저자는 실험과 초기 도움 아만다 Struckhoff 감사드립니다. 이 작품은 NIH 5RO1CA115706에서 교부금에 의해 지원되었다.

1. 접시의 준비는 콜라겐으로 코팅 <ol><li> 10 μg / Opti-가상 미디어 ML의 최종 농도로 콜라겐을 희석. </li><li> 1 단계에서 각도에 1.5 ML를 추가하여 콜라겐과 코트 6 잘 접시. 4에서 하룻밤 품어 ° C. </li><li> 다음 날, 1X 인산 2 번 식염수 (PBS)를 버퍼 접시를 씻고 PBS에 그들을 저장합니다. </li></ol> 2. 6 - 잘 접시에 세포 준비 및 심는 참고 : 세포의 움직임을위한 최적의 조건을 보장하기 위해 따뜻한 매체와 PBS를 사용 <ol><li> 성장 MDA-MB-231 (침입 유방암 세포주) 띄엄띄엄 10% 태아 소 혈청 (FBS)와 Dulbecco의 수정일 독수리 중간 (DMEM) 인치 이 예제에서, 우리는 MDA-MB-231을 사용하지만,이 방법은 어떤 자기편 종양과 비 종양 세포 라인에 적용할 수 있습니다. </li><li> 따뜻한 1X PBS로 두 번 세포를 씻고 trypsinization에 의해 수집합니다. 통화를 만들기 위해 현미경으로 세포를 검사세포가 제대로 트립신 처리에 의해 분리되는 재. </li><li> 10% FBS으로 DMEM 배지를 추가하여 세포를 수집, 부드럽게 5 분 1,000그램에서 세포를 다운 스핀. 10% FBS으로 DMEM 배지에 부드럽게 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 부드럽게 아래 위로 pipetting하여 세포 펠렛 봐라. 그것은 가능한 한 각 세포에 세포 클러스터를 무너뜨리는 것이 중요합니다. </li><li> 세포를 카운트와 10 % FBS와 50,000 세포 / DMEM 미디어 ML의 최종 농도로 희석. 각도에이 ML을 분배. </li><li> 촬영된 현미경을 시작할 때까지 하룻밤 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 접시를 품어. </li><li> 마이 그 레이션을위한 충분한 공간을 확보하기 위해 피펫 팁을 사용하여 상처를 만들고, 파편 (상처의 결과로 형성) 제거와 10 % FBS으로 DMEM을 추가하는 1X PBS로 접시를 씻는다. 떠다니는 세포에 대한 현미경으로 확인합니다. 세포의 큰 숫자가 부동 경우 세척 절차를 반복합니다. 이제 음식에 설치가 될 준비가되어이미지 수집을위한 현미경. </li></ol> 3. 현미경의 설치 및 자동 이미지 인식 자동 이미지 수집을위한 현미경을 제어 여러 이미징 소프트웨어 패키지가 있습니다. 여기서는 Slidebook 5.0 이미징 소프트웨어를 사용하고 자동 인수는 인수와 최소한 phototoxicity 속도 답해야 라이브 셀 애플 리케이션에 뛰어난 EM-하마 마츠 C9100 카메라에 결합 올림푸스 현미경 (올림푸스 IX81)에서 수행됩니다. 시스템은 무대 최고 환경 제어 챔버 (Neue 라이브 셀) 및 자동 XY 스테이지 컨트롤러를 (사전 Proscan)가 포함되어 있습니다. 이미지가 정의된 시간 간격을 이용한 명시야 모드에서 10X UPLANFL Ph1/0.30 목표, 함께 찾았습니다. 다음 프로토콜은 이미지 수집에 대해 설명합니다. <ol><li> 현미경, 카메라, 그리고 라이브 세포 이미징 장치를 켭니다. 미세한 무대 위에 접시를 놓습니다. Neue 라이브 셀 envi에 의해 커버 플레이트CO 2 공급 및 온도 센서와 연결되어 ronmental 제어 챔버. 37 5 % ° C와 CO 2에서 온도 조절 장치를 설정합니다. </li><li> SlideBook 소프트웨어는 완전 자동화된 객관적인 선택, 파장 선택과 형광 및 명시야 기법간에 쉽게 전환이 가능합니다. 초점 제어의 여러 매개 변수를 설정하기 위해서는 오픈 SlideBook 소프트웨어&gt; 클릭하여 메뉴 모음&gt; 선택 초점 컨트롤로 이동&gt; <img alt="0 버튼 1을 그림" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn1.jpg" /> 그리고 다음 매개 변수를 선택 <ol><li> 에서 &#39;대상 상자에서 &quot;창 드롭 다운에서 선택하여 목표를 정의합니다. 우리는 위상 목적을 사용하고 수동으로 콘덴서에 적절한 위상 링을 선택합니다. 자동 콘덴서와 시스템을 사용하는 경우이 자동으로 소프트웨어 프로그램을 통해 설정됩니다. 도 객관적인 포탑이나 콘덴서를 자동화하는 경우 또는, 그것들은 사용 설명서를 각각 선택해야합니다그겁니다. </li><li> : &#39;필터 설정&#39;상자 <ol><li> 사용 가능한 필터 (Google 시스템에서 카메라에 대해 &quot;Widefield&quot;, 접안 렌즈에 대해 &quot;라이브&quot;)를 참조하기 위해 드롭 다운 상자에서 접안 렌즈 또는 카메라 중 하나에 빛이 경로를 지시하는 설정을 선택합니다. </li><li> brightfield 조명에 적합한 필터를 선택합니다 (우리의 함정에서이 옵션 brightfield 광 경로에 대해 열린 입장을 대표하는 &#39;DIC&#39;(으)로 분류합니다.) </li><li> 명시야 셔터를 엽니다 &quot;열기 밝은&quot;를 클릭하여 광원을 선택합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 눈 조각 아래에 샘플을 보려면 포탑에서 명시야 필터 (Google 시스템에서 찾을 위치 &quot;6&quot;)를 선택합니다. 초기에 적절한 필드를 찾아 초점 (단계 3.2.1로 3.2.2.3)로 샘플을 가져 접안 렌즈를 통해 샘플을보고 나서. 이미지 캡처 (위치에 Google 시스템에서 &quot;1&quot;)를 카메라에 빛의 경로를 변경하려면 필터 터렛을 이동합니다. </li><li> 자동화된 단계는 있습니다 다른 XY coordina의 선택이미지 수집 중 관심있는 여러 분야를 캡처하기 위해 오셨. SlideBook 소프트웨어에 초점 컨트롤로 이동 접안경하지만 다른 위치를 선택, &quot;XY&quot;를 선택 후 이미지 캡쳐 (그림 1) 각 지역에서 &#39;세트 포인트&#39;잠금을 클릭합니다. </li><li> 미세 조정 화면에 표시될 카메라 이미지의 초점. 이것은 어느 정도 미세한 단위로 초점을 조정할 수 현미경이나 컴퓨터 컨트롤에 수동 컨트롤을 사용하여 수행할 수 있습니다. </li><li> &quot;초점 컨트롤&quot;창에서 컨트롤을 사용하여 무대의 Z 위치를 조정합니다. 최상의 결과를 얻으려면 플레이트와 접촉 근처 평평한 세포 라고나 초점을 맞춥니다. </li><li> 초점에 대한 적절한 범위에 있어야 노출 시간을 조정 슬라이더를 사용하여 초점과 투입. 여러 XY 위치가 선택되었을 경우, 각 위치에 대해 초점을 조정 초점 조절&gt; XY&gt; 방문 지점에서. 참고 : 이것은 확실히 회를 만들기 위해 수행됩니다입력란에 정확하게 최적의 스냅샷을 위해 주력하고있다. </li><li> 캡쳐 창 매개 변수를 설정하는 소프트웨어를 사용합니다. SlideBook에서 선택하여 캡처를 여십시오 <img alt="0 버튼 2를 그림" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig0btn2.jpg" /> 메뉴 표시줄에서. 그림 2를 참조하십시오. 우리는 다음 매개 변수를 확인하십시오. <ol><li> 저속과 같은 형식&gt; 캡쳐 확인합니다. </li><li> 와이드 필드 : DIC (명시야 이미지) 필터 집합을 확인합니다. </li><li> &quot;시간 저속 캡처는&quot;(이것은 세포 종류에 따라 다를 수 있음) 캡처됩니다 시간 포인트의 번호입니다. 기간의 실험을위한 시간의 총 길이입니다. 시간의 단위 [밀리초 (MS), 초 (들), 분 (M) 또는 시간 (H)의이] 드롭 다운 메뉴에서 선택할 수 있습니다. </li><li> &quot;간격&quot;하나 timepoint의 시작과 다음 timepoint의 시작 사이의 지연이다. 여러분이 이러한 가치관의 두 입력으로 세 번째 필드는 자동으로 계산됩니다. </li><li> 다중 XY 캡처 : &quot;멀티를 선택하십시오1 이상 XY 위치에 대한 포인트 목록 &quot;. </li><li> 파일의 이름을 지정하십시오. 주어진 예제에서, 우리는 &#39;그것을 &#39;231라는했습니다. </li></ol></li><li> 때문에 여러 개의 이미지로 컴퓨터가 예기치 않게 종료되지 않도록하려면 파일을 저장하기 위해 &quot;스풀 옵션&quot;을 사용합니다. 그것은 선택 사항입니다, 그러나 그것은 매우 권장합니다. 이를 위해 캡처 아래 contro 나&gt; 선택 고급&gt; 스풀&gt; 메모리에 캡처하고 각 시간 지점 이후에 스풀 파일에 저장합니다. 슬라이드 도서 파일 (그림 3)을 저장할 위치를 찾습니다. 생성된 영화가 나중에 지정된 위치에서 가져올 수 있습니다. 현미경 설정의 단계에 요약되어 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/Figure_3.1_merged.pdf" target="_blank">파일 3.1</a> . </li></ol> 4. 마이 그 레이션의 이미지 처리 및 분석 : 속도와 배기량의 산출 이 예제에서는 이미지 처리가 SlideBo 이루어집니다확인 5, 6 5.0 소프트웨어. 영상 처리 및 분석을위한 같은 ImageJ 7 등 다양한 다른 프로그램이있다. <ol><li> 다양한 시간 지점에서 다양한 분야의 이미지에서 생성된 SlideBook 파일을 가져옵니다. 메뉴 표시줄로 이동&gt; 이미지 아래에&gt; 가져오기&gt; 슬라이드 도서 스풀&gt; 원하는 파일 (그림 4A)를 선택합니다. </li><li> 여기에서 우리의 목표는 개별 세포의 움직임을 추적하는 것입니다. 그것은 자동 추적이나 개별 추적을 사용하여 수행할 수 있습니다. 예제에서 우리는 수동 추적을 사용한,이 용이 이후는 자동 추적과 어느것이 더 어려 운지 쉽게 유물을 배제할. </li><li> 우리가 추적을 수행하기 위해 보유하고있는 SlideBook 파일을 엽니다. 메뉴 아래에 : 선택 마스크&gt; 입자 추적 프로토콜&gt; 매뉴얼 입자 추적 프로토콜 (그림 4B). 창이 시작과 끝 시간 점 (그림 4c)와 함께 나타납니다. </li><li> Begi각 세포 (핵)의 중앙을 클릭하여 개별 세포의 움직임을 추적할 수 그렇죠. 약 30 세포가 하나의 실험에서 분석할 수 있도록 각 영화의 약 10 세포 적어도 세 가지 다른 영화를 추적은 서로 다른 위치에서 선택해야합니다. 각 실험은 세 번 반복해야합니다. 불편 접근을 허용하려면 같은 전선에서 일부 세포 등 다양한 위치에서 셀을 선택, 중, 구석 등이 &quot;OK&quot;를 클릭 한 번 추적이 이루어집니다. </li><li> 랜덤 마이 그 레이션은 메뉴 아래 자료&gt; 선택 마스크&gt; 입자 추적&gt; 입자 추적 프로토콜을 분석 속도, 속도 또는 변위 등의 변화를 측정하여 분석할 수 있습니다. (그림 5A) : 아래 설명된대로 추적 매개 변수를 선택하십시오 : <ol><li> 로 추적 - 당신이 드롭 다운 목록에서 추적하고자하는 매개 변수를 선택합니다. 면적이 예제에서 우리가 사용한, 센터 (오브의 중심의 좌표ject). </li><li> &quot;추적 및 계속&quot;을 클릭하십시오. 추적이 완료되면,이 자동으로 다음 단계로 진행됩니다. </li></ol></li><li> 같은 변위와 평균 속도 (그림 5B 참조) 각 경로에 대한 원하는 통계를 선택하세요 : <ol><li> 평균 속도 - 총 거리가 그 거리를 여행하는 데 필요한 시간으로 나눈 여행. </li><li> 총 배기량 - 객체에 의해 여행 총 거리. </li><li> &quot;계산하고 계속&quot;당신이 다음 단계로 진행하고자하는 경우, 또는 단순히 당신이 다음 단계로가는없이 통계를보고자하는 경우에는 &quot;계산&quot;을 선택 클릭합니다. 파일은 텍스트 파일로 저장할 수있는 생성되며 나중에 Excel로 내보낼 수 있습니다. </li></ol></li><li> 자동 추적 프로토콜을 사용하여 객체를 추적하기 위해서는, 먼저 마스크가 생성되어야한다. <ol><li> &gt; 세그먼트 이미지&gt; 세그먼트 창이 나타납니다 마스크를 선택&gt; 임계값을 얻을 때까지 선택 등 그 9월다른 사람에서 한 물체를 arating 것은&gt; (그림 5c를 참조)&gt; 확인을 적용합니다. 단계 4.5.1은 동일합니다. </li><li> 이상의 객체가 작은 제거 - 선택적으로 지정된 크기보다 작은 물체가 제거하려면이 확인란을 선택합니다. 편집 필드의 크기를 입력하고 단위로 미크론 또는 픽셀 중 하나를 선택합니다. 이것은 자주 파편으로 인한 아티팩트를 제거하는 데 사용됩니다. </li><li> 최소 운동 - 경로를 확인하기 위해 추적해야 시간 포인트의 최소 숫자를 입력합니다. </li><li> 최대 운동 - 한 시점에서 특정 개체에서 다음을 기대하는 최대 운동을 입력하십시오. </li><li> 데이터를 분석하는 단계 (4.6.2 단계 4.5.2 참조) 수동 추적과 동일합니다. </li></ol></li></ol> 5. 대표 결과 무작위로 마이 그 레이션 분석의 예제는 속도와 변위 (그림 6)의 측면에서 계량. 파일 T를 수출 후O 엑셀은 데이터 상자와 수염의 음모를 꾸몄다 사용하고 있습니다. 테스트 및 제어 사이 총 변위와 평균 속도 비교 통계 분석은 맨 - 휘트니 테스트를 사용하여 수행됩니다. 테스트 샘플은 컨트롤에 비해 평균 속도 증가를 보여줍니다. 테스트 샘플은 컨트롤에 비해 총 변위의 증가를 보여줍니다. 제어 및 테스트의 영화 : 제어 MDA-MB-231 및 테스트 MDA-MB-231 세포는 하룻밤 사이에 콜라겐에 놓는되었다. 시간 경과 비디오 현미경은 올림푸스 현미경에 의해 수행 EM-하마 마츠 카메라에 결합되었다. 이미지가 무작위로 마이 그 레이션하는 동안 18시간 총 1 시간의 간격으로 촬영하고 있습니다. 영화 1, 제어 및 테스트 샘플에 대한 무작위로 마이 그 레이션의 영화 2를 참조하십시오. 현미경 설정 : <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig1.jpg" /> 그림 1. 이미지에 대해 여러 포인트 설정하기<html> 캡처. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig2.jpg" /> 그림 2. 캡쳐 제어를 묘사한 단계. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오</a> . <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig3.jpg" /> 그림 3. 어떻게 여러 개의 이미지를 저장합니다. &quot;dflinebreak&gt; 마이 그 레이션의 이미지 프로세싱 및 분석. <img alt="그림 4A" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4a.jpg" /> 그림 4A. 데이터 분석을 위해 이미지를 가져오는 단계. <img alt="그림 4B" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig4b.jpg" /> 그림 4B. 입자 추적 프로토콜을 사용하여 데이터를 분석하는 단계. <img alt = &quot;그림 4c&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/3585/3585fig4c.jpg&quot;/&gt; 그림 4c. 추적 입자의 창 묘사한 경로 길이. 데이터 분석의 단계. <img alt="그림 5A" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5a.jpg" /> 그림 5A. 입자 추적 프로토콜 매개 변수를 묘사하는 단계. <img alt="그림 5B" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5b.jpg" /> 그림 5B. 분석되는 경로 통계의 선택. <img alt="그림 5c" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig5c.jpg" /> 그림 5c 있습니다. 자동 추적 프로토콜에 대한 마스크를 생성하는 단계. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/3585/3585fig6.jpg" /> 그림 6. 평균 속도 (그림6A)와 변위 (그림 6B)는 수염의 음모를 꾸몄다됩니다. 제어하기 위해 비교로 테스트 샘플은 속도와 변위의 증가를 보여줍니다. 영화 영화 1. 제어 세포 마이 그 레이션이 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie1.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 영화 2. 테스트 세포 마이 그 레이션이 있습니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3585/3585movie2.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 제어 MDA-MB-231 및 테스트 MDA-MB-231 세포는 하룻밤을위한 콜라겐에 띄엄띄엄 놓는되었다. 시간 경과 비디오 현미경은 올림푸스 현미경에 의해 수행 EM-하마 마츠 카메라에 결합되었다. 이미지가 무작위로 마이 그 레이션하는 동안 18 시간 동안 일시간의 간격으로 촬영하고 있습니다. 제어 및 테스트를 위해 임의 이주의 동영상을 참조하시기 바랍니다.

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우리는 공개 할게 없다.

실시간으로 무작위로 마이 그 레이션 분석은 속도와 변위와 같은 세포 이주 매개 변수 중 정확하고 민감한, 분석을 가능하게합니다. 이 방법은 포인트 측정 값을 끝낼 국한되지 않고, 따라서 그것은 더 많은 양적입니다. 이후 세포는 혈청과 정상 DMEM 배지에서 모니터링되며 그것은 혈청 무료 미디어 이상 인큐베이션의 해로운 효과를 감소시킵니다. 이것은 세포 마이 그 레이션이 서식하기 때문에?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> 써모 과학 </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> 제미 나이 바이오 제품 </td><td> 100-106 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-가상 </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> 콜라겐 </td><td> BD </td><td> 354,231 </td><td></td></tr><tr><td> 라이브 셀 챔버 및 자동 XY 스테이지 컨트롤러와 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> 올림푸스 1X81 </td><td></td></tr><tr><td> 환경 제어 챔버 </td><td> Neue </td><td> Neue 라이브 셀 회의소 </td><td> 와우 챔버의 상단을 통해 적절한 광학 정의 지어진 사각형 유리 플레이트 상단 있습니다. 직사각형 모양의 experimen 많은에 사용되는 멀티 잘 번호판을 수용TS. </td></tr><tr><td> 자동 XY 스테이지 </td><td> 이전에 </td><td> 이전 Proscan </td><td> 이것은 정확한 반환 시간 저속 현미경 중에 선택한 XY 위치를 곱하면 수 있습니다. </td></tr><tr><td> 카메라 </td><td></td><td> 하마 마츠 EM 카메라 C9100 </td><td></td></tr><tr><td> 소프트웨어 </td><td> 일반적으로 이러한 올림푸스 현미경 같은 공급 업체를 통해 구입 </td><td> 슬라이드 도서 5 </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analysis of random migration of cells using time-lapse video microscopy

세포 이주는 배아 개발, 조직 복구, 면역 체계 기능, 그리고 종양 침공 1, 2를 위해 중요하다 역동적인 과정이다. 방향 마이 그 레이션하는 동안 세포는 세포외 chemotactic 신호에 대응하거나, 기본적인 운동성 기계에서 제공하는 본질적인 단서 3 응답으로 급속하게 이동합니다. 세포는 세포가 자신의 로컬 환경을 탐험 있도록 낮은 본질적인 방향성을 가지고하면 랜덤 마이 그 레이션이 발생합니다. 세포 이주는 초기 응답 세포에서 복잡한 과정이다 분극을 거쳐 및 마이 그 레이션 2의 방향으로 라고나을 확장합니다. 이러한 Boyden 챔버 마이 그 레이션 분석과 같은 마이 그 레이션을 측정하는 전통적인 방법은 끝점 결과로 마이 그 레이션을 측정하는 수 체외에서 chemotaxis를 측정하기위한 쉬운 방법입니다. 그러나,이 접근법은 역시 개별적인 마이 그 레이션 매개 변수의 측정을 허용하지 않으며 그것은 visua 수 있습니까세포가 마이 그 레이션하는 동안 겪습하는 형태학의 변경 lization. 저속 현미경 - 여기, 우리는 비디오를 사용하여 실시간으로 이주하는 세포를 관찰 할 수 있습니다 방법을 제시한다. 세포 이주와 침략이 암의 특징이기 때문에이 방법은 체외에서 암 세포 이주와 침략을 연구에 적용 될 것입니다. 혈소판의 무작위 마이 그 레이션은 혈소판 기능 4의 매개 변수 중 하나로서 간주되었으며, 따라서이 방법은 또한 혈소판 기능을 공부에 많은 도움이 될 수 있습니다. 이 분석은 신속하고 안정적​​인 재현성 적의를 가지고 있으며, 세포 숫자의 최적화가 필요하지 않습니다. 세포 생리학을위한 적합한 조건을 유지하기 위해서는 현미경이 CO 2 공급 및 온도 자동 온도 조절 장치를 갖추고 있습니다. 세포 운동은 정기적으로 현미경에 장착 카메라를 사용하여 사진을 찍고 의해 모니터링된다. 세포 이주는 측정 평균 속도로 계산할 수Slidebook 소프트웨어에 의해 계산됩니다 verage 변위.

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Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

시간 경과 비디오 현미경을 이용한 세포의 무작위 마이 그 레이션의 정량 분석

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

quantitative-analysis-random-migration-cells-using-time-lapse-video

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K 조회수.  LSU School of Medicine. 이 방법은 실제 시간과 같은 속도, 변위와 속도 등 다양한 세포 이주 매개 변수의 양적 측정에 세포의 모니터링이 가능합니다. 전통적인 방법과는 달리,이 실시간 접근법 끝점 양적 마이 그 레이션 측정에 기초하지 않고 대신 그것은 모니터링하고 지속적으로 서로 다른 매개 변수를 계산할 수 있습니다.

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Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Okay, so what I'd like to do today is to show you how to construct a flow chamber, a fusion chamber for imaging on an upright microscope. What then I then do is I create two spaces using film. So what I do is I take the para film, I cut it into small strips.Next I'm going to, this will basically form the channels for the, the walls, and I dry them with a tilted air. I put the cover slip on top of the para, And here's the finished. Then I heat it on a heat block to melt the param and basically create a seal.So what this is, is the, the cover glass here, and then on top of the cover glass is two layers of phim as you see right here. And then on top of this, again, there's a, it's a 22 by two two mil meter cover slip. This one right here, which I pressed against the param to fall the seal.Okay, so the liquid goes in in one direction here and I can suck it out with a filter paper here in this direction. And I'll show you how to do that in a bit. So what I like to do is I like to put it in a humidified chamber, which is very simple.Take two kind of elevated strips and have a filter of paper underneath. And to keep it noisy as I, I put the cover, cover slip on the flow chamber on. Now the way you introduce a solution to the chamber is that you just put the pipet tip at the entrance of the chamber and you just split.Now what I do is I incubate the chamber with the lid closed for 10 minutes. What I usually do to suck the liquid out from the other side is to use it, get a filter paper and cut it into thin strips like this. And I take one of these thin strips and I simultaneously apply the solution into the entrance while putting the filter paper at the exit to suck the exchange, the solution.So you'll see the liquid flowing through the solution. And then I wait for five minutes for the mid close. Now what I'm ready to do is to actually put that the actin it and the actin, I actually have to polymerize, I polymerize inside the flow chamber and it's just the same procedures before.So because like this, and then now that the action is polymerized, I wash out all the un excess un polymerized action using a large volume of just buffer. So here I have about a hundred microliters and it's a few reaction chamber volumes worth of buffer. Just, you know, when the filter paper becomes saturated, I have to change the direction.Okay?And so I'm ready to do imaging with this. So perfusion chamber with actin attached to it. Now I take the slide, mount it under the microscope, and since I'm imaging with an oil objective, I'm gonna put some immersion oil on the top surface of the cover, grass touch, such so assess solution or protein or anything on acting inside.So what I do is I can actually exchange the solution side while I'm doing the time lapse imaging. As such.

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

연구

생물학

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

분열 효모의 양적 라이브 세포 형광 - 현미경 분석

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages as well as by the availability of genetic mutants and transgenic strains expressing a myriad of fusion proteins1-4. In addition, dynamic processes such as cell division can be viewed using fluorescently labeled reporter proteins. The study of mitosis can be facilitated through the use of time-lapse experiments in various systems including intact organisms; thus the early C. elegans embryo is well suited for this study. Presented here is a technique by which in vivo imaging of sub-cellular structures in response to anoxic (99.999% N2; &lt;2 ppm O2) stress is possible using a simple gas flow through setup on a high-powered microscope. A microincubation chamber is used in conjunction with nitrogen gas flow through and a spinning disc confocal microscope to create a controlled environment in which animals can be imaged in vivo. Using GFP-tagged gamma tubulin and histone, the dynamics and arrest of cell division can be monitored before, during and after exposure to an oxygen-deprived environment. The results of this technique are high resolution, detailed videos and images of cellular structures within blastomeres of embryos exposed to oxygen deprivation.

Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos

Described here is an in vivo technique to image sub-cellular structures in animals exposed to anoxia using a gas flow through microincubation chamber in conjunction with a spinning disc confocal microscope. This method is straightforward and flexible enough to suit a variety of experimental parameters and model systems.

에 산소 결핍 유도 일시 중지 된 애니메이션을 시각화하기 위해 시간 경과에 현미경을 사용<em&gt; C. elegans</em&gt; 태아

Caenorhabdits elegans has been used extensively in the study of stress resistance, which is facilitated by the transparency of the adult and embryo stages ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

고급 3D 형광 현미경을 사용하여 자식 작용의 정량 분석

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

sox10의 두개 안면 개발의 시각화 : 단풍 나무 형질 전환 제브라 피쉬의 선은 시간 경과 공 초점 현미경을 사용하여

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Time-Lapse Video Microscopy for Assessment of EYFP-Parkin Aggregation as a Marker for Cellular Mitophagy

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time points. Time intervals can be set through a computer interface that controls the microscope-integrated camera. This kind of microscopy requires both the ability to acquire very rapid events and the signal generated by the observed cellular structure during these events. After the images have been collected, a movie of the entire experiment is assembled to show the dynamic of the molecular events of interest. Time-lapse video microscopy has a broad range of applications in the biomedical research field and is a powerful and unique tool for following the dynamics of the cellular events in real time. Through this technique, we can assess cellular events such as migration, division, signal transduction, growth, and death. Moreover, using fluorescent molecular probes we are able to mark specific molecules, such as DNA, RNA or proteins and follow them through their molecular pathways and functions. Time-lapse video microscopy has multiple advantages, the major one being the ability to collect data at the single-cell level, that make it a unique technology for investigation in the field of cell biology. However, time-lapse video microscopy has limitations that can interfere with the acquisition of high quality images. Images can be compromised by both external factors; temperature fluctuations, vibrations, humidity and internal factors; pH, cell motility. Herein, we describe a protocol for the dynamic acquisition of a specific protein, Parkin, fused with the enhanced yellow fluorescent protein (EYFP) in order to track the selective removal of damaged mitochondria, using a time-lapse video microscopy approach.

Herein, we describe in detail a time-lapse video microscopy approach to measuring the temporal recruitment of EYFP-Parkin during the selective removal of damaged mitochondria. This dynamic process of EYFP-Parkin-dependent removal of damaged mitochondria can be used as an indicator of cellular health under different experimental conditions.

휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

Time-lapse video microscopy can be defined as the real time imaging of living cells. This technique relies on the collection of images at different time ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

동적에 대 한 렌즈 무료 비디오 현미경 및 부착 세포 배양의 정량 분석

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

시간 경과 구조화 조명 현미경 검사법에 대한 미토콘드리아 핵의 특정 라벨링

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...