Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención (R01 HL086699, HL086699-01A2S1, 1S10RR027327-01) a MM. Nuestro artículo es apoyado en parte por Carl Zeiss MicroImaging LLC.

Especies reactivas de oxígeno se puede medir en células vivas con tintes sensibles a la oxidación (1 y 2) o el uso de sensores de plásmido (3 y 4) por microscopía confocal. 1. Visualización de citosólica de ROS en células J774 <ol><li> Crecer J774.1 ratón macrófagos derivados de monocitos (10 6 células / ml) en el fondo de cristal de 35 mm platos (Harvard Apparatus) durante 48 h. </li><li> Células desafío con agonistas TLR (2 ug / ml, Lipo-teicoicos ácido TLR2 agonista; 10μg/ml, poli (I: C)-agonista TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4 agonistas) durante 6 horas a 37 ° C. Nota: Los macrófagos tratados en condiciones similares se utilizaron para el modelo de co-cultivo de Ca 2 + movilización. </li><li> Añadir el colorante sensibles a la oxidación de H 2 DCF-DA (Invitrogen) para dar una concentración final de 10 mM de ECM (extracelular medio: 121 mM NaCl, 5 mM NaHCO 3, 10 mM Na-HEPES, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10mM de glucosa y 2,0% de dextrano, pH 7,4, todos obtenidos de Sigma) que contiene 2% de BSA a los platos y las células se incuban durante 20 minutos antes de la visualización en microscopía confocal. </li><li> Después de cargar el medio de contraste, visualizar las células colocado en una etapa de control de temperatura de un sistema de imagen adecuado. Utilizamos Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagen confocal, junto con la fuente de iones de argón láser a una excitación de 488 nm para la DCF fluorescencia con objetivo de aceite 40x 13 (Fig. 1A y D). </li><li> Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44), software de libre disposición de los Institutos Nacionales de Salud (Rasband, WS, ImageJ, EE.UU. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EE.UU., <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. Visualización de las OPF en células J774 <ol><li> Crecer J774.1 ratón macrófagos derivados de monocitos (10 6 células / ml) en el fondo de cristal de 35 mm platos (Harvard Apparatus) durante 48 h. </li><li>Desafío de las células con ligandos TLR para inducir la producción de OPF (2 ug / ml, Lipo-teicoicos ácido TLR2; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 º C. </li><li> Añadir mitocondrial de superóxido indicador MitoSOX Roja (Invitrogen) para dar una concentración final de 5 mM de ECM que contiene 2% de BSA a los platos y las células se incuban durante 30 min a 37 ° C para permitir la carga de MitoSOX Roja. </li><li> Después de cargar el medio de contraste, visualizar las células en una etapa de control de temperatura de un objetivo Carl Zeiss LSM 510 Meta par sistema de microscopía confocal con láser de iones de argón fuente en una excitación de 561 nm para MitoSOX Red de fluorescencia con objetivo 40x de aceite (fig. 1B y E). </li><li> Para los experimentos de control, después de colorante de carga PBS añadir o DMSO (control negativo) o antimicina A 2μM. (Como el superóxido mitocondrial generador de control positivo) a las células antes de que la imagen de la muestra como se describe en el punto 2.4 (Fig. 1C) </li><li> Analizará las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44). </li></ol> 3. Visualizatien el citosol de ROS en el establo de la tecnología Hyper-cito MPMVECs <ol><li> Utilizamos pHyPer-cito (Evrogen) una codificación de vector de expresión de mamíferos una hiper sensor fluorescente que se localiza en el citoplasma y, específicamente, la concentración de los sentidos submicromolar de H 2 O 2 14. </li><li> Transfectar murino pulmonar células endoteliales microvasculares (MPMVECs) con pHyPer-cito vector utilizando electroporación o reactivos de transfección. Usamos 10 x 10 6 células y transfección con 10μg de pHyPer-cito a través de electroporación utilizando BioRad Gene Pulser sistema electroporador (250, 500 mF). MPMVECs de cultivo en medio DMEM suplementado con 10% de SFB, aminoácidos no esenciales, suplemento de crecimiento endotelial y antibióticos. Nota: Después de la transfección, las células de la placa en baja densidad para facilitar el crecimiento de la colonia. </li><li> Vuelva a colocar medio con medio de cultivo completo suplementado con 500 mg / ml G418, 48 horas después de la transfección. Pantalla de los clones que tienen el mayor porcentaje de H<html> yper células positivas y el paso de Hyper clones positivos para aumentar el número de hiper células positivas (Fig. 2). Nota: el uso de series de dilución de las células de la selección clonal de las células individuales y la pantalla para que las células que expresan muy estable Hyper. </li><li> Crecer estable Hyper-cito MPMVECs en gelatina 0,2% cubreobjetos recubiertos (80% de confluencia). A continuación las células días reto con ligandos TLR (2 ug / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 ° C. Las células no tratadas como control. </li><li> Después del tratamiento, montaje de los cubreobjetos en Attofluor células en la cámara (Invitrogen). Añadir 1 ml de solución de pre calentado salina equilibrada de Hanks (HBSS) a la cámara y coloque la cámara en un escenario de temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta System microscopía confocal. Visualizar y cambiar la imagen de fluorescencia a una excitación de 488 nm utilizando objetivo 40x de aceite (Fig. 3 A y D). </li><li> Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44) (ver sección 6). </li></ol>TÍTULO &quot;&gt; 4. Visualización de ROS mitocondrial en el establo de la tecnología Hyper-dMito MPMVECs <ol><li> Utilizamos pHyPer-dMito (Evrogen) un vector de expresión de mamíferos que codifican las mitocondrias-Hyper objetivo que se localiza en la concentración de los sentidos y, específicamente, las mitocondrias submicromolar de H 2 O 2. </li><li> MPMVECs transfectar con pHyPer-dMito y creación de empleos estables Hyper-dMito MPMVECs siguientes pasos que se describen en la sección 3.2 a 3.3. </li><li> Crecer estable Hyper-dMito MPMVECs en gelatina 0,2% cubreobjetos recubiertos (80% de confluencia). </li><li> A continuación las células días reto con ligandos TLR (2 ug / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 ° C. Las células no tratadas como control negativo. Añadir antimicina 2μM una muestra (dismutasa mitocondrial inductor-control positivo) antes de la visualización. </li><li> Después del tratamiento, montaje de los cubreobjetos en Attofluor células en la cámara (Invitrogen). Añadir 1 ml de pre-calentado solución salina balanceada de Hanks (HBSS) a la cámaray el lugar de la cámara en un escenario de temperatura controlada de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagen confocal. Visualizar y cambiar la imagen de fluorescencia a una excitación de 488 nm utilizando objetivo 40x de aceite (Fig. 3B, C y E). </li><li> Analizar las imágenes utilizando el software ImageJ (1,44) (ver sección 6). </li></ol> 5. Co-cultivo modelo para la visualización de paracrina derivados de ROS activado Ca 2 + señalización en las células endoteliales Para la visualización y medición de la [Ca 2 +] i cambios que el uso de Ca 2 + sensibles tinte fluorescente fluo-4 AM (Invitrogen). <ol><li> MPMVECs crecer en 0,2% de gelatina cubreobjetos recubiertos de vidrio de 25 mm (80% de confluencia). </li><li> Se incuban las células cultivadas en cubreobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos en ECM que contiene 2% de BSA y 0,003% de ácido plurónico con 5 M fluo-4 AM (Invitrogen) concentración final para permitir la carga de fluo-4 AM. Después de cargar, lavar las células con una solución de imágenes experimentales (ECM con 0.25% de BSA), que contiene sulfinpirazona para minimizar la pérdida de tinte. </li><li> Después de cargar el fluo-4, de montaje en cubreobjetos Attofluor células en la cámara (Invitrogen). Agregar 800μl de pre calentado solución de imágenes experimentales a la cámara y colocarlo en una etapa de control de temperatura de Carl Zeiss LSM 510 Meta sistema de imagen confocal. </li><li> En una etiqueta del tubo por separado de los macrófagos activados o no activadas aislado de cualquier tipo salvaje o gp91 phox / - ratones (tratados con LPS durante 6 horas) con la célula de seguimiento de rojo CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen) en ECM que contiene 2% de BSA y Pluronic 0,003% de ácido. Lavar y volver a suspender las células con 200μl de solución de imagen experimental. </li><li> Añadir macrófagos etiquetados a fluo-4 AM cargado MPMVECs en el conjunto de la cámara. </li><li> Registro de la fluorescencia verde y rojo cada 3 segundos durante 10-20 min con Carl Zeiss LSM510 Meta sistema de imagen confocal con una fuente láser de iones de argón con excitación a 488 y 561 nm de fluo-4 AM y la célula de seguimiento fluorescencia roja respectively (Fig. 4 AC). Nota: Como alternativa, J774.1 línea celular podría usarse para producir MPMVECs Ca 2 + movilización. </li><li> Analizar fluo-4 cambios de intensidad de fluorescencia utilizando el software ImageJ (1,44) (ver sección 6). </li></ol> 6. Análisis de datos utilizando el software ImageJ La transferencia de las imágenes obtenidas desde el sistema confocal como un archivo de formato. Lsm para el análisis de datos. ZEN ZEN 2009 y 2010 el software proporcionado con el microscopio confocal LSM 510 Meta o LSM 710 microscopio confocal multifotónica respectivamente guarda los archivos en formato lsm.. Recomendamos el uso de este nativo de archivos. Lsm para el análisis de imagen como la calidad original se mantiene. Este formato de archivo se pueden abrir directamente en la imagen de análisis de imágenes J. programa Los pasos siguientes proporcionan un ejemplo de análisis cuantitativo de una sola imagen. Sin plugins adicionales son necesarios para este análisis de datos. <ol><li> Abierto. Lsm o. TIFF en el programa Image J con Archivo&gt; Abrir </li><li> Haga clic en la imagen del separador&gt; COLOR&gt; Canales de split y dividir los canales verde y DIC. Utilice la imagen del canal verde para su posterior análisis. </li><li> Haga doble clic y seleccione la opción &quot;selección elíptica cepillo&quot; y configure el valor de píxel de 20. </li><li> Para Hyper-cito imágenes, haga clic en una celda para definir el área circular de la medición. A continuación, pulse &quot;M&quot; para medir la intensidad de la zona seleccionada. Los valores se mantienen en una ventana de nuevos resultados. </li><li> A continuación mediante la celebración de &quot;Shift&quot; haga clic en clave en una celda diferente para seleccionar otra área, seguido de la tecla &quot;M&quot;. La intensidad se registra en la ventana de resultados. Repita los pasos 4-5 en 50 células diferentes. </li><li> Para Hyper d-mito imágenes, establezca el valor del píxel a 10 en la selección pincel elíptico. Región de interés (ROI) se ha trazado de forma manual como la mitocondria de las células en particular. </li><li> Utilizando mano alzada, la localización de la región de alrededor de la mitocondria y luego pulse &quot;M&quot;. Repita los pasos 6-7 en 50 células diferentes. </li><li> Copia de la me<html> uno de los valores de la ventana de resultados y pegar en una hoja de Excel o cualquier otro software para graficar los resultados. Utilizamos tanto SigmaPlot o GraphPad Prism para representar los datos como un gráfico. </li></ol> 7. Resultados representante La figura 1 muestra la producción de ROS citosólica y mitocondrial en desafío con ligandos TLR. Representante imágenes confocal muestran un aumento de DCF (citosólica) y MitoSOX Roja (mitocondrias) de fluorescencia después de 6 horas de la estimulación. Cambios de fluorescencia se normalizaron y se expresa como doble cambio. La figura 2 muestra la generación de estabilidad Hyper-cito y la tecnología Hyper-dMito las células endoteliales. Las células de ratón endotelial fueron transfectadas con pHyPer-cito o pHyPer-dMito plásmido construye a través de electroporación. Plásmidos células que expresan establemente fueron seleccionados con G418 durante dos semanas. Después de la selección, las células diluidas se sembraron en placas de 96 pocillos. Las colonias individuales fueron aislados y la imagen de la expresión homogénea. e_content &quot;&gt; La figura 3 muestra la medición del endotelio citosólica y mitocondrial de H 2 O 2. Representante imágenes confocal muestran un aumento de la tecnología Hyper-cito (citosólica) y Hyper-dMito (mitocondrias) de fluorescencia después de 6 horas de la estimulación. cambios intensidad de fluorescencia se normalizaron y se expresa como doble cambio. La figura 4 muestra la evaluación de los macrófagos derivados de ROS inducida endotelial Ca citosólico 2 + movilización. LPS-estimulado macrófagos se añadieron a las células pulmonares endoteliales microvasculares (PMVEC) que había sido previamente cargada con el Ca 2 + intracelular ([Ca 2 +] i) tinte indicador de Fluo-4. Aplicación de tipo salvaje LPS-macrófagos activados provocó una [Ca 2 +] i aumento de PMVECs que fue atenuada por octavos de final de la NADPH oxidasa funcional (gp91 phox-/ -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Visualizatien los macrófagos generados celular ROS y dismutasa mitocondrial. J774.1 células se estimularon con ligandos TLR2, 3 y 4 (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg/ml, poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4). Durante 6 horas a 37 º C. Después las células se cargaron con el tratamiento (A) celular ROS indicador (H 2 DCF-DA, de color verde fluorescente) o (B) Indicador de dismutasa mitocondrial (MitoSOX Red; fluorescencia roja). (C) antimicina A fue utilizado como control positivo para la producción mitocondrial de ROS. Cambios en intensidad de fluorescencia se evaluó mediante microscopía confocal. (D) y (E) La cuantificación de cambio media de fluorescencia. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Representación esquemática de la generación de la expresión estable de citosólica y mitocondrial de las células endoteliales indicadores de ROS. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. V. isualization del endotelio citosólica y mitocondrial de H 2 O 2 niveles MPMVECs que expresan establemente (A) Hyper-cito o (B) Hyper-dMito fueron desafiados con ligandos TLR2, 3 y 4 (2 mg / ml, ácido-TLR2 lipoteicoico; 10μg / ml, de poli (I: C)-TLR3, 1 mg / ml LPS-TLR4) durante 6 horas a 37 ° C. (C) antimicina A fue utilizado como control positivo para la producción mitocondrial de ROS. Después del tratamiento, los cambios de intensidad de fluorescencia se evaluó mediante microscopía confocal. (D) y (E) La cuantificación de cambio media de fluorescencia. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Macrófagos derivados de ROS provocan deterioro de las células endoteliales de Ca 2 + movilización. (A) Representación esquemática de las células endoteliales / macrófagos co-cultivo modelo de estudio. (B) recién aislados macrófagos murinos de ambos WT y gp91phox ratones nulos (el laboratorio de Jackson) fueron activadas por 1 mg / ml de LPS durante 6 h. Macrophages fueron etiquetados con células-tracker Red (rojo) y se añade a Fluo-4 PMVECs carga (verde) para evaluar paracrina O 2 • -. señalización (C) LPS-macrófagos activados aislado de ratones WT provocó grandes y rápidos de Ca 2 + movilización PMVECs en comparación con los macrófagos de ratones nulos gp91phox. Validación de activación de los macrófagos se ha demostrado anteriormente.

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No hay conflictos de interés declarado.

El método aquí descrito permite una medición rápida y cuantitativa de las especies reactivas del oxígeno en las células vivas, ya sea usando tintes sensibles a la oxidación o los sensores de plásmido. Los agonistas de los TLR (Toll-like receptors) son compuestos que estimulan a las células a través de los TLR en la superficie celular y la activación de las vías de señalización hacia abajo 15. En nuestro protocolo, se utilizaron tres diferentes TLR es decir agonistas, Lipo-teicoicos ácido TLR2 a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Attofluor cámara de celular </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Antimicina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> Medio DMEM glucosa baja </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> De crecimiento del endotelio suplemento factor (ECG) </td><td> Al norte del estado </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D-399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX Red </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti-MEM I Reducción media en suero </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina (10 veces) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer-cito </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer-dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> Poli (I: C) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> Prism 5.0 </td><td> GraphPad Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11,0 </td><td> Systat Software, Inc. </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina-EDTA (10 veces) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T-25 Frascos </td><td> Corning </td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T-75 Frascos </td><td> BD Falcon </td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96 y TC micro y placa </td><td> BD Falcon </td><td> 353072 </td></tr><tr><td> Zen software 2009 </td><td> Carl Zeiss 510 Meta microscopía confocal </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

El estrés oxidativo ha sido implicado en una serie de condiciones patológicas incluyendo el daño por isquemia / reperfusión y la sepsis. El concepto de estrés oxidativo se refiere a la formación aberrante de los ROS (especies reactivas de oxígeno), que incluye O 2 • -, H 2 O 2, y los radicales hidroxilo. Especies reactivas de oxígeno influye en multitud de procesos celulares, como la transducción de señales, la proliferación celular y muerte celular 1-6. ROS tienen el potencial de daño vascular y las células de órganos directamente, y puede iniciar reacciones químicas secundarias y las alteraciones genéticas que en última instancia, dar lugar a una amplificación de la lesión tisular mediada por ROS inicial. Un componente clave de la cascada de amplificación que agrava el daño irreversible del tejido es el reclutamiento y activación de células inflamatorias circulantes. Durante la inflamación, las células inflamatorias producen citoquinas tales como factor de necrosis tumoral α (TNF) y que la IL-1activan las células endoteliales (CE) y las células epiteliales y además aumentar la respuesta inflamatoria 7. La disfunción del endotelio vascular es una característica establecida de la inflamación aguda. Macrófagos contribuyen a la disfunción endotelial durante la inflamación por mecanismos que no están claros. La activación de los resultados de los macrófagos en la liberación extracelular de O 2 • - y varias citoquinas pro-inflamatorias, lo que desencadena la señalización patológica de las células adyacentes 8. NADPH oxidasas son la fuente principal y primordial de ROS en la mayoría de los tipos de células. Recientemente, se muestra por nosotros y otros 9,10 que ROS producido por NADPH oxidasas inducir la producción mitocondrial de ROS durante muchas condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto la medición de la producción mitocondrial de ROS es igual de importante, además de medir citosólica ROS. Los macrófagos producen ROS por la NADPH oxidasa flavoproteína enzima que juega un papel primordial en la inflamación. Una vez activado,NADPH oxidasa fagocítica produce grandes cantidades de O 2 • - que son importantes en el mecanismo de defensa del huésped 11,12. Aunque paracrina derivados de O 2 • - juega un papel importante en la patogénesis de las enfermedades vasculares, la visualización de paracrinos ROS inducida por la señalización intracelular, incluyendo la movilización de Ca 2 + sigue siendo hipótesis. Hemos desarrollado un modelo en el que los macrófagos activados se utilizan como fuente de O 2 • - la transducción de una señal a las células endoteliales adyacentes. El uso de este modelo se demuestra que los macrófagos derivados de O 2 • - llevar a la señalización del calcio en las células endoteliales adyacentes.

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Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Un método eficaz para obtener información sobre la visualización de la inducción paracrina derivados de ROS endotelial Ca2 + de señalización se describe. Este método tiene la ventaja de medir paracrina derivados ROS provocó la movilización de Ca2 + en las células endoteliales vasculares en un modelo de co-cultivo.

Visualización de Ca Vascular 2 + Señalización desencadenada por paracrina derivados ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

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Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K vistas.  Temple University. Un método eficaz para obtener información sobre la visualización de la inducción paracrina derivados de ROS endotelial Ca2 + de señalización se describe. Este método tiene la ventaja de medir paracrina derivados ROS provocó la movilización de Ca2 + en las células endoteliales vasculares en un modelo de co-cultivo.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Técnicas de Imagen Ca 2 + Señalización en el esperma humano

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Investigación

Biología

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

La visualización de la ATP sintasa dímeros en mitocondrias por Electron Cryo-tomografía

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Análisis de glucocorticoides fecales: Monitoreo suprarrenal no invasiva en los équidos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

La perfusión como un método para la visualización vascular<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

Visualización de compactación del ADN en cianobacterias por Tomography del Cryo-electrón de alta tensión

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

Retinales crio-secciones, montajes de todo y vasculatura aislado hipotónica preparados para la visualización de Immunohistochemical del pericitos microvasculares

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Un método de cultura Proximal para el estudio de señalización paracrina entre células

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

Reglamento de vía señalización innata mieloide por MALT1 Paracaspase actividad

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

Aplicaciones de la cartografía espacio-temporal y técnicas de análisis de partículas para cuantificar Ca intracelular2 + señalización In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...