de plante de référence, MS n analyse, spécificité d&#39;organe et de l&#39;analyse mutant 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Vue d&#39;ensemble de l&#39;écoulement expérimental de l&#39;annotation des gènes par approche combinée. Dans certains cas, les projets commencent par la découverte d&#39;un pic de roman qui est détecté dans des conditions particulières ou des tissus, et le désir de comprendre son rôle au sein de son métabolisme. Dans d&#39;autres cas le but du projet est l&#39;identification des gènes ou la découverte des principaux facteurs de régulation tels que les facteurs de transcription. Conception de l&#39;expérience devrait être raboté avec un ensemble de données qui montre des différences claires de niveaux de métabolites dans votre voie cible, en utilisant un large éventail d&#39;échantillons de tissus provenant de différents organes, et pour les plantes cultivées de façon différentielle ou des plantes exposées à des conditions de stress, et en soumettant le matériau à profilage des métabolites. Plantes mutantes et transgéniques ainsi que QTL matériel de reproduction hébergement représentent également appropriée le matériel génétique de ces études. Prédiction de la nouvelle voie doit être effectuée avec soin préciseannotation de pointe et une approche combinaison avec différents types de metabolotype tels que les titres d&#39;organes et les réponses au stress en fonction de données d&#39;expression génique de votre voie d&#39;intérêt. Dans la dernière étape, le profilage et la transcription métabolite doit être effectuée qui sera par la suite, lorsqu&#39;il est combiné avec une analyse in silico des web-ressources et dans la caractérisation in vitro de l&#39;expression des gènes par l&#39;intermédiaire d&#39;expression hétérologue, conduire à la confirmation de la gène candidat et l&#39;élucidation de sa fonction et la position dans une voie métabolique. Abréviations: QTL, Quantitative Trait Loci. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Figure 2. Le flux de travail de l&#39;approche combinatoire pour l&#39;annotation de pointe. Une procédure d&#39;identification de pointe et l&#39;annotation par le composé standard, la comparaison de type sauvage et mutants knock out, la spectrométrie de masse multi-dimensionnelle de la crête cible se référant à des spectres de masse de la com purlivres des 12 bases de données. Abréviations: DB, bases de données; KO, knock-out; 1-D, une dimension; 2-D, à deux dimensions; RMN, résonance magnétique nucléaire; IR, infra-rouge; MS n, la masse-masse spectrométries. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Figure 3. Exemple d&#39;analyse de réseau de co-régulation de la voie des anthocyanes. Analyses de co-expression ont été réalisées en utilisant l&#39;amorce ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) sur la base des données établies de la version 3 ATTEDII 8,2 avec le Programme Pajek ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Des corrélations positives (r &lt;0,5) sont utilisés pour établir des connexions réseau. Rouge noeud: douze gènes enzymatiques (anthocyanes At5g13930, CHS, TT4, chalcone synthase; At3g55120, CHI, TT5, chalcone isomérisation; At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-hydroxylase; At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonoïde 3&#39;-hydroxylase; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavinoïde 3 - O-glucosyltransférase; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol réductase; At4g22880, SNA / LDOX, TT18, anthocyanidine synthese; At4g14090, A5GT, anthocyanes 5 - O-glucosyltransférase; At5g54060, A3G2 &quot;XT, putative anthocyanine 3 - O-glucoside 2&quot; - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, anthocyanes 5 - O-glucoside 6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, anthocyanine 3 - O-glucoside 6 &quot;- O - p-coumaroyltransferase) et deux facteurs de transcription pour la production d&#39;anthocyanine (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) a été utilisé pour la recherche des gènes candidats gènes candidats ont été trouvés par une «intersection des ensembles&quot; de recherche avec une valeur seuil avec un coefficient de r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 interrogé par l&#39;intersection des ensembles de tous les gènes interrogées (Quatorze gènes de biosynthèse de anthocyanes). Un réseau de co-expression, y compris les gènes candidats corrélés (68 gènes) et des gènes interrogées (14 gènes), a été re-construit par une «interconnexion des ensembles&quot; recherche avec r&gt; 0,50 en utilisant la base de données PRIME. Les fichiers de sortie qui ont été formatés avec un fichier &#39;. Net »de la base de données PRIME et réseaux ont été établis en utilisant le logiciel Pajek. Noeud bleu indique des gènes candidats qui sont corrélés avec des gènes d&#39;anthocyanine. <table border="1"><tbody><tr><td> espèce </td><td> Major métabolite secondaire </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolates, les flavonols, anthocyanes, dérivé sinapoyl </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonols, anthocyanes, dérivé de salicylate </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonols, anthocyanes, tanins, stilbène </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonols, anthocyanes, glycoalcaloïde, chrologenate connexe, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonols, anthocyanes, nicotianamide, chrologenate connexe, acylsugar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, anthocyanes, les dérivés de stérols </td></tr><tr><td> Zea mai </td><td> Glycoflavone, anthocyanes, benzoxazinone, dérivés du stérol </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavones, anthocyanes, la saponine, </td></tr><tr><td> Japonica Lotus </td><td> Isoflavones, flavonols, anthocyanes, la saponine, </td></tr></tbody></table> Tableau I. Principales métabolites secondaires des espèces végétales modèles. <table border="1"><tbody><tr><td> La co-expression de base de données </td><td> Adresse </td></tr><tr><td> Plante de croix specs </td><td></td></tr><tr><td> Conférence des Parties </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Les espèces végétales </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> Conférence des Parties </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> AGIR </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIMe </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Base de données array riz </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tableau II. Disponible base de données d&#39;expression génique pour in silico la co-expression d&#39;analyse.

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	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Étant donné que la transcriptomique et la métabolomique technologies ont été utilisées pendant plusieurs années, le processus d&#39;intégration de données pour la métabolomique assistés annotation des gènes débute généralement par l&#39;identification d&#39;un pic roman représentant un métabolite inconnu. Ce fait conduit à l&#39;étape suivante qui consiste à évaluer la variance quantitative des pics de métabolites ou les nouveaux gènes candidats jugés responsables de leur biosynthèse. La stratégie décrite dans le présent protocole, cependant, a trois problèmes majeurs i) difficulté d&#39;annotation de pointe, ii) la complexité de la prédiction du sentier, iii) la résolution de l&#39;information génétique et la qualité des données d&#39;expression génique. Pour contrer le premier problème, l&#39;annotation de pointe doit être effectuée avec le co-élution de composés standard ou de l&#39;information approche combinatoire en utilisant l&#39;analyse à partir de MS n, extrait de référence, analyse de mutants, de recherche de base de données métabolite et revue de la littérature (Figure 2, 12). Pour la sproblème EUXIÈME, prévision voie ne peut être obtenue par l&#39;annotation de pointe correcte. Toutefois, le profilage métabolite de la spécificité tissulaire peut aussi être l&#39;annotation de pointe de soutien, parce que l&#39;accumulation métabolite doit être en corrélation avec les expressions de gènes de gènes apparentés. Par conséquent profils de combinaison de différents tissus et les conditions de croissance peut être utile pour ce second problème. Le troisième problème concerne la résolution de l&#39;information génétique dépend de l&#39;état d&#39;avancement de données de séquences. Dans le cas de l&#39;usine modèle sans fin de la séquence du génome, la co-expression d&#39;analyse en utilisant des gènes orthologues chez des plantes modèles d&#39;autres est utile. Comparaison et l&#39;analyse détaillée d&#39;alignement arbre phylogénétique de la séquence d&#39;acides aminés peut prendre en charge pour se connecter organismes modèles à d&#39;autres espèces. Ce protocole est adapté à tous les métabolismes. Il est plus efficace dans l&#39;analyse des métabolismes intermédiaires et secondaires qui sont bien caractérisés pour être soumis à la transcription c forteontrôle 1,5,11,16. Des exemples, dans la co-expression d&#39;analyse a réussi à être exécutée dans l&#39;assimilation du soufre, des gènes pour β-oxydation, à chaîne ramifiée dégradation de l&#39;acide aminé, ventilation chlorophylle, et le catabolisme lysine, de la paroi cellulaire 3 métabolisme 10,7 et la lumière de signalisation en cascade 14. Annotation fonctionnelle des gènes par l&#39;intermédiaire génomique, la métabolomique combinés et de l&#39;informatique n&#39;est pas seulement pour le gène de biosynthèse et de régulateur direct du facteur de transcription, mais aussi pour la compréhension de processus physiologique et de la réponse (voir Figure 3 par exemple. 14). Pour développer cette approche à partir de plantes modèles pour les espèces cultivées, la comparaison métabolique de toutes les espèces végétales est une approche puissante dans certains métabolismes généraux. Par exemple, si un même composé est détectée dans différentes espèces de plantes, et quelques gènes orthologues sont trouvés dans ces espèces de plantes, croix espèces co-expression des gènes orthologues analyse à l&#39;aide peuvent fournir strong de support pour votre prédiction. Cette approche peut être effectuée chez Arabidopsis, le peuplier, Medicago, en plus des cultures importantes comme l&#39;orge, le riz, le blé et le soja, par la co-expression d&#39;analyse des plantes (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,, 9, la CdP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ; voir un exemple, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Eau distillée ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acétonitrile (ACN) ULC / MS de qualité </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Le méthanol (MeOH) ULC / MS de qualité </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> L&#39;acide formique (HCOOH) ULC / MS de qualité pour la chromatographie liquide </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Composés standard </td><td> Extrasynthèse </td><td></td></tr><tr><td> Piège à ions linéaire (IT) ESI-MS système FINNIGAN-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Arpenteur système HPLC </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Luna analytique colonne C18 (2), 2,0 mm de diamètre, 150 mm de longueur, 100 pores Ået la taille des particules sphériques de 3 mm </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur logiciels </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Compte tenu du nombre sans cesse croissant d&#39;espèces de plantes modèles pour lesquels des séquences génomiques complètes sont disponibles et l&#39;abondance des ressources biologiques telles que les mutants knock-out, adhésions sauvages et les populations de sélection avancées, il ya une charge croissante pour l&#39;annotation fonctionnelle des gènes. Dans ce protocole, l&#39;annotation de la fonction des gènes des plantes en utilisant combiné l&#39;analyse du gène co-expression, la métabolomique et de l&#39;informatique est fourni (Figure 1). Cette approche est basée sur la théorie de l&#39;utilisation de gènes cibles de fonction connue pour permettre l&#39;identification des gènes non annotés susceptibles d&#39;être impliqués dans un processus métabolique certaine, avec l&#39;identification de composés cibles par l&#39;intermédiaire métabolomique. Des stratégies sont mises en avant pour l&#39;application de cette information sur les populations générés par les deux approches de génétique directe et inverse, en dépit d&#39;aucun d&#39;entre eux sont sans effort. En corollaire de cette approche peut également être utilisé comme une approche pour caractériser les pics inconnus représentant nouvelle ou spécifique en soimétabolites dans les tissus condaires limitées, les espèces végétales ou de traitement du stress, qui est actuellement le procès important de comprendre le métabolisme des plantes.

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Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Combinaison de la génomique, l&#39;analyse du gène co-expression et l&#39;identification de composés cibles par métabolisme donner annotation des gènes fonctionnels.

Annotation de la fonction des gènes des plantes par l&#39;intermédiaire de génomique, la métabolomique et combinés informatique

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K vues.  Max-Planck-Institut. Combinaison de la génomique, l'analyse du gène co-expression et l'identification de composés cibles par métabolisme donner annotation des gènes fonctionnels.

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Induite par le virus Gene Silencing (VIGS) dans Nicotiana benthamiana Et aux tomates

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Recherche

Biologie

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Un β-glucuronidase (GUS) dosage basé mort cellulaire

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Agrobacterium induite par le virus Assay Gene Silencing En Coton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marquage métabolique de l&#39;ARN récemment transcrits pour une grande résolution profil d&#39;expression génique de l&#39;ARN de synthèse, le traitement et Decay en culture cellulaire

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualisation Fréquence Stromule avec Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Protéine fluorescente verte bibloc pour visualiser les effecteurs livré de bactéries lors de l’Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of gene expression, miRNAs play key roles in various cellular pathways, including both development and response to a/biotic stress, such as drought and diseases. Having high-quality reference genome sequences enabled identification and annotation of miRNAs in several plant species, where miRNA sequences are highly conserved. As computational miRNA identification and annotation processes are mostly error-prone processes, homology-based predictions increase prediction accuracy. We developed and have improved the miRNA annotation pipeline, SUmir, in the last decade, which has been used for several plant genomes since then. 
This study presents a fully automated, new miRNA pipeline, mirMachine (miRNA Machine), by (i) adding an additional filtering step on the secondary structure predictions, (ii) making it fully automated, and (iii) introducing new options to predict either known miRNA based on homology or novel miRNAs based on small RNA sequencing reads using the previous pipeline. The new miRNA pipeline, mirMachine, was tested using The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, release of the Arabidopsis genome and the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) wheat reference genome v2.

Herein, we present a new and fully automated miRNA pipeline, mirMachine that 1) can identify known and novel miRNAs more accurately and 2) is fully automated and freely available. Users can now execute a short submission script to run the fully automated mirMachine pipeline.

mirMachine : un guichet unique pour l’annotation des miARN végétaux

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

Détermination de l’interaction tripartite entre deux monomères d’un facteur de transcription MADS-box et d’une protéine de capteur de calcium par essai BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.