Este método permite manipular y cuantificar cómo se organizan colectivamente las celdas. Esto es importante porque podemos modelar el patrón in vitro y desenredar las señales estrechamente acopladas in vivo. La técnica requiere un equipo especializado mínimo, lo que permite que se establezca en un laboratorio de biología estándar, y es cuantitativa, haciendo posible el descubrimiento de eventos de patrones subeclamos.
Este método se puede aplicar fácilmente a cualquier sistema celular donde podría surgir el patrón y descubrir patrones no aleatorios de diferenciación, proliferación y competencia de célula a célula. El principal con este método es la optimización sistemática de los parámetros de micropatrnización para nuevos tipos de células. Por ejemplo, tamaño y forma del patrón, tipo de matriz y tiempo de adhesión de celda.
Usando guantes, coloque un pedazo de película de laboratorio en la parte inferior de un plato Petri de 10 centímetros cuadrados. Usa un punzón de 12 milímetros para cortar portaobjetos de plástico hidrófobo para crear resbalones de cubierta de 12 milímetros alrededor, y coloca los resbalones de la cubierta en una nueva placa Petri. Utilice pinzas para retirar cuidadosamente la película protectora de los resbalones de la cubierta.
Coloque la máscara de fotos sobre una superficie limpia y estable, cromado hacia arriba, y agregue una gota de dos microlitros de agua de doble destilación en la posición del diseño de viruta deseado. Presione suavemente un resbalón de cubierta en la gota y coloque el soporte en la parte superior de los portaobjetos de plástico. Fije cuidadosamente este sándwich con abrazaderas para mantener las piezas de plástico en contacto con la máscara de fotos.
Coloque el conjunto en una lámpara de ozono ultravioleta aproximadamente a dos centímetros de la fuente de luz para una iluminación de 10 minutos. Al final del período de iluminación, agarre el sándwich con la máscara de fotos en la parte inferior y retire cuidadosamente las abrazaderas mientras mantiene la presión con una mano para evitar que las diapositivas se muevan mientras desmonta el sándwich. Una vez que se hayan quitado todas las abrazaderas, retire el soporte, teniendo cuidado de que todas las piezas de plástico todavía estén en la máscara y no pegadas al soporte, y agregue agua de doble destilación a las virutas para separar suavemente las virutas de la máscara de la foto.
Coloque los chips foto-patrones dentro de la cámara de deposición de matriz, el lado iluminado hacia arriba, y agregue 200 microlitros de solución de recubrimiento en cada chip. Luego, agrega un plato de Petri de tres centímetros lleno de agua de doble destilado a la cámara para limitar la evaporación a cuatro grados centígrados durante la noche. Para la siembra de células embrionarias sobre las virutas, lave los chips con dos lavados de al menos cinco minutos en PBS fresco y estéril por lavado, antes de dispensar unas diez a las quintas células en 200 microlitros del medio de cultivo celular apropiado en cada chip.
A continuación, cierre la cámara de siembra. Incubar durante una hora para permitir que las células se adhieran a las virutas. Cuando las células se hayan unido, llene los pozos de una placa multipocillos con 500 microlitros de medio caliente por pozo, y use pinzas estériles para transferir las virutas a pozos de placas individuales.
Agitar la placa vigorosamente para separar las células no adherentes, y reemplazar inmediatamente el sobrenadante con un medio fresco y cálido. A continuación, compruebe bajo el microscopio si el patrón es visible. 48 horas después de su enchapado, las células deben formar colonias densas que sigan rigurosamente la forma de los patrones.
Dejando las virutas en la placa, retire todo el medio, pero lo suficientemente medio para evitar que las virutas se sequen, y agregue al menos 500 microlitros de paraformaldehído o solución de fijación basada en PFA por pozo. Después de diez minutos, lave brevemente los pozos tres veces con la solución de lavado, seguido de un lavado con cloruro de amonio de 50 mililitrolar diluido en la solución de lavado para apagar la actividad de reticulación residual de la PFA. Después del último lavado, tratar las muestras con solución de bloqueo durante al menos 30 minutos.
Para la inmunomanchación de los cultivos de virutas, transfiera las virutas a un lado de la célula de la cámara de tinción hacia arriba, y agregue inmediatamente 100 microlitros de la solución de anticuerpos primaria de interés para cada chip. Después de una hora en una plataforma giratoria a temperatura ambiente, lave las virutas tres veces con la solución de lavado como se ha demostrado, e incubar las virutas con los anticuerpos secundarios apropiados durante una hora en la plataforma giratoria. Al final de la incubación secundaria de anticuerpos, lave las virutas tres veces en la solución de lavado y monte el chip en un portaobjetos de microscopía con 20 microlitros de cualquier medio de montaje estándar.
Para obtener una imagen de los chips, primero ajuste la velocidad de escaneado, la resolución de la imagen, el promedio de fotogramas y las ganancias del detector para identificar un óptimo entre la calidad de la imagen y el tiempo de imagen. A continuación, adquiera imágenes de cada chip. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, instale y ejecute PickCells siguiendo la documentación disponible en línea, cree un nuevo experimento e importe las imágenes en el programa.
Utilice el módulo Nessys para segmentar los núcleos en función de la señal de envolvente nuclear. Utilice el módulo de segmentación básico para identificar la señal de autofluorescencia del patrón. A continuación, haga clic en Finalizar y espere a que se procesen todas las imágenes.
Para crear objetos de núcleo y calcular operaciones básicas de objetos, inicie el módulo Características intrínsecas desde la barra de tareas y cierre los paneles Fitter y Extractor de superficies para mantener solo abierto el panel Características básicas. Seleccione núcleo"como Tipo de objeto y seleccione el prefijo proporcionado indicado para las imágenes segmentadas. A continuación, haga clic en Calcular y espere a que se procesen todas las imágenes.
En esta etapa, las características adicionales deben escribirse en núcleos antes de exportar los datos para nuestro análisis. Por ejemplo, para almacenar el nombre de la imagen a la que pertenece cada núcleo como atributo de núcleo, haga clic en Datos"y Nuevo atributo"y seleccione núcleo"en el diálogo emergente. Haga clic en Aceptar"seleccione Recopilar datos de otros objetos conectados al nodo"y haga clic en Siguiente"En el panel izquierdo, seleccione Imagen"y haga doble clic en la marca de interrogación para establecer el nodo de imagen como destino de la ruta.
Expanda el panel Operación de reducción y seleccione Obtener uno"Expandir el panel Atributo disponible y seleccione el atributo Nombre. A continuación, haga clic en Cambiar"y Siguiente"Introducir nombre de imagen, presione la tecla Tabulador y haga clic en Finalizar"Luego exporte los datos a un archivo de valores separados por tabulaciones. Para nuestro análisis, haga un bucle de los datos exportados a la carpeta de datos de la carpeta R-Script.
Abra Our Studio"y abra la plantilla de mapa binned R-Script"A continuación, establezca el directorio de trabajo en la ubicación del archivo de origen y ejecute el script para generar mapas de densidad. A la hora de la siembra celular, es posible que los pattens de cultivo celular individuales no sean completamente confluentes, ya que las células proliferan con el tiempo. Sin embargo, los patrones se colonizarán completamente con muy pocas células fuera de las superficies adhesivas.
El patrón que no se aclara hasta dos horas después de la siembra indica un error del procedimiento. El confinamiento espacial de células madre embrionarias de ratón en discos grandes o micropatrón de anillo guía el patrón de una subpoblación de células que expresan el marcador de braquiuría mesodérmica. Por ejemplo, cuando las células madre embrionarias de ratón se cultivan en micropatrón de disco grande, las células positivas de braquiury se restringen preferentemente a la periferia del patrón donde la densidad celular local es la más baja.
Este patrón es confirmado por el mapa de la intensidad cerebro-braquiuría. Estos datos demuestran que el método puede revelar información subsidente ya que la inspección de una colonia no es suficiente para identificar cualquier forma de organización espacial en la expresión de marcador de interés. Esto se explica notablemente por la importante variabilidad de colonia a colonia.
La técnica también demuestra que no existe un patrón detectable para el inhibidor de la unión al ADN que pueda indicar que el patrón T no es impulsado por la señalización de proteínas morfogenéticas óseas en este contexto. Recuerde siempre qué lado del resbalón de la cubierta ha eliminado y recubierto y también asegúrese de que las células se han adherido correctamente antes de lavar el exceso de células. Este método permite el estudio de las señales ambientales importantes para guiar la auto-organización de las células y también puede informar a los modelos matemáticos que nos ayudan mejor bajo el patrón rudimental.
