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반응 산소 종은 산화에 민감한 염료 (1 &amp; 2)를 사용하거나 공촛점 현미경에 의해 플라스미드 센서를 (3, 4)를 사용하여 라이브 세포 측정할 수 있습니다. 1. J774 세포에서 cytosolic ROS의 시각화 <ol><li> 48 H. 35 - mm 요리 (하버드 장치) 유리 하단에 J774.1 마우스 단핵구 파생 macrophages를 (10 6 세포 / ML) 성장 </li><li> 37 6 H에 대한 ° C. : TLR의 agonists (1 μg / ML의 LPS - TLR4 작용제,, C) TLR3 작용제 10μg/ml, 폴리 (I 2 μg / ML, Lipo - teichoic 산 - TLR2 작용제)와 도전 세포 참고 : 유사한 조건 하에서 처리 Macrophages가 공동 문화 모델 칼슘 2 + 동원을 위해 사용되었습니다. </li><li> 추가 염료 H 2 DCF - DA (Invitrogen)는 ECM 10 μm의의 최종 농도 (세포 중간주는 산화에 민감한 : 121 MM NaCl, 5 MM NaHCO 3, 10 MM 나 - HEPES, 4.7 MM KCl, 1.2 MM KH 2 PO 4, 1.2 MM MgSO 4, 2 MM CaCl 2, 10MM의 포도당과 2.0 % dextran, 산도 7.4, 시그마에서 얻은 모든) 공촛점 현미경 아래에서 시각화하기 전에 20 분 요리와 부화 세포에 2 % BSA를 포함. </li><li> 염료로드 후, 적절한 이미징 시스템의 온도 제어 무대에서 배치 세포를 시각화. 우리는 40x 오일 목표 13 (그림 1A와 D)을 사용하여 DCF 형광에 대한 488 nm의의 여기에 아르곤 이온 레이저 소스와 결합 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템을 사용합니다. </li><li> ImageJ 소프트웨어 (1.44), 국립 보건원에서 다운 받으시면 소프트웨어 (Rasband, WAS, ImageJ, 건강, 베데스다, 메릴랜드, 미국의 미국 국립 연구소를 사용하여 이미지 분석 <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij를 /</a> , 1997-2009). </li></ol> 2. J774 세포에 mROS의 시각화 <ol><li> 48 H. 35 - mm 요리 (하버드 장치) 유리 하단에 J774.1 마우스 단핵구 파생 macrophages를 (10 6 세포 / ML) 성장 </li><li>mROS 생산 유발에 TLR의 리간드로 세포를 도전 (2 μg / ML, Lipo - teichoic 산 - TLR2를, 10μg/ml, 폴리 (I : C) TLR3, 1 μg / ML LPS - TLR4) 37 6 H에 대한 ° C. </li><li> ° C 허용 37 30 분 요리와 부화 세포에 2 % BSA를 포함하는 ECM에 5 μm의의 최종 농도를 제공 mitochondrial 초과 산화물 지표 MitoSOX 레드 (Invitrogen)를 추가 MitoSOX 레드의 로딩. </li><li> 염료로드 후, 40x 오일 목표 (그림의 1B와 E)를 사용 MitoSOX 레드 형광에 대한 561 nm의의 여기에 아르곤 이온 레이저 소스와 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템 부부의 온도 조절 무대에서 세포를 시각화. </li><li> 제어 실험, 염색로드 추가 PBS 또는 DMSO (대조군) 또는 2μM의 Antimycin 후 (mitochondrial 초과 산화물과 같은 발전기 - 긍정적인 제어) 세포하기 전에 이미지 샘플을 2.4 (그림 1C)에 설명된대로합니다. </li><li> ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 사용하여 이미지를 분석할 수 있습니다. </li></ol> 3. Visualizati안정적인 하이퍼 cyto MPMVECs에서 cytosolic ROS의에 <ol><li> 우리는 pHyPer - cyto (Evrogen) 포유 동물 발현 벡터 인코딩 세포질 및 H 2 O 2 14 특수 감각 submicromolar 농도 localizes 형광 센서 하이퍼를 사용합니다. </li><li> electroporation 또는 transfection의 시약을 사용 pHyPer - cyto 벡터와 Transfect Murine 폐 내피 세포 Microvascular (MPMVECs). 우리는 BioRad 진 pulser electroporator 시스템 (; 500 μF 250V)를 사용하여 electroporation을 통해 pHyPer - cyto의 10μg 10 X 10 6 세포와 transfect을 사용합니다. DMEM 매체에서 문화 MPMVECs 10 % FBS, 불필요한 아미노산, 내피 성장 보충 및 항생제로 보충. 참고 : 다음의 transfection, 식민지의 성장을 촉진하기 저밀도에서 플레이트 세포. </li><li> 500 μg / ML G418, transfection 후 48 시간과 보충 전체 문화 매체와 매체를 대체합니다. H의 높은 비율을 가지고 클론을위한 화면<html> yPer 긍정적인 세포와 하이퍼 긍정적인 세포 (그림 2)의 수를 증가시킬 통로 하이퍼 긍정적인 클론. 참고 : 우리는 매우 하이퍼 표현 안정적인 세포 하나의 세포와 화면의 clonal 선택에 대한 세포의 시리얼 희석을 사용합니다. </li><li> 0.2 % 젤라틴 코팅 coverslips (80 % 합류)에 안정적인 하이퍼 - cyto MPMVECs을 성장. 37 6 H에 대한 ° C. : TLR의 리간드 (1 μg / ML LPS - TLR4,, C) TLR3 10μg/ml, 폴리 (I 2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2)와 다음날 도전 세포 치료 세포가 통제 역할을합니다. </li><li> 치료 후, Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen)에 coverslips를 탑재합니다. 실로 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)을 따뜻하게 사전의 1ml를 추가하고 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템의 온도 제어 무대에서 챔버를 넣습니다. 시각화 및 40x 오일 목표 (그림 3A 및 D)을 사용하여 488 nm의의 여기에서 이미지 형광 변경합니다. </li><li> ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 (섹션 6 참조)를 사용하여 이미지를 분석합니다. </li></ol>안정적인 하이퍼 dMito MPMVECs에서 mitochondrial ROS의 itle &quot;&gt; 4. 시각화 <ol><li> 우리는 pHyPer - dMito (Evrogen) H 2 O 2의 특별히 mitochondria와 감각 submicromolar 농도 localizes 포유 동물 발현 벡터 인코딩 mitochondria 타겟 하이퍼를 사용합니다. </li><li> Transfect의 pHyPer - dMito와 MPMVECs 및 섹션 3.2-3.3에서 설명한 단계에 따라 안정적인 하이퍼 dMito의 MPMVECs를 생성합니다. </li><li> 0.2 % 젤라틴 코팅 coverslips (80 % 합류)에 안정적인 하이퍼 dMito MPMVECs을 성장. </li><li> 37 6 H에 대한 ° C. : TLR의 리간드 (1 μg / ML LPS - TLR4,, C) TLR3 10μg/ml, 폴리 (I 2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2)와 다음날 도전 세포 치료 세포는 대조군 역할을합니다. 2μM Antimycin (mitochondrial 초과 산화물 유도 - 긍정적인 제어) 사전 시각화 샘플을 추가합니다. </li><li> 치료 후, Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen)에 coverslips를 탑재합니다. 실로 미리 예열 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)의 1ml 추가그리고 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템의 온도 제어 무대에서 챔버를 넣습니다. 시각화 및 40x 오일 목표 (그림 3B, C 및 E)을 사용하여 488 nm의의 여기에 형광 이미지를 변경할 수 있습니다. </li><li> ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 (섹션 6 참조)를 사용하여 이미지를 분석합니다. </li></ol> 5. 칼슘 2 실행 paracrine - 파생 ROS의 시각화를위한 공동의 문화 모델 + 내피 세포의 신호 의 시각화 및 측정을위한 [칼슘 2 +] 나는 우리가 칼슘 2를 사용하여 변경 + 민감한 형광 염료 fluo - 4시 (Invitrogen). <ol><li> 0.2 % 젤라틴 코팅 25mm 유리 coverslips (80 % 합류)에 MPMVECs 성장. </li><li> AM fluo - 4로드 수 ECM 5 μm의 fluo - 4시 (Invitrogen) 최종 농도 2 %의 BSA와 0.003 %의 pluronic 산을 포함하는 30 분 상온에서 coverslips에서 자란 세포를 품어. 로딩 후 (ECM은 0을 포함하는 실험 이미징 솔루션 세포를 씻는다.염료 손실을 최소화하기 위해 sulfinpyrazone을 포함 25% BSA). </li><li> Attofluor 셀 챔버 (Invitrogen)에 fluo - 4, 마운트 coverslips로드 후에. 실로 실험 이미징 솔루션을 따뜻하게 사전의 800μl를 추가하고 칼 자이스 혈구 LSM 510 메타 공촛점 이미징 시스템의 온도 제어 스테이지에 배치하십시오. </li><li> 2퍼센트 BSA를 포함하는 ECM의 세포 추적기 빨간색 CMTPX (500ng/ml) (Invitrogen)과 (6 HR에 대한 LPS와 치료) 쥐 - 별도의 튜브 레이블에서 nonactivated 또는 활성 macrophages는 야생 형 또는 gp91 phox - / 중 격리 와 0.003 %의 pluronic 산. 실험 이미징 솔루션의 200μl와 세포를 씻고 resuspend. </li><li> 챔버 어셈블리에 fluo - 4로드 AM MPMVECs에 표시된 macrophages를 추가합니다. </li><li> fluo - 4 AM 및 세포 추적 빨간색 형광 respectivel에 대한 488 및 561 nm의 여기에있는 아르곤 이온 레이저 소스와 칼 자이스 혈구 LSM510 메타 공촛점 이미징 시스템을 사용하여 10-20 분 녹색과 빨간색 형광 매일 3S로 가져다 기록Y (Fig.4 AC). 참고 : 또는 J774.1 셀 라인 MPMVECs 칼슘 2 + 동원을 이끌어내는 데 사용될 수 있습니다. </li><li> 분석 fluo을 4 ImageJ 소프트웨어 (1.44)를 (섹션 6 참조)를 사용하여 형광 강도를 변경합니다. </li></ol> 6. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석 데이터 분석을위한. lsm 형식의 파일로 공촛점 시스템에서 얻은 이미지를 전송합니다. 선 (禅) 2009 LSM 510 메타 공촛점 현미경이나 LSM와 함께 제공되는 선 (禅) 2010 소프트웨어는 710 multiphoton 공촛점 현미경는 각각. lsm 형식의 파일을 저장합니다. 우리는이 네이티브를 사용하는 것이 좋습니다. lsm 파일을 이미지 분석을위한 원본의 품질이 유지 때문입니다. 이 파일 형식은 바로 다음 단계는 예를에게 하나의 이미지의 정량 분석​​을 제공합니다 이미지 분석 프로그램 이미지 J.에서 열 수 있습니다. 추가 플러그인이 데이터 분석을 위해 필요하지 않습니다. <ol><li> 파일&gt; 열기를 사용하여 이미지 J 프로그램에서 엽니다. lsm 또는. TIFF 파일 </li><li> 탭 이미지를 클릭&gt; COLOR&gt; 분할 채널과 녹색 DIC 채널을 분할. 이후 분석을위한 녹색 채널에서 이미지를 사용합니다. </li><li> 더블 클릭하고 &#39;타원형 브러쉬 선택 &quot;탭을 선택하고 20 픽셀 값을 설정합니다. </li><li> 하이퍼 cyto 이미지 들면, 측정의 원형 영역을 정의하는 하나의 셀을 클릭합니다. 그런 다음 선택 영역의 강도를 측정하는 &quot;M&quot;키를 누릅니다. 값은 새로운 결과 창에서 유지됩니다. </li><li> &quot;M&quot;키를 눌러 다음 다른 영역을 선택하려면 다른 휴대폰으로 &quot;Shift&quot;키를 클릭 누른 다음. 강도는 결과 창에 기록됩니다. 50 다른 세포에있는 4-5 단계를 반복합니다. </li><li> 하이퍼 D - 미토 이미지의 타원형 브러쉬 선택에서 10 픽셀 값을 설정합니다. 관심 영역 (ROI)은 수동으로 특정 세포의 mitochondria를 포함하여 추적할 수 있습니다. </li><li> 프리핸드 사용의 영역을 추적 &quot;M&quot;을 다음 Enter 키를 누릅니다 mitochondria와 그 주변. 50 다른 세포에있는 6-7 단계를 반복합니다. </li><li> 나를 복사<html> 엑셀 시트 또는 결과를 계획하는 모든 소프트웨어에 결과 창 및 붙여넣기에서 값을 표시합니다. 우리는 그래프로 데이터를 계획하는 SigmaPlot 또는 Graphpad PRISM 중 하나를 사용합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 그림 1은 TLR의 리간드와 도전에 cytosolic 및 mitochondrial ROS 생산을 보여줍니다. 대표 공촛점 이미지는 DCF (cytosolic)와 MitoSOX 레드 (mitochondria) 자극 6 시간 후 형광의 증가를 보여줍니다. 형광 변경 사항은 접어 변화로 정규화 및 표현했다. 그림 2는 안정적인 하이퍼 cyto 및 하이퍼 dMito 내피 세포의 생성을 보여줍니다. 마우스 내피 세포는 pHyPer - cyto 또는 electroporation을 통해 pHyPer - dMito 플라스미드 구조와 transfected되었다. 셀 안정 표현 plasmids 두 주 동안 G418로 선택되었습니다. 선택 후, 희석 세포는 96 잘 접시에 씨앗을 품고 있었다. 개별 식민지들이 고립 및 균질 표현 몇 군데 있었다. e_content &quot;&gt; 그림 3은 내피 cytosolic 및 mitochondrial H 2 O 2 수준의 측정을 보여줍니다. 대표 공촛점 이미지 하이퍼 cyto (cytosolic)와 하이퍼 dMito (mitochondria) 자극 6 시간 후 형광의 증가를 표시합니다. 형광 강도 변화가 정상화되었습니다 , 접이식 변화로 표시됩니다. 그림 4는 대식 세포 - 파생 ROS 유도된 내피 cytosolic 칼슘 2 + 동원의 평가를 보여줍니다. LPS 자극 macrophages는 이전에 다음 ID로 세포내 칼슘 2로드했다 폐동맥 내피 세포 microvascular (PMVEC)에 추가되었습니다 + ([칼슘 2 +] I) 표시기 염료 Fluo - 4. 야생 유형 LPS - 활성화 macrophages의 응용 프로그램은 [칼슘 2 +] evoked 전 기능 NADPH 산화 효소의 녹아웃에 의해 감쇠되었다 PMVECs의 상승 (gp91 phox - / -). <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. Visualizati대식 세포의 세포에 대한 ROS 및 mitochondrial 초과 산화물이 생성되었습니다. J774.1 세포는 TLR2, 3 및 4 리간드와 함께 도전했다 (2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2, 10μg/ml, 폴리 (I : C) TLR3, 1 μg / ML LPS - TLR4). 6 H에 대한 37 ° C. 치료 세포와 함께 로드된 뒤에 (A) 세포 ROS 지표 (H 2 DCF - DA, 녹색 형광) 또는 (B) mitochondrial 초과 산화물 표시기 (MitoSOX 적색, 적색 형광). (C) Antimycin는 mitochondrial ROS 생산에 대한 긍정적인 제어로 사용되었다. 형광 강도 변경 공촛점 현미경을 사용하여 평가되었다. (D)와 의미 형광의 변화 (E) Quantitation. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. 내피 세포 cytosolic 및 mitochondrial ROS 지표의 안정적인 표현을 생성 도식 표현. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. V. 내피 cytosolic 및 mitochondrial H 2 O 2 수준의 isualization은 안정 (A) 하이퍼 - cyto을 표현 MPMVECs 또는 (b) 하이퍼 dMito는 TLR2, 3 및 4 리간드 (2 μg / ML, Lipoteichoic 산성 - TLR2와 도전을했고, 10μg / ML, 폴리 (I : C) TLR3, 37 6 H 1 μg / ML LPS - TLR4) ° C. (C) Antimycin는 mitochondrial ROS 생산에 대한 긍정적인 제어로 사용되었다. 치료 후, 형광 강도 변경 공촛점 현미경을 사용하여 평가되었다. (D)와 의미 형광의 변화 (E) Quantitation. <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. ROS는 장애 내피 세포 칼슘 2 + 동원을 이끌어내는 대식 세포 - 파생. (A) 내피 세포 / 세포 대식 세포의 공동 문화 모델 연구의 도식 표현. WT과 gp91phox NULL 마우스 (잭슨 연구소) 모두에서 (B) 갓 격리 murine macrophages는 6 H. 1 μg / ML LPS에 의해 활성화되었다 Macrophages가 휴대 추적기 레드 (적색)으로 표시하고 paracrine O 2 • 평가하는 Fluo - 4로드 PMVECs (녹색)에 추가되었습니다 -. 신호를 (C) WT 생쥐로부터 격리 LPS - 활성화 macrophages는 크고 빠른 칼슘 2 + 동원을 촉발 PMVECs에 gp91phox의 NULL 마우스에서 macrophages에 비해. 대식 세포 활성의 검증는 이전에 다음 ID로 증명되었습니다.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

방법은 세포를 살아있는 하나 산화에 민감한 염료 또는 플라스미드 센서를 사용하여 반응 산소 종의 신속하고 양적 측정이 가능합니다 여기에 설명했다. TLRs의 Agonists (수신자 같은 수용체)는 세포 표면에 존재하는 TLRs를 통해 세포를 자극하고 다운 스트림 신호 경로 15 트리거 화합물입니다. 우리의 프로토콜에서는, 우리는 세 가지 다른 TLR의 agonists의 즉 사용, Lipo - teichoic 산 - TLR2 작용제,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Attofluor 셀 챔버 </td><td> Invitrogen </td><td> A7816 </td></tr><tr><td> Antimycin </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM 낮은 포도당 매체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td> 내피 성장 인자의 보충 (ECGS) </td><td> 북부 </td><td> 02-102 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Invitrogen </td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td> Invitrogen </td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td> Invitrogen </td><td> D - 399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOX 레드 </td><td> Invitrogen </td><td> M36008 </td></tr><tr><td> Opti - 가상 저는 세럼 매체를 감소 </td><td> Invitrogen </td><td> 51985091 </td></tr><tr><td> 펜 / Strep (10X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer - cyto </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer - dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td> 폴리 (I : C) </td><td> 시그마 알드리치 </td><td> P0913 </td></tr><tr><td> 프리즘 소프트웨어 5.0 </td><td> GraphPad 소프트웨어, 주식 회사 </td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlot 11.0 </td><td> Systat 소프트웨어, 주식 회사 </td><td></td></tr><tr><td> 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (10X) </td><td> Invitrogen </td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T - 25 Flasks </td><td> 코닝 </td><td> 430,639 </td></tr><tr><td> T - 75 Flasks </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,136 </td></tr><tr><td> T 96 - 웰C 마이크로 잘 플레이트 </td><td> BD 팔콘 </td><td> 353,072 </td></tr><tr><td> 선 (禅) 2009 소프트웨어 </td><td> 칼 자이스 혈구 510 메타 공촛점 현미경 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of vascular ca2+ signaling triggered by paracrine derived ros

산화 스트레스는 국소 빈혈 / reperfusion 손상과 패혈증을 포함한 pathologic 조건의 숫자에 연루되었습니다. , H 2 O 2, 및 수산기 래디 칼 - 산화 스트레스의 개념은 O 2 • 포함 ROS의 비정상적 형성 (반응 산소 종)를 말합니다. 반응 산소 종은 신호 전달, 세포 증식 및 세포 사망을 포함하여 1-6 세포 프로세스의 다수에 영향을 미칩니다. ROS는 직접 혈관과 장기의 세포를 손상 가능성을 가지고 있고, 궁극적으로 초기 ROS - 인한 조직 손상의 증폭의 결과 보조 화학 반응과 유전자 변경을 시작할 수 있습니다. 돌이킬 수없는 조직의 손상을 exacerbates 증폭 캐스케이드의 핵심 구성 요소는 염증 세포를 순환의 모집 및 활성화됩니다. 염증 동안, 염증 세포는 종양 괴사 인자 - α (TNFα)와 IL - 1 것과 크린 시토킨 생산내피 세포 (EC)와 상피 세포를 활성화하고 추가로 염증 반응 7 확대. 혈관 내피 기능 장애는 급성 염증의 설립 기능입니다. Macrophages가 불분명 메커니즘에 의해 염증 동안 내피 부전에 기여한다. O 2의 세포 릴리스에 macrophages 결과의 활성화 • - 인접 세포에 pathologic 신호 8 트리거 및 다양한 프로 염증성 크린 시토킨. NADPH의 oxidases은 세포 유형의 대부분 ROS의 전공 및 기본 소스입니다. 최근에, 그것은 NADPH의 oxidases에 의해 만들어진 ROS는 많은 pathophysiological 조건 중에 mitochondrial ROS 생산을 유도 것을 우리와 다른 9,10에 의해 표시됩니다. 따라서 mitochondrial ROS 생산을 측정하는 것은 cytosolic ROS를 측정 이외에 똑같이 중요합니다. Macrophages는 염증에 중요한 역할을 담당 flavoprotein의 효소 NADPH 산화 효소에 의해 ROS를 생성합니다. 일단 활성화,phagocytic NADPH 산화 효소는 O 2 •의 풍부한 양의 생산 - 호스트 방어 메커니즘 11,12에 중요하다는 것을. paracrine - 파생 O 2 •이 있지만 - 혈관 질환, CA 2를 포함하여 paracrine ROS 유도된 세포 내 신호의 시각화의 pathogenesis에 중요한 역할을 + 동원은 아직 가설이다. 인접한 내피 세포에 신호를 transduce에 - 우리는 활성화 macrophages는 O 2의 소스 • 사용되는 모델을 개발했습니다. 인접한 내피 세포에 신호 칼슘을 초래할 -이 모델을 사용 우리가 O 2 •이 대식 세포 - 파생 보여줍니다.

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Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

내피 Ca2 + 신호의 paracrine 파생 ROS 유도를 시각화에 대한 통찰력을 얻기 위해 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 공동의 문화 모델에서 혈관 내피 세포의 Ca2 +의 동원을 촉발 paracrine 파생 ROS 측정을 활용합니다.

혈관 CA의 시각화 2 + Paracrine 유래 ROS에 의해 트리거된 신호

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

15.4K 조회수.  Temple University. 내피 Ca2 + 신호의 paracrine 파생 ROS 유도를 시각화에 대한 통찰력을 얻기 위해 효율적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 공동의 문화 모델에서 혈관 내피 세포의 Ca2 +의 동원을 촉발 paracrine 파생 ROS 측정을 활용합니다.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

이미징 CA의 기술 2 + 인간 정자의 시그널링

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

연구

생물학

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as cells, organelles, membrane vesicles, or viruses at molecular detail. To achieve this, the aqueous sample is rapidly vitrified in liquid ethane, which preserves it in a close-to-native, frozen-hydrated state. In the electron microscope, tilt series are recorded at liquid nitrogen temperature, from which 3D tomograms are reconstructed. The signal-to-noise ratio of the tomographic volume is inherently low. Recognizable, recurring features are enhanced by subtomogram averaging, by which individual subvolumes are cut out, aligned and averaged to reduce noise. In this way, 3D maps with a resolution of 2 nm or better can be obtained. A fit of available high-resolution structures to the 3D volume then produces atomic models of protein complexes in their native environment. Here we show how we use electron cryo-tomography to study the in situ organization of large membrane protein complexes in mitochondria. We find that ATP synthases are organized in rows of dimers along highly curved apices of the inner membrane cristae, whereas complex I is randomly distributed in the membrane regions on either side of the rows. By subtomogram averaging we obtained a structure of the mitochondrial ATP synthase dimer within the cristae membrane.

We present a protocol of how to collect and process electron cryo-tomograms of whole mitochondria. The technique provides detailed insights into the structure, function, and organization of large membrane protein complexes in native biological membranes.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

대변​​ 글루코 코르티코이드 분석 : equids는 비 침습적 부신 모니터링

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

혈관 시각화를위한 DiI 관류<em&gt; 암 브리 스 토마 멕 시카 눔</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to occur in some cyanobacteria before cell division. However, due to the large cell size and the transient character, it is difficult to investigate the structure in detail. To overcome the difficulties, first, DNA compaction is reproducibly produced in the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 by synchronous culture using 12 h each light/dark cycle. Second, DNA compaction is monitored by fluorescence microscopy and captured by rapid freezing. Third, the detailed structure of DNA compacted cells is visualized in three dimensions (3D) by high voltage cryo-electron tomography. This set of methods is widely applicable to investigate transient structures in bacteria, e.g. cell division, chromosome segregation, phage infection etc., which are monitored by fluorescence microscopy and directly visualized by cryo-electron tomography at appropriate time points.

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. Synchronous cultivation, monitoring by fluorescence microscopy, rapid freezing, and high voltage cryo-electron tomography are used. A protocol for these methodologies is presented, and future applications and developments are discussed.

높은 전압 Cryo 전자 단층 촬영으로 박테리아의 DNA 압축의 시각화

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&amp;#946; Signaling

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular pericytes are central to ophthalmological research. It is vital to choose an appropriate method of visualizing the microvascular pericytes. We describe retinal microvascular pericyte immunohistochemical staining in cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature using antibodies for platelet-derived growth factor receptor &#946; (PDGFR&#946;) and nerve/glial antigen 2 (NG2). This allows us to highlight advantages and shortcomings of each of the three tissue preparations for the visualization of the retinal microvascular pericytes. Cryo-sections provide transsectional visualization of all retinal layers but contain only a few occasional transverse cuts of the microvasculature. Whole-mount provides an overview of the entire retinal vasculature, but visualization of the microvasculature can be troublesome. Hypotonic isolation provides a method to visualize the entire retinal vasculature by the removal of neuronal cells, but this makes the tissue very fragile.

We demonstrate three different tissue preparation techniques for immunohistochemical visualization of rat retinal microvascular pericytes, i.e., cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolation of the vascular network.

망막 Cryo-섹션, Microvascular Pericytes의 Immunohistochemical 시각화에 대 한 전체-마운트 및 소형 고립 된 맥 관 구조

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Paracrine or juxtacrine signaling mediates such interactions. The use of a conditioned medium and coculture studies are the most common methods to discriminate between these two types of interactions. However, the effect of localized high concentrations of secreted factors in the microenvironment during the paracrine interactions is not accurately recapitulated by conditioned medium and, thus, may lead to imprecise conclusions. To overcome this problem, we have devised a proximal culture method to study paracrine signaling. The two cell types are grown on either surface of a 10 &#181;m-thick polycarbonate membrane with 0.4 &#181;m pores. The pores allow the exchange of secreted factors and, at the same time, inhibit juxtacrine signaling. The cells can be collected and lysed at the endpoint to determine the effects of the paracrine signaling. In addition to allowing for localized concentration gradients of secreted factors, this method is amenable to experiments involving prolonged periods of culture, as well as the use of inhibitors. While we use this method to study the interactions between ovarian cancer cells and the mesothelial cells they encounter at the site of metastasis, it can be adapted to any two adherent cell types for researchers to study paracrine signaling in various fields, including tumor microenvironment, immunology, and development.

Paracrine and juxtacrine cellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and development. Here, a proximal culture method is used to study paracrine signaling where the localized concentrations of the secreted factors are maintained while preventing direct cellular contact.

Paracrine 신호 세포 사이 공부 하는 인접 문화 방법

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells downstream of pattern recognition receptors. Best studied are the Dectin-1 and Dectin-2 members of the C-type lectin-like receptor family that induce a SYK- and CARD9-dependent signaling cascade leading to NF-&#954;B activation, in a MALT1-dependent manner. By contrast, Toll-like receptors (TLR), such as TLR-4, propagate NF-&#954;B activation but signal via an MYD88/IRAK-dependent cascade. Nonetheless, whether MALT1 might contribute to TLR-4 signaling has remained unclear. Recent evidence with MLT-827, a potent and selective inhibitor of MALT1 paracaspase activity, indicates that TNF- production downstream of TLR-4 in human myeloid cells is independent of MALT1, as opposed to TNF- production downstream of Dectin-1, which is MALT1 dependent. Here, we addressed the selective involvement of MALT1 in pattern recognition sensing further, using a variety of human and mouse cellular preparations, and stimulation of Dectin-1, MINCLE or TLR-4 pathways. We also provided additional insights by exploring cytokines beyond TNF-, and by comparing MLT-827 to a SYK inhibitor (Cpd11) and to an IKK inhibitor (AFN700). Collectively, the data provided further evidence for the MALT1-dependency of C-type lectin-like receptor &#8212;signaling by contrast to TLR-signaling.

MALT1 regulates innate immunity but how this occurs remains ill-defined. We used the selective MALT1 paracaspase inhibitor MLT-827 to unravel the contribution of MALT1 to innate signaling downstream of Toll-like or C-type lectin-like receptors, demonstrating that MALT1 regulates the production of myeloid cytokines, and downstream of C-type lectin-like receptors, selectively.

골수성 타고 난 신호 통로에 한 규제 MALT1 Paracaspase 활동

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires careful and in-depth analyses and quantification to capture as much information about the underlying events as possible. Spatial, temporal and intensity parameters intrinsic to Ca2+ signals such as frequency, duration, propagation, velocity and amplitude may provide some biological information required for intracellular signalling. High-resolution Ca2+ imaging typically results in the acquisition of large data files that are time consuming to process in terms of translating the imaging information into quantifiable data, and this process can be susceptible to human error and bias. Analysis of Ca2+ signals from cells in situ typically relies on simple intensity measurements from arbitrarily selected regions of interest (ROI) within a field of view (FOV). This approach ignores much of the important signaling information contained in the FOV. Thus, in order to maximize recovery of information from such high-resolution recordings obtained with Ca2+dyes or optogenetic Ca2+ imaging, appropriate spatial and temporal analysis of the Ca2+ signals is required. The protocols outlined in this paper will describe how a high volume of data can be obtained from Ca2+ imaging recordings to facilitate more complete analysis and quantification of Ca2+ signals recorded from cells using a combination of spatiotemporal map (STM)-based analysis and particle-based analysis. The protocols also describe how different patterns of Ca2+ signaling observed in different cell populations in situ can be analyzed appropriately. For illustration, the method will examine Ca2+ signaling in a specialized population of cells in the small intestine, interstitial cells of Cajal (ICC), using GECIs.

Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ

Genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) have radically changed how in situ Ca2+ imaging is performed. To maximize data recovery from such recordings, appropriate analysis of Ca2+ signals is required. The protocols in this paper facilitate the quantification of Ca2+ signals recorded in situ using spatiotemporal mapping and particle-based analysis.

세포내 캘리포니아2 + 제자리에서 신호 계량 Spatio 시간적 매핑 및 입자 분석 기법에의 응용

Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...