Demostramos innumerables métodos para todo el control óptico y la observación de la actividad celular desencadenada en cardiomiocitos derivados de iPSC para la detección de drogas de alto rendimiento y la prueba de toxicidad. Permiten la cuantificación multiparamétrica de los patrones fenotípicos en el tiempo y el espacio, permiten observar el efecto de los fármacos durante horas o días. Este método se puede aplicar a diferentes tipos de células, como neuros o células beta, para la detección funcional y la prueba de toxicidad.
Demostrando el procedimiento estará Wan-Chi Su, un ingeniero de bioimagen de mi laboratorio. Prepare la placa de pocillos múltiples antes de retirar los cardiomiocitos iPSC del almacenamiento en frío para su descongelación. Cubra cada pocillo de la microplaca de 96 pocillos con 100 microlitros de solución de gelatina al 0,02% con 50 microgramos por mililitro de fibronectina para cubrir bien todas las superficies.
Transfiera los cardiomiocitos iPSC del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido a un baño de agua de 37 grados centígrados. Lleve el vial a un gabinete de bioseguridad de clase dos y transfiera suavemente el contenido a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de medio a temperatura ambiente. Centrifugar las células a 200 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente.
Deseche el sobrenadante con pipeta y vuelva a suspender suavemente las células en un mililitro de medio con 10 inhibidores micromolares de ROCK Y27632. Las células de placa recubrieron 96 placas de pocillos con una densidad de 100, 000 a 150, 000 células por centímetro cuadrado, según las instrucciones del fabricante. Después de 24 horas, asegúrese de que las células unidas a la superficie de la placa estén en contacto con otras células.
Después de colocar las células durante 72 horas, descongele los kits virales GECI en hielo. Prepare una solución de stock de kit viral de doble fuerza con el medio de mantenimiento. Prepare las células para la infección ajustando el volumen medio a 100 microlitros por pocillo.
Agregue 100 microlitros de la solución viral premezclada a los pozos e incube durante ocho a 16 horas a 37 grados centígrados. Después de la incubación, reemplace con 200 microlitros de medio precalentado. Visualice la expresión de GECIs 24 horas después de la transducción utilizando un sistema de imágenes.
Mantenga las células en la incubadora humidificada antes de realizar ensayos funcionales. Encienda todos los dispositivos del sistema de imágenes de alto contenido. Verifique que la temperatura de la cámara alcance los 37 grados centígrados con un 5% de suplementación de dióxido de carbono.
Abra el software de imágenes y elija la configuración de la placa para una placa de 96 pocillos. Coloque una placa de 96 pocillos sin tapa en la cámara y cargue el anillo de sellado de células vivas en la parte superior. Elija la lente objetivo de inmersión en agua 20X, 60X y 20X, de acuerdo con la resolución espacial requerida.
Ajuste el enfoque para tomar imágenes claras antes de la adquisición experimental. Seleccione de tres a cinco regiones al azar por pocillo para el registro de la actividad del calcio. Elija los filtros apropiados para diferentes indicadores.
Establezca la potencia de diodo emisor de luz adecuada para cada canal de imagen utilizado. Establezca el tiempo de exposición de la cámara en un máximo de 40 milisegundos o 25 hercios, y una duración de grabación de 30 segundos para la adquisición de flujo para observar transitorios de calcio, informados por las sondas MNG-GECO y K-GECO expresadas en cardiomiocitos. Aumente la potencia del LED si la relación señal/ruido es inferior a dos a velocidades de cuadro más altas.
Para la estimulación optogenética, optimice la potencia y la frecuencia de la luz azul a un hercio, y comience la adquisición. Vuelva a suspender la dofetilida E4031 y el verapamilo en DMSO y dilúyalos con el tampón de Tyrode. Organice bien los compuestos en el objetivo correspondiente.
Agregue 100 microlitros del compuesto de doble resistencia a través del sistema microfluídico automático en los pozos y comience la adquisición después del período de incubación deseado. Aísle el área de la señal del fondo detectando automáticamente la función de pulsos, a lo largo de la resolución del tiempo, con el software. Utilice el software de análisis de picos de calcio para analizar la frecuencia de latido, la señal máxima, la duración transitoria del calcio 50% de duración transitoria de calcio 90% de tiempo de aumento y el tiempo de descomposición.
La observación de la oscilación espontánea del calcio en NMG-GECO expresada por cardiomiocitos derivados de iPSC con o sin tratamientos farmacológicos se demuestra en el video. Las trazas cinéticas obtenidas utilizando MNG-GECO mostraron que los pequeños inhibidores moleculares del canal iónico verapamilo, dofetilida y E4031 afectaron los transitorios de calcio como se esperaba. Para evaluar la respuesta a la dosis de E4031 en condiciones estandarizadas y de ritmo canalrodepsina-2 y K-GECO que expresan iPSC CMs se controlaron ópticamente utilizando pulsos de luz de un hertz y 470 nanómetros, y se observaron utilizando la señal roja K-GECO.
Las reducciones progresivas de la amplitud máxima y el aumento en el tiempo de desintegración de los transitorios de calcio ocurren con concentraciones crecientes de E4031. Un efecto dependiente de la dosis de E4031 fue más evidente para las reducciones en la amplitud máxima. Los transitorios de calcio claro permanecen visibles un mes después de la transducción viral, o sin la luz adicional utilizada para la estimulación óptica.
El gráfico muestra un fármaco que parece aumentar la frecuencia de latido, regularizar el intervalo de contracción y aumentar la amplitud transitoria del calcio, en el modo LVNC iPSC CM. La variabilidad de la frecuencia de latido, y el impacto posterior en la duración transitoria del calcio, también cambian a medida que iPSC CM se mantienen en cultivo. Se han desarrollado varios GECI, incluidos ER LAR-GECO, MTG-Sepia y NIR-GECO, para la expresión individualmente o en combinación en modelos celulares para la medición de la actividad del calcio en tiempo real que surge en el retículo endoplásmico, el retículo sarcoplásmico, las mitocondrias y el citosol, respectivamente.
Los GECI se pueden combinar en el modelo iPSC CM para estudiar diferentes reservas intracelulares de calcio. Los cardiomiocitos que expresan K-GECO mostraron un comportamiento de latido constante a lo largo del tiempo. Sin embargo, la carga de Fluo-4 afectó tanto a la frecuencia de latido como a la CTD en este modelo, lo que sugiere que Fluo-4, en sí mismo, podría influir en los resultados de tales experimentos.
Ofrecemos una forma sencilla de estudiar perfiles fenotípicos de células de control y derivadas de pacientes, mientras que iPSC intermedio puede arrojar luz sobre el descubrimiento de fármacos en diversas enfermedades.
