Los autores agradecen la financiación del Consejo Australiano de Investigación y Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia y también agradecer a la Nacional Australiana para la instalación de fabricación de SU-8 maestro para la impresión por microcontacto. SHN con el apoyo del Ministerio de Educación Superior y la Universidad Sains Malasia Malasia.

1. Pasivación de Cubreobjetos de vidrio con PLL-PEG-biotina Este paso está diseñado para neutralizar la superficie para que las células se adhieran y migrar hacia regiones específicas sobre el cubreobjetos de vidrio que se crean con la impresión microcontract (Paso 2-3a) o litografía de inmersión pluma (Step 3b). Para la pasivación, un co-polímero de poli-L-lisina (PLL) y polietilenglicol (PEG) se usa en la que 20% de las moléculas de PEG se injertan a biotina (PLL-PEG-biotina). <ol><li> Para limpiar cubreobjetos de vidrio (18 mm x 18 mm), sumergir en un bastidor en el 100% de etanol y coloque el estante en un baño de tratamiento con ultrasonidos durante 30 min. Secar los cubreobjetos de vidrio en el aire o bajo una corriente de nitrógeno. </li><li> A continuación, sonicar los cubreobjetos de vidrio durante 30 minutos en 1 M NaOH. Luego enjuagar las superficies de vidrio por inmersión con cuidado la rejilla en una cubeta llena con 1,5 L Milli-Q H 2 O. Repita el proceso de lavado tres veces con dulce Milli-Q H 2 O cada vez. Secar los cubreobjetos de vidrio enun horno a 60 ° C. </li><li> Colocar la mitad del cubreobjetos de vidrio limpio individualmente en una cámara húmeda, que está hecho de una placa de 24-así parcialmente lleno con H 2 O. Desechar 15 l de PLL-PEG-biotina (1 mg / ml) en PBS en cada cubreobjetos de vidrio. Tomar la otra mitad de los cubreobjetos de vidrio limpio y cuidadosamente restantes sándwich la solución de PEG. Agregar los cubreobjetos durante 1 h en la cámara húmeda. Deslice suavemente el cubreobjetos intercaladas de distancia el uno del otro sin raspar la superficie con recubrimiento de PEG y enjuagarlos con Milli-Q H 2 O. El agua debe deslizarse fácilmente en el lado de PEG-tratada. Si es necesario, secado al aire los cubreobjetos de vidrio en una toalla de papel con la superficie tratada hacia arriba. La tienda de los cubreobjetos de vidrio en un desecador de vacío hasta su uso posterior. </li></ol> 2. La fabricación de sellos para la impresión por microcontacto Se describen dos procesos a las pistas estreptavidina patrón sobre el cubreobjetos de vidrio pasivado. La primera de ellas, microcontact impresión, normalmente requiere la fabricación de un maestro de silicio a partir de la cual se moldea un sello de PDMS. En nuestro caso, el patrón en el sello de PDMS son 100 micras de ancho líneas que están espaciados 290 m de centro a centro con una altura característica de 25 micras. A continuación, se describe brevemente cómo fabricar un maestro de silicio adecuado (Paso 2.1-2.3) y el sello de PDMS (Paso 2.4). Sin embargo, existen varios protocolos para la impresión por microcontacto descritos en la literatura 19-23, que son adecuadas para la impresión de los patrones de proteínas en cubreobjetos de vidrio. Masters también se pueden hacer de ratón y adquiridos de fuentes comerciales. <ol><li> En primer lugar, limpiar la oblea de silicio (4 &quot;de diámetro) mediante la incubación en una solución Piranha (3:1 v: v de ácido sulfúrico y 30% de peróxido de hidrógeno). Durante 20 min Enjuague a fondo la oblea 10 veces con MilliQ H 2 O. Secar la oblea en un horno a 150 ° CO / N. </li><li> Enjuague la oblea de silicio limpia y se seca con 100% de acetona, seguido de 100% de alcohol isopropílico. Próximospin-capa 2 ml de GM1070 SU-8 fotorresistente (Gersteltec Sarl) sobre la oblea a 3.100 rpm durante 40 segundos para crear una capa de 25 micras de espesor. La muestra luego se cuecen al horno en una placa caliente a 65 ° C durante 5 min seguido de otros 5 min a 95 ° C. </li><li> Exponer el SU-8 fotosensible a la luz UV durante 60 segundos bajo una fotomáscara con el patrón deseado (por ejemplo, utilizando una máscara de alineador Quintel Q6000) y repita el proceso de cocción describen en 2.2. Después, la muestra se desarrolla mediante la inmersión de la oblea en SU-8 programador (Gersteltec Sarl) durante 4 min, se lavaron en 100% de alcohol isopropílico y se secó bajo un flujo de nitrógeno. El área de la SU-8 fotorresistente que no se expuso a luz UV queda así eliminado, creando el patrón inverso del sello PDMS. </li><li> El siguiente paso consiste en emitir un sello PDMS desde el maestro de silicio. En primer lugar, mezclar cuidadosamente 1 parte (w / w) del agente de curado con 10 partes de prepolímero elastómero (Sylgard 184). Para eliminar las burbujas de aire, desgasificar la mezcla en un desecador conectado a una línea de vacíodurante 1 h. A continuación, verter el elastómero PDMS en el patrón de silicio en el interior de una caja de Petri a aproximadamente 1 cm de altura y curar la mezcla maestra y PDMS en un horno a 70 ° C durante 1 hr. Por último, el sello de PDMS se retira desde el maestro de silicio y cortar a medida. </li></ol> 3. Patrones estreptavidina o Cues adhesivas en cubreobjetos de vidrio pasivado Después de pasivación cubreobjetos de vidrio, los patrones de proteínas se imprimen con impresión por microcontacto (Paso 3a) o dip-pen litografía (Step 3b). En nuestro caso, la estreptavidina se imprimen como líneas, que forman la base de los gradientes de RGD (Paso 4). El mismo procedimiento también se puede utilizar para la impresión de proteínas de la matriz para crear patrones adhesivos. Un método alternativo para la impresión por microcontacto para el modelado de biomoléculas en las superficies de inmersión es la litografía pluma. En la litografía de inmersión pluma, un voladizo se utiliza para transferir un pequeño volumen de solución en la superficie. El tamaño de los voladizos, viscosity de la solución, tiempo de contacto de la viga en voladizo sobre la superficie, hidrofobicidad de la superficie y de la humedad en la cámara de impresión determinar el tamaño de los elementos impresos. La ventaja de este método es que los diferentes patrones pueden imprimirse para cada experimento, ya que no hay necesidad de fabricar maestros y sellos. La desventaja es que se necesita más tiempo para imprimir un patrón dado y que dip litografía pluma requiere un instrumento especializado que puede no estar disponible en muchos laboratorios. La plumilla litografía instrumento que se utilizó fue el de NanoeNabler Bioforce Nanociencia. En este sentido, impreso pequeños puntos que eran &lt;10 micras de diámetro, para lo cual utilizamos SPT10 voladizos. 3a. La impresión por microcontacto (μCP) Técnica <ol><li> Para limpiar y hacer el sello PDMS más hidrófilo, tratar el lado estampado de los sellos de PDMS en un UV y ozono (por ejemplo, Procleaner ozono UV de Bioforce Nanociencia) durante 1,5 h. También puede utilizar un plasmalimpiador para un tiempo más corto para el mismo propósito. Este proceso crea un oxidó PDMS superficie 24, lo que mejora el proceso de impresión. </li><li> Inmediatamente después del tratamiento con ozono o plasma, el lugar y se extendió 10 l de estreptavidina (1 mg / ml en PBS) en los sellos de PDMS y dejar durante 1 hora en una cámara húmeda (como un parcialmente lleno 6-así placa, ver paso 1,3) . Si las pistas deben ser visibles bajo el microscopio de fluorescencia, que es usar estreptavidina conjugada con un fluoróforo tal como estreptavidina-AlexaFluor350. </li><li> Eliminar el exceso de estreptavidina con el sello de papel de seda y secar al aire el sello durante aproximadamente 1 min. Presione ligeramente el sello sobre el cubreobjetos de cristal PLL-PEG-biotina-revestido. </li><li> Si fluorescente estreptavidina se utilizó en 3.A2 Paso, examinar el patrón de uso bajo un microscopio de epifluorescencia. La tienda de superficies impresas en un desecador. </li></ol> 3b. Dip Litografía Pen <ol><li> Primero, mezclar 1 parte de 1 mg / ml de estreptavidina o streptavidin-AlexaFluor350 con 10 partes de glicerol (v / v) y cargar 5 l de la mezcla sobre la viga en voladizo. Entonces comienza el proceso de impresión como se describe en el manual de funcionamiento del instrumento de inmersión litografía pluma. Para reducir el tamaño del punto a aproximadamente 5 micras, ajustar la velocidad de impresión, el tiempo de contacto de la viga en voladizo sobre la distancia de la superficie o vertical de la viga en voladizo a la superficie. En el ejemplo mostrado en la Figura 2c, los puntos se imprimen en una línea con la fila y la columna de separación ajustado a 10-15 micras. Esta distancia es suficiente para evitar puntos de fusión entre sí, sino que permite la visualización de múltiples puntos en un único campo de visión con la configuración de la mayoría de microscopio. </li><li> La tienda de superficies impresas en un desecador. </li></ol> 4. Crear gradientes de adhesivo sobre las superficies de patrón de estreptavidina Hemos crear gradientes de adhesivo de biotina-RGD en cubreobjetos de vidrio que están recubiertas con estreptavidina (Figura 3) o contain estreptavidina patrones en cubreobjetos de vidrio pasivadas (Figura 5). Para crear un gradiente de la superficie, se utilizó un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente (llamado pegajoso-Slide 3D ​​quimiotactismo de ibidi) que crea un gradiente de solución estable por difusión pasiva. Para competir por los sitios de unión de estreptavidina, se emplearon dos gradientes opuestos de biotina-RGD y la biotina que no se conjugó con RGD (ver Figura 1). <ol><li> Respete los cubreobjetos con dibujos o recubiertas de estreptavidina vidrio sobre la parte adhesiva del dispositivo pegajoso-Slide quimiotaxis 3D. Para asegurarse de que no hay fugas durante varias horas, los bordes del dispositivo están sellados con una capa fina de vaselina y se calentó con una segunda capa de una mezcla de 1 parte de vaselina a 1 parte de cera de parafina (w / w). </li><li> Rellene el canal del dispositivo con 6 l de PBS en el canal. A continuación, llenar los dos depósitos de 70 l de 0,03 mg / l de biotina-4-fluoresceína en PBS y 70 &amp; mu; l de 0,03 mg / l de biotina-RGD en PBS, respectivamente. Se incuban las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hr. </li><li> Eliminar la biotina y soluciones de enjuague cuidadosamente la superficie mientras todavía están unidos al dispositivo de microfluidos dos veces con PBS. Marcar la dirección del gradiente de adhesivo y, si es necesario, almacenar el dispositivo lleno de PBS a 4 ° C durante pero asegurar que el dispositivo no se seque. Si es necesario, analizar gradiente de adhesivo con un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 5. El etiquetado de las células con fluoróforos de imágenes de células vivas Las células se marcan con tintes fluorescentes que ayudan rastreo celular bajo el microscopio fluorescente. Sondas fluorescentes comunes son marcadores de orgánulos, tales Syto 64 rojas, que etiqueta el núcleo de la célula. Para ello, las células se lavaron primero tres veces con PBS, después se incubaron con 1 mM Syto 64 Red en medios de cultivo durante 45 min y finalmente se lava otras tres veces con PBS. Tenga en cuenta que las células no debería sermantenido en PBS durante largos períodos de tiempo. Tintes alternativos para rastreo celular son serie CellTracker que tiñen el citoplasma y se conservan durante la migración celular y la división. La transfección de células con proteína de fusión fluorescente es particularmente útil para registrar las distribuciones subcelulares de una proteína de interés durante la migración. Sin embargo, las proteínas fluorescentes típicamente foto-blanqueador más rápido que los tintes orgánicos para que las observaciones a largo plazo puede no ser posible. 6. Carga de células con un degradado soluble en el dispositivo de microfluidos <ol><li> Contar las células marcadas fluorescentemente y se dividió en dos tubos del número de células iguales. Lavar y volver a suspender las células de un tubo con medio que contenía el quimioatrayente, tales como el medio modificado de Dulbecco bajo en glucosa Eagle (DMEM) con suero fetal bovino al 10% (FBS). Lavar y resuspender el otro tubo de células en medios sin el quimioatrayente, es decir, DMEM con FBS al 0%. La concentración finalde células en cada tubo debe ser de 5 x 10 5 células / ml. </li><li> Quite todas las soluciones desde el dispositivo de microfluidos (del Paso 4.3) y colocarlo en la platina del microscopio (ver paso 7). Carga de 70 l de células (5 x 10 5 células / ml en DMEM FBS 0%) en uno de los depósitos y 70 l de células HeLa (5 x 10 5 células / ml en DMEM FBS 10%) en otro. Libremente colocar una cinta adhesiva sobre los depósitos para evitar la evaporación. Si las células en la superficie son pre-incubados antes de la formación de imágenes, es aconsejable que las células se cargan en el dispositivo en medios de crecimiento sin el gradiente. El dispositivo se coloca sobre la platina del microscopio y los medios de comunicación sustituido con gradiente de medios de comunicación, es decir DMEM sin ​​FBS en un depósito y DMEM con FBS al 10% en el otro. </li></ol> 7. Vivo de imágenes de células y análisis de datos <ol><li> Encender el microscopio (Nikon Ti-E) y calentar la fase de por lo menos 1 hora antes de comenzar el experimento. </li><li> Asegúrese de que el canal de la microfluidic dispositivo está en el campo de visión y las células están en foco. Seleccionar el parámetro de adquisición de imágenes, tales como tiempos de exposición y filtros fluorescentes, secuencia de imágenes de campo claro y fluorescencia, que captura las células y las pistas, así como los momentos de tiempo y duración de grabación (por ejemplo, cada 15 min durante 16 h). </li><li> Analizar los datos con los programas informáticos adecuados, como ImageJ Manual Tracking o ibidi quimiotaxis y migración. </li></ol>

<ol>
	<li>Pulsipher, A., Yousaf, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Chemistry+and+Cell+Biological+Tools+for+the+Analysis+of+Cell+Adhesion+and+Migration.">Surface Chemistry and Cell Biological Tools for the Analysis of Cell Adhesion and Migration.</a> Chem. BioChem. 11, 745-753 (2010).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 5-14 (2009).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion:+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension.">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li><li>Geiger, B., Spatz, J. P., Bershadsky, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+sensing+through+focal+adhesions.">Environmental sensing through focal adhesions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 21-33 (2009).</li><li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+cancer.">Chemotaxis in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 11, 573-587 (2011).</li><li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+versus+directionally+persistent+cell+migration.">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li><li>Geiger, B., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+and+function+of+matrix+adhesions.">Molecular architecture and function of matrix adhesions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3, (2011).</li><li>Ngalim, S. H., Magenau, A., Saux, G. L. e., Gooding, J. J., Gaus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+cells+make+decisions:+engineering+micro-+and+nanoenvironments+for+cell+migration.">How do cells make decisions: engineering micro- and nanoenvironments for cell migration.</a> Journal of Oncology. 2010, 363106 (2010).</li><li>Roy, D. C., Wilke-Mounts, S. J., Hocking, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+fibronectin+matrix+mimetic+as+a+functional+growth-+and+migration-promoting+adhesive+substrate.">Chimeric fibronectin matrix mimetic as a functional growth- and migration-promoting adhesive substrate.</a> Biomaterials. 32, 2077-2087 (2011).</li><li>Jin, T., Xu, X., Hereld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis,+chemokine+receptors+and+human+disease.">Chemotaxis, chemokine receptors and human disease.</a> Cytokine. 44, 1-8 (2008).</li><li>Xu, X., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+G-protein+Coupled+Receptor+(GPCR)-mediated+Signaling+Events+that+Control+Chemotaxis+of+Dictyostelium+Discoideum.">Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum.</a> J. Vis. Exp. (55), e3128 (2011).</li><li>Chung, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Gradient-generating+Microfluidic+Device+for+Cell+Biology.">A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (7), e271 (2007).</li><li>Rhoads, D. S., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+directional+cell+migration+on+defined+FN+gradients:+role+of+intracellular+signaling+molecules.">Analysis of directional cell migration on defined FN gradients: role of intracellular signaling molecules.</a> Exp. Cell Res. 313, 3859-3867 (2007).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+haptotactic+gradient+generation+within+a+triangular+microfluidic+channel.">Simple haptotactic gradient generation within a triangular microfluidic channel.</a> Lab on a Chip. 10, 2130-2138 (2010).</li><li>Li Jeon, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+chemotaxis+in+linear+and+complex+gradients+of+interleukin-8+formed+in+a+microfabricated+device.">Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device.</a> Nat. Biotech. 20, 826-830 (2002).</li><li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues.">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab on a Chip. 8, 227-237 (2008).</li><li>Pujic, Z., Mortimer, D., Feldner, J., Goodhill, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+for+eukaryotic+cell+chemotaxis.">Assays for eukaryotic cell chemotaxis.</a> Combinatorial Chemistry &amp; High Throughput Screening. 12, 580-588 (2009).</li><li>Thery, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesive+micropatterns+for+cells:+a+microcontact+printing+protocol.">Adhesive micropatterns for cells: a microcontact printing protocol.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2009, pdb prot5255 (2009).</li><li>Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing+of+Proteins+for+Cell+Biology.">Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology.</a> J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).</li><li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels.">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat. Protocols. 7, 1247-1259 (2012).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning.">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protocols. 5, 491-502 (2010).</li><li>Huang, Y., Agrawal, B., Sun, D., Kuo, J. S., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-based+devices:+New+tools+for+studying+cancer+and+cancer+stem+cell+migration.">Microfluidics-based devices: New tools for studying cancer and cancer stem cell migration.</a> Biomicrofluidics. 5, 13412 (2011).</li><li>Hillborg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosslinked+polydimethylsiloxane+exposed+to+oxygen+plasma+studied+by+neutron+reflectometry+and+other+surface+specific+techniques.">Crosslinked polydimethylsiloxane exposed to oxygen plasma studied by neutron reflectometry and other surface specific techniques.</a> Polymer. 41 (00), 6851-6863 (2000).</li><li>Liu, L., Ratner, B. D., Sage, E. H., Jiang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+Cell+Migration+on+Surface-Density+Gradients+of+Fibronectin,+VEGF,+or+Both+Proteins.">Endothelial Cell Migration on Surface-Density Gradients of Fibronectin, VEGF, or Both Proteins.</a> Langmuir. 23, 11168-11173 (2007).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+cell+migration:+a+multiscale+tuning+model.">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> The Journal of Cell Biology. 188, 11-19 (2010).</li><li>Moazzam, F., DeLano, F. A., Zweifach, B. W., Schmid-Sch&#246;nbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+leukocyte+response+to+fluid.">The leukocyte response to fluid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 5338-5343 (1997).</li><li>Walker, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+flow+and+diffusion+on+chemotaxis+studies+in+a+microfabricated+gradient+generator.">Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator.</a> Lab on a Chip. 5, 611-618 (2005).</li><li>Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+Printing:+Limitations+and+Achievements.">Microcontact Printing: Limitations and Achievements.</a> Adv. Mater. 21, 2257-2268 (2009).</li><li>Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+dip-pen+nanolithography.">Applications of dip-pen nanolithography.</a> Nat. Nano. 2, 145-155 (2007).</li><li>Wouters, D., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanolithography+and+nanochemistry:+probe-related+patterning+techniques+and+chemical+modification+for+nanometer-sized+devices.">Nanolithography and nanochemistry: probe-related patterning techniques and chemical modification for nanometer-sized devices.</a> Angewandte Chemie (International ed. in English). 43, 2480-2495 (2004).</li><li>Xia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directional+control+of+cell+motility+through+focal+adhesion+positioning+and+spatial+control+of+Rac+activation.">Directional control of cell motility through focal adhesion positioning and spatial control of Rac activation.</a> FASEB J. 22, 1649-1659 (2008).</li><li>Oakes, P. W., Beckham, Y., Stricker, J., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+is+required+but+not+sufficient+for+focal+adhesion+maturation+without+a+stress+fiber+template.">Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.</a> The Journal of Cell Biology. 196, 363-374 (2012).</li></ol>

No tenemos intereses comerciales a revelar.

En este protocolo, se utiliza un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente (pegajoso-Slide 3D ​​quimiotactismo de ibidi) para estudiar los efectos de las superficies modificadas químicamente y gradientes quimiotácticos sobre la migración celular. Esta configuración no requiere microfluídico de flujo porque el gradiente se establece por difusión a lo largo de la longitud del canal. Esto es importante porque el flujo podrían afectar diferencialmente a células que migran lentamente, tales...

La migración dirigida de células es una propiedad fundamental de muchas células y es un aspecto clave de muchos procesos fisiológicos normales, como el desarrollo embrionario, la defensa contra la infección y la cicatrización de heridas. Además, la migración celular también juega un papel importante en muchas enfermedades tales como enfermedad vascular, metástasis de células tumorales y 1,2 inflamación crónica. Mientras que los estados clásicos de la migración celular - polarización, de extensión saliente, formación de adhesión, la generación de la fuerza y la retracción posterior - 3,4 son generalmente aceptados, la elucidación de los mecanismos espaciotemporales por el cual coordina la señal de integración ha sido más difícil. La matriz extracelular (ECM) sirve como sustrato para la adhesión celular, y por medio de química inherente 5 y 6 diversidad física, proporciona indicaciones direccionales para células de navegación 7,8. Además de estas señales de adhesivo 9, factores solubles 10-12 &lt;/ Sup&gt; tales como quimiocinas y factores de crecimiento puede inducir la migración dirigida de células a través de receptores quimioatrayentes y su señalización aguas abajo motogénica. Actualmente, no se sabe si el compromiso y la señalización a través de receptores de adhesión (es decir, integrinas) o receptores quimioatrayentes, tales como receptores tirosina quinasa (RTK), son dominantes. Tampoco se sabe si las jerarquías de sistemas receptores son específicos del tipo celular. Microscopia de células vivas da una gran cantidad de información que no es accesible en ensayos a granel y se pueden combinar con dispositivos de microfluidos para generar gradientes inmovilizados señales de 13,14 y soluble 15 16. El método aquí descrito utiliza una serie de pasos simples y establecidos para la modificación superficial en conjunción con una cámara de microfluidos disponible comercialmente para crear un ensayo de formación de imágenes para la migración celular que se puede implementar fácilmente en un laboratorio de biología celular (Figura 1). El ensambladodispositivo microfluídico tiene cualidades ópticas que sean comparables al vidrio 17 y los gradientes de moléculas difusibles son estables durante al menos 16 h. El sistema puede ser utilizado para las técnicas de microscopía de epifluorescencia y avanzada. A diferencia de otras configuraciones de quimiotaxis de 18, este sistema es adecuado para la grabación lentamente migración, las células adherentes. Es importante destacar que el sistema es modular y permite fácilmente la introducción de adhesivo alternativa o señales solubles migración y el examen de diversos tipos de células.

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Coverglass staining outfits</td>
 <td>Thomas Scientific</td>
 <td>8542 E40</td>
 <td>Coverslip rack</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Oven</td>
 <td>Binder</td>
 <td></td>
 <td>ED 53 series</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicon wafer</td>
 <td>Silicon Quest</td>
 <td>708-007</td>
 <td>Boron doped &lt;100&gt; wafer, 4" diameter, 500 &mu;m, single side polished</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GM1070 SU-8 photoresist</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SU-8 developer</td>
 <td>Gersteltec Sarl</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 curing agent</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sylgard 184 elastomer prepolymer</td>
 <td>Dow Corning</td>
 <td></td>
 <td >&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PLL-PEG-biotin (20%)</td>
 <td>SuSos AG</td>
 <td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%)</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescein</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>46955</td>
 <td>1 mM in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Streptavidin-AlexaFluor350</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>S-11249</td>
 <td>1 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-4-fluorescein</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B-1370</td>
 <td>0.03 &mu;g/&mu;l in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-RGD</td>
 <td>GenScript</td>
 <td>SC1208</td>
 <td>0.03 mg/ml in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syto 64 Red</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td> S-11346 </td>
 <td>1 &mu;M in PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sticky slide chemotaxis 3D</td>
 <td>Ibidi</td>
 <td>80328</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l Greiner yellow bevelled tip</td>
 <td>Greiner Bio-One</td>
 <td>739261</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Vaseline</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>16415</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Paraffin wax, mp 55-57 &deg;C</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>327204</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nano eNabler 10 &mu;m cantilever </td>
 <td>BioForce</td>
 <td>SPT-S-C-10s</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Image J software</td>
 <td>National Institute of Health</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html" target="_blank">rsbweb.nih.gov/ij/download.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Manual Tracking plugin</td>
 <td>Fabrice Cordeli&egrave;res</td>
 <td></td>
 <td ><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chemotaxis and Migration Tool</td>
 <td>Ibidi GmbH</td>
 <td></td>
 <td><a href="http://www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html" target="_blank">www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html</a></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

creating adhesive and soluble gradients for imaging cell migration with fluorescence microscopy

Las células se pueden detectar y migrar hacia mayores concentraciones de señales adhesivas tales como las glicoproteínas de la matriz extracelular y señales solubles tales como factores de crecimiento. Aquí, describimos un método para crear gradientes opuestos de señales adhesivas y soluble en una cámara de microfluidos, que es compatible con imágenes de células vivas. Un copolímero de poli-L-lisina y polietilenglicol (PEG-PLL) se emplea para pasivar cubreobjetos de vidrio y evitar la adsorción no específica de biomoléculas y células. Siguiente impresión, por microcontacto o inmersión litografía pluma se utilizan para crear pistas de estreptavidina en las superficies pasivadas para servir como puntos de anclaje para el péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como la señal adhesivo. Un dispositivo microfluídico se coloca sobre la superficie modificada y utilizada para crear el gradiente de las señales de adhesivo (100% RGD a 0% RGD) en las pistas de estreptavidina. Por último, el dispositivo de microfluidos mismo se utiliza para crear un gradiente de un éxito quimioatrayenteh como suero bovino fetal (FBS), como la señal soluble en la dirección opuesta de la pendiente de las señales adhesivas.

Para entender cómo integrar las señales de células migratorias 25, hemos desarrollado un método para celdas de imagen con microscopía de fluorescencia que migrar en un entorno con gradientes compitiendo adhesivas y soluble (Figura 1). Pistas adhesivas que contenían estreptavidina fluorescente y RGD biotinilado se han creado con pistas impresas por microcontacto y dip litografía pluma (Figura 2). Impresión por microcontacto éxito es indicado por el perfil de la línea...

Watch this Scientific Journal Video about Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

creating-adhesive-soluble-gradients-for-imaging-cell-migration-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K vistas.  The University of New South Wales. Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Video: Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Microelectrode arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film polymer are expected to have extended functional lifetime because the flexible material may minimize adverse tissue response caused by micromotion. However, their flexibility prevents them from being accurately inserted into neural tissue. This article demonstrates a method to temporarily attach a flexible microelectrode probe to a rigid stiffener using biodissolvable polyethylene glycol (PEG) to facilitate precise, surgical insertion of the probe. A unique stiffener design allows for uniform distribution of the PEG adhesive along the length of the probe. Flip-chip bonding, a common tool used in microelectronics packaging, enables accurate and repeatable alignment and attachment of the probe to the stiffener. The probe and stiffener are surgically implanted together, then the PEG is allowed to dissolve so that the stiffener can be extracted leaving the probe in place. Finally, an in vitro test method is used to evaluate stiffener extraction in an agarose gel model of brain tissue. This approach to implantation has proven particularly advantageous for longer flexible probes (&gt;3 mm). It also provides a feasible method to implant dual-sided flexible probes. To date, the technique has been used to obtain various in vivo recording data from the rat cortex.

Insertion of flexible neural microelectrode probes is enabled by attaching probes to rigid stiffeners with polyethylene glycol (PEG). A unique assembly process ensures uniform and repeatable attachment. After insertion into tissue, the PEG dissolves and the stiffener is extracted. An in vitro test method evaluates the technique in agarose gel.

La inserción de sondas Flexible Neural Usando refuerzos rígidos adjuntos con Biodissolvable Adhesivo

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

Investigación

Bioingeniería

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescencia de extinción de un fluoróforo encapsulada en liposomas en infrarrojo cercano como herramienta para<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen Óptico

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and sensitivity in cells because the resolution of conventional light microscopy is diffraction-limited to ~250 nm. By combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM), PPIs can be visualized in cells with single molecule sensitivity and nanometer spatial resolution. BiFC is a commonly used technique for visualizing PPIs with fluorescence contrast, which involves splitting of a fluorescent protein into two non-fluorescent fragments. PALM is a recent superresolution microscopy technique for imaging biological samples at the nanometer and single molecule scales, which uses phototransformable fluorescent probes such as photoactivatable fluorescent proteins (PA-FPs). BiFC-PALM was demonstrated by splitting PAmCherry1, a PA-FP compatible with PALM, for its monomeric nature, good single molecule brightness, high contrast ratio, and utility for stoichiometry measurements. When split between amino acids 159 and 160, PAmCherry1 can be made into a BiFC probe that reconstitutes efficiently at 37 &#176;C with high specificity to PPIs and low non-specific reconstitution. Ras-Raf interaction is used as an example to show how BiFC-PALM helps to probe interactions at the nanometer scale and with single molecule resolution. Their diffusion can also be tracked in live cells using single molecule tracking (smt-) PALM. In this protocol, factors to consider when designing the fusion proteins for BiFC-PALM are discussed, sample preparation, image acquisition, and data analysis steps are explained, and a few exemplary results are showcased. Providing high spatial resolution, specificity, and sensitivity, BiFC-PALM is a useful tool for studying PPIs in intact biological samples.

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC-PALM

Protein-protein interactions are visualized in cells with nanometer spatial resolution by combining bimolecular fluorescence complementation (BiFC) with photoactivated localization microscopy (PALM). Described here is the use of BiFC-PALM for imaging Ras-Raf interactions in U2OS cells for visualizing the nanoscale clustering and diffusion of individual Ras-Raf complexes.

Fotoactivado Localización Microscopía con bimolecular fluorescencia Complementación (BiFC-PALM)

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

Polidimetilsiloxano-policarbonato celular dispositivos de microfluidos para Estudios de Inmigración en virtud perpendicular Química y gradientes de oxígeno

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Visualizar la formación de adherencias en las células por medio de avanzados Spinning microscopía de fluorescencia de reflexión interna Total de disco

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Microscopía de tracción integrada con microfluídicos para la migración colectiva quimiotáctica

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...