La secuenciación del genoma completo, la minería del genoma y las redes moleculares constituyen la base de la guía de espectrometría de masas que el protocolo de minería del genoma que describimos aquí. Y son el enfoque más contemporáneo en el descubrimiento de productos naturales. La minería del genoma y las redes moleculares coinciden en racimos, en anotaciones codificadas en secuenciación del genoma completo con firmas de reestructuración química de extractos crudos que proporcionan perspectivas masivas para descubrir el ombligo por moléculas activas.
En principio, la minería del genoma se dirige a un solo grupo o un pequeño grupo de moléculas por experimento. De este modo, se produce una tasa de detección lenta. En este sentido, el uso de la minería del genoma junto con las redes moleculares representa un avance importante para la investigación de productos naturales.
La minería de la guía-genoma de espectrometría de masas es un método versátil que puede estructurar simultáneamente la información de varios quimiotipos contenidos en la gran cantidad de datos de un extracto crudo. Hoy en día es una metodología de gama alta capaz de explorar la secuencia bacteriana, fúngica o de plantas. El quimiotipo al genotipo y el genotipo a los vínculos bioinformáticos quimiotipos entre los cúmulos biosintéticos y son productos de moléculas pequeñas.
Escuchar el protocolo se ha demostrado para caracterizar las profundidades del ciclo del ombligo productos de péptidos observados en extractos metabólicos de especies de estreptomyces. Pero es aplicable a la secuencia de hongos y plantas y extractos, así. Es muy importante tener un conjunto de datos del genoma bien seleccionado y hoy en día las secuencias de borrador fragmentadas se han sustituido cada vez más por datos de secuencia casi terminados.
Además, se han desarrollado diferentes estrategias para acceder a nuevos productos naturales bioactivos y, sin duda, combinarlos con el enfoque de MS-Guide. Llevaremos a mejorar el aislamiento de los productos naturales y el esclarecida de la estructura. Como aquí estamos conectando el genotipo con el enfoque de quimiotipo, los vínculos bioinformáticos entre los cúmulos biosintéticos y los productos de moléculas pequeñas son cruciales.
para estimar la variedad y clase de compuestos y codificar por genoma. Lo que significa la replicación. Más adelante, la agrupación en clústeres basada en similitudes iónicas se puede preformar mediante GNPS.
Demostrando el procedimiento estarán la Dra. Renata Sigrist y la Profesora Angolini mis colaboradores en este estudio. Para obtener en silicio información sobre los grupos genéticos del metabolismo secundario, las anotaciones de un genoma de secuencia completa. Envíe el archivo de secuencia, el banco de genes E-M-B-L o formato más rápido, a una plataforma anti-smash.
Al igual que los grupos genéticos de interés de los datos de salida basados en el clúster conocido más similar. Sobre la base de la información de la secuencia de ADN del BGC, diseñe primarias entre 20 y 25 nucleótidos que flanquean el grupo genético para las estreptotomías de ecoli. Examen de la biblioteca de cromosomas artificiales.
Después de obtener el organismo heterólogo recombinante según el manuscrito, inocular una 100a de la precultiva de las cepas en medios de fermentación apropiados. Como medios ISP2 líquidos. Coloque el cultivo en una incubadora a 30 grados Centígrados y 220 RPM, durante siete días.
Después de la inoculación, centrifugar las culturas a 2200 veces G durante 10 minutos. Deseche las celdas y transfiera el sobrenadante a un embudo separador. Agregue uno a un volumen de acetato de etilo y agite.
Espere de uno a tres minutos para que las capas orgánicas yquiesciadas se separen. Y recoger la capa orgánica en un matraz Erlenmeyer. Adquirir datos de MS/MS.
Programe métodos hpLC y espectrometría de masas adecuados utilizando el software de control. Cabe señalar que la red MS/MS es la red molecular detectable bajo las condiciones espectrométricas de masa dadas. Convierta espectros de masa a formato mzXML utilizando MS Convert desde el asistente protea.
Ajuste los parámetros de entrada para la conversión. Cargue los archivos LC-MS/MS convertidos en la base de datos GNPS. Hay dos opciones disponibles.
Usando un protocolo de transferencia de archivos o directamente en un navegador a través de la plataforma en línea. Después de crear una cuenta en GNPS, inicie sesión en la cuenta creada y seleccione crear una red molecular. Agregue un título de trabajo.
Para realizar opciones básicas. Seleccione los archivos mzXML para realizar la red molecular. Organizarlos en hasta seis grupos.
Así como las bibliotecas para la rutina de desreplicación. Seleccione la tolerancia de masa de iones precursores y el fragmento Da en tolerancia de masa de 0.02 Dalton y 0.05 Dalton respectivamente. Para realizar opciones de red avanzadas, seleccione los parámetros que influyeron directamente en el tamaño y el formulario del clúster de red.
Los parámetros avanzados están en la documentación de GNPS. Elija una dirección de correo electrónico para recibir una alerta cuando termine el trabajo y envíe el trabajo. Analizar los resultados de GNPS.
Inicie sesión en GNPS. Seleccione trabajos, trabajo publicado, realizados para abrir un trabajo. Se abre una página web con todos los resultados obtenidos de la red molecular mostrada.
Seleccione Ver familias espectrales en el visualizador de red del navegador para ver todos los clústeres de red. Se muestra una lista con todos los clústeres de redes moleculares generados. La identificación molecular provisional se muestra en todos los documentos de identidad.
Seleccione Mostrar para visualizarlos. Para analizar el clúster de red molecular, seleccione visualizar red. En el cuadro Etiquetas de nodo, seleccione masa primaria.
En el cuadro Etiquetas de borde, seleccione co-firma o Delta Emz. Para observar la similitud de nodo o la diferencia de masa entre nodos respectivamente. En el caso del análisis multigrupo, haga clic en dibujar pasteles en el cuadro de color del nodo.
Para observar la frecuencia con la que aparece cada nodo en cada grupo. Para ver todas las bibliotecas, seleccione view, all library, hits. Abra los espectros de fragmentación directamente en la plataforma GNPS.
O en archivos originales crudos para confirmar manualmente compuestos de desreplicación y elucidación de la estructura de compuestos relacionados. El protocolo se ejemplificó con éxito mediante una combinación de minería del genoma, expresión heteróloga y enfoques de código guiado por MS. Para acceder a nuevas moléculas especializadas de Valinomicina y análoga.
Aquí se presenta el flujo de trabajo del genoma a la molécula para la valinomicina objetivo. El cromatograma mostró que la valinomicina, la montanastatina y cinco análogos fueron producidos por valinomicina, expresión de grupos genéticos biosintéticos en un huésped heterólogo. Los iones de red molecular correspondientes a la valinomicina, un compuesto ya conocido con los correspondientes grupos genéticos biosintéticos anotados en especies de estreptomicos, CBM AI dos cero cuatro dos genoma.
Se agrupan con iones relacionados con análogos, descritos en primer lugar para el grupo genético biosintético de valinomicina. Aquí se muestran los espectros de LA MS y las estructuras químicas para la valinomicina y los análogos relacionados. Realizar la secuenciación completa del genoma y la curación adecuada del conjunto de datos es el primer paso para elegir un clúster biosintético para la minería del genoma.
Todo el procedimiento se puede realizar con los tipos de comodín de extracto crudo de cadena, pero puede optar por seleccionar el grupo genético de su interés y promover la expresión heteróloga. Se describen diferentes métodos para capturar todo el grupo genético biosintético de una muestra de ADN. La ventaja más fuerte de este protocolo es su capacidad para replicar rápidamente perfiles metabólicos y reproducir información genómica con datos de EME.
Con el fin de dilucidar estos como de nuevas moléculas. Y la minería de la guía-genoma de masas fue descrita en primer lugar en el campo de la genómica de péptidos y la glucogenómica por Doris Chime y sus colegas. Y después de la introducción del enfoque de metabolómica integrada NPS y minería del genoma se han convertido en la vía más versátil para conectar las redes moleculares con capacidades biosintéticas.
