Este video demostrará un método simple para investigar múltiples genes candidatos en AML en paralelo, utilizando el sistema Crisper-Cas9 combinado con el ensayo de crecimiento competitivo basado en citometría de flujo. La principal ventaja de esta técnica es que es rápida y escalable. Demostrando el procedimiento estará Bo Rui Chen, un postdoctorado de nuestro laboratorio.
Un software de diseño CRISPR basado en la web se utiliza para diseñar de cuatro a seis ARN de guía única para el gen de interés. Para empezar, rellene la información adecuada en los campos con asteriscos. A continuación, seleccione el genoma objetivo para el diseño de ARN de guía única.
Pegue la secuencia de destino en el cuadro de secuencia y haga clic en el botón Enviar. Para la clonación en el plásmido de expresión de ARN guía único deseado, anteponga los nucleótidos CACC al sentido oglionucleótido y AAAC al oligonucleótido antisocio complementario inverso. Los oligonucleótidos antisoque y antisoquerones premezclados se ordenan a una empresa en una placa de 96 pozos, etiquetada Oligo Mix.
Establezca una placa de pozo U-Bottom 96 separada, etiquetada placa de recocido. Preparar una mezcla maestra de un microlitro de polinucleótido quinasa T4, un microlitro de 10x tampón de ligadura de ADN T4 y seis microlitros de agua por reacción de recocido. Añadir 8 microlitros de la mezcla maestra a cada pozo de la placa de recocido, seguido de 2 microlitros de sentido premezclado y oligonucleótidos antisosales.
Pipetear dos o tres veces suavemente para mezclar bien, y luego girar la placa brevemente para conseguir las mezclas a la parte inferior de los pozos. Utilice el siguiente programa de recocido en una máquina PCR. 37 grados Celsius durante 30 minutos, 95 grados Celsius durante dos minutos y 30 segundos, seguido de enfriamiento lento a 22 grados Celsius a una velocidad de 0.1 grados Celsius por segundo.
Cuando el recocido esté completo, prepare una placa fresca de 96 pozos, etiquetada Diluted Oligo Mix, diluyendo los oligonucleótidos fosforilados y recocidos de la reacción de recocido de uno a 200 con agua. Linealice el vector de expresión de ARN guía único digiriendo cinco microgramos del vector con 1,5 microlitros de enzima de restricción BBS1, utilizando un tampón adecuado a 37 grados centígrados durante dos horas. A continuación, tome una placa de 96 bien etiquetada con la placa de ligadura, y agregue 20 nanogramos del vector de expresión de ARN de guía única digerido BBS1 a una ligadura de ARN de guía única bien deseada.
A esto, añadir 2 microlitros de oligonucleótidos recocidos fosforilados de la placa Oligo Mix diluida. Añadir a cada pozo, un microlitro de 10X T4 tampón de ligasa, y un microlitro de enzima ligasa T4, y pipetear suavemente para mezclar. Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas.
Unos 10 minutos antes de que se realice la reacción de ligadura, Llene 90 microlitros de células de E.coli químicamente competentes sobre hielo. Transfiera 10 microlitros alícuotas de las células competentes a cada pozo de una placa separada de 96 pozos individualmente. Añadir la mezcla de ligadura en los potes que contienen las células competentes.
Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo, e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Pipetear cinco microlitros de la bacteria MEZCLA de ADN de cada reacción de transformación directamente en un pozo de una placa de 6 pozos, que contiene agar LB con 100 miligramos por mililitro de ampicilina. Agregue aproximadamente cinco a ocho cuentas de vidrio a cada pozo, y agite la placa de 6 pozos de ocho a 10 veces en un movimiento circular.
Incubar las placas a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, escoge de una a dos colonias individuales de cada pozo, con una punta estéril de pipeta de 20 microlitro, y raya en un punto etiquetado en un plato estéril de 10 centímetros de petri, con agar LB y 100 miligramos por mililitro de ampicilina Después de rayar la placa LB, expulsa la punta en tres mililitros de medio de ampicilina en un tubo inferior redondo de 14 mililitros , marcado con el número de clon bacteriano correspondiente. La placa bacteriana se envía directamente para la secuenciación de Sanger.
Después de una confirmación de secuencia de los ARN de guía individual clonados, purifique el ADN del tubo de 14 mililitros correspondiente, utilizando un kit de miniprep de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las partículas lentivirales de ARN de guía única se producen en un formato de 96 pozos, como se describe en el protocolo de texto. Y el sobrenadante viral se congela inmediatamente a menos 80 grados centígrados.
Un día antes de la transducción de ARN de guía único en células AML Cas9, recubr un cultivo de fondo plano no tejido tratado 96 placa de pozo, con 100 mililitros de fragmento de fibronectina humana recombinante a una concentración de 10 microgramos por mililitro. Envuelva la placa con envoltura de adherencia para evitar la pérdida de evaporación, y déjela en el banco durante la noche. Al día siguiente, retire el fragmento de fibronectina humana recombinante de cada pozo de la placa de 96 pozos.
Descongelar el sobrenadante viral de cada ARN guía individual a temperatura ambiente. Añadir 50 microlitros de sobrenadante viral de cada tubo a cada pozo recubierto de la placa de transducción. Envuelva la placa con envoltura de adherencia para evitar la posible contaminación durante la centrifugación.
Gire la placa a 1.300 veces g a 35 grados Celsius durante 90 minutos. Hacia el final de la espinfección, cuente las células B3 clon altas de Cas9 desde el matraz de cultivo. Después de contar, gire hacia abajo el número requerido de células, y resuspend en medio fresco.
Después de la espinfección de 90 minutos, utilice una pipeta multicanal ajustada a 50 microlitros para quitar el sobrenadante de todos los pozos lentamente inclinando la placa. Añadir 100 microlitrotro del cultivo de células clon B3 a cada pozo lentamente, deslizándose hacia abajo desde el borde. Gire la placa a 1.300 veces g a 35 grados Celsius durante dos minutos para dejar que las células se asienten hasta el fondo.
Transfiera la placa a una incubadora de grado de cultivo de tejido de 37 grados Celsius. Al día siguiente, añada 100 microlitros de medio fresco a cada célula transducida de ARN guía único, de modo que el volumen medio final sea de 200 microlitros. Devuelva la placa a la incubadora.
72 horas después de la transducción, compruebe el porcentaje de ARN guía único que contiene células positivas BFP en cada pozo por citometría de flujo. Utilice un tinte de viabilidad celular para marcar y excluir las células muertas del análisis. Continúe re-encotando una proporción de las células en nuevos pozos con medio fresco después de cada análisis de hechos para evitar el crecimiento excesivo durante el ensayo.
Cada dos o tres días, repita el análisis de los hechos para verificar la proporción relativa de células positivas de BFP en comparación con las contrapartes negativas de BFP. Analice el porcentaje de celdas positivas de BFP para cada punto de tiempo, utilizando un software de análisis de hechos. La clave del éxito del ensayo de proliferación competitiva es utilizar las técnicas de medición adecuadas para garantizar que los números de células vivas eventuales sean precisos.
Arrastre archivos FCS para cada muestra al software. Haga doble clic en cualquier archivo de muestra y trace una gráfica de puntos de dispersión hacia delante frente frente a dispersión lateral, con dispersión hacia delante en el eje X y dispersión lateral en el eje Y. Puerta a todas las celdas.
Haga doble clic en las celdas cerradas y trace la mancha de viabilidad en el eje Y frente a la altura de dispersión hacia adelante o la gráfica de puntos de área. Puerta de la viabilidad mancha las células negativas. Haga doble clic en las celdas vivas cerradas y trace BFP en el eje Y frente a la dispersión hacia adelante en el eje X.
Puerta de las celdas positivas BFP. Aplique todas estas puertas a todos los ejemplos arrastrando la muestra seleccionada a todas las muestras bajo la pestaña de grupo. Haga clic en el editor de tablas para crear una tabla de análisis de todos los ejemplos.
Arrastre el recuento positivo de BFP de una muestra a la tabla y haga clic en el botón de visualización en el editor de tablas para crear un informe por lotes de todos los ejemplos, con la tabla que muestra el porcentaje de celdas positivas de BFP. Guarde la tabla como un archivo de Excel. Este sistema se utilizó para investigar el papel de los genes que pueden desempeñar un papel en la proliferación o supervivencia de las líneas celulares AML humanas y murinas.
Dirigirse al locus de puerto seguro AAVS1 con dos ARN de guía único separados no tuvo ningún efecto en la proliferación de células humanas MOM13 Cas9 En contraste, cuando se apuntó al gen asociado a la replicación del ADN, RPA3, se observó una disminución progresiva y significativa en el porcentaje de células positivas de la BFP en comparación con las contrapartes negativas notransducidas de la BFP. Del mismo modo, los efectos de los ARN de guía única dirigidos a Dot1l, un regulador epigenético, y Rhodopsin, el gen de pigmentación ocular, se probaron en células MLL-AF9 Cas9 de ratón. Los ARN de guía única dirigidos a Dot1l, mostraron una disminución dramática y progresiva de la proliferación competitiva en contraste con los ARN de guía única dirigidos a Rhodopsin.
Estos resultados demuestran la vulnerabilidad de las células de leucemia de masa MLL-AF9 al agotamiento de Dot1l, confirmando resultados publicados anteriormente. Suponiendo de cuatro a seis ARN guía por gen, este método es adecuado para ser utilizado para probar al menos 16 a 24 genes en paralelo, y también se puede aplicar para probar las dependencias genéticas en cualquier línea celular de cáncer. En el caso de un mayor número de genes, como una vía molecular completa que necesita ser probada en células AML, las pantallas basadas en CRISPR-Cas9 de la reserva serán más útiles.
