La meta total de este protocolo es describir los procedimientos implicados en la realización de aplastamiento irreproducible del nervio ciático, y proporcionar un protocolo para el gravamen del comportamiento del motor después de trauma periférico. La selección de una batería de prueba de comportamiento potente y confiable es esencial para cubrir una amplia gama de aspectos de comportamiento, y depende del modelo animal utilizado y la pregunta de investigación científica. Este protocolo describe detalladamente cómo realizar una lesión del aplastamiento del nervio ciático y proporciona una batería de la prueba del comportamiento para el gravamen de los déficits del motor en ratas, que incluya la prueba de campo abierto, el análisis del paso de la pasarela, la tarea que camina de la viga, y la tarea que camina del peldaños de la escalera.
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales aplicables para el cuidado y el uso de animales. Mantenga un ambiente estéril durante todo el procedimiento quirúrgico. Configure la mesa de cirugía con el equipo necesario.
Anestesiar profundamente a la rata en un gabinete cerrado con isoflurano y afeitarse una extensa área de la extremidad posterior derecha. A continuación, coloque la rata en la máscara de anestesia y continúe la anestesia profunda con isoflurano. Fije el torso y ambas extremidades traseras de la rata con cinta adhesiva.
Coloque ambas extremidades traseras en una posición simétrica y extendida y gire cada pata plana sobre la mesa de cirugía. Desinfecte la piel de la zona afeitada con un antiséptico adecuado. Busque la muesca ciática del íleon.
Haga una incisión en la piel desde la muesca ciática en la dirección de la pata con un bisturí. Si las extremidades posteriores están fijas y la incisión de la piel se realiza correctamente, se puede ver una cavidad en el plano fascial entre el músculo glúteo máximo y el músculo bíceps femoral que se asemeja a una línea blanca. Inserte las lórceps hemostáticas súper finas cerradas en la cavidad y extienda las fuerzas.
El plano fascial debe abrirse sin lesionar ningún tejido muscular. Coloque los retractores de banda elástica debajo de los músculos para mantener la incisión de la piel abierta. Retire suavemente cualquier tejido circundante y vasos sanguíneos del nervio ciático hasta que el nervio esté completamente expuesto.
Es importante no estirar o tirar del nervio durante todo el procedimiento. Aplaste el nervio ciático con una abrazadera no aserrada con presión utilizable constante y rápida. Para esto, abra la abrazadera, coloque el nervio en la mandíbula inferior de la abrazadera y cierre la abrazadera bloqueándola en la primera posición durante 3 x 10 segundos.
Después de la lesión por aplastamiento, vuelva a abrir la abrazadera con cuidado. el sitio del agobio del nervio ciático aparece translúcido. Retire los retractores de banda elástica.
Cierre la incisión del plano fascial con una sutura reabsorbible. Cierre la incisión de la piel con grapas en la piel del cuerpo. La actividad locomotriz, así como la actividad conductual de las ratas se pueden analizar mediante una prueba de campo abierto.
La configuración del campo abierto, que debe estar ubicado en un entorno oscuro y silencioso, consiste en el sistema de seguimiento de video automatizado, EthoVision XT, y una arena con una superficie negra limpiable y resistente a los arañazos. Coloque la arena y la cámara en la posición correcta y configure el software EthoVision XT. Coloque la rata suavemente en el centro de la arena de pruebas.
Durante la grabación, el experimentador debe mantenerse alejado del campo abierto configurado, con el fin de evitar distraer a la rata. Para el análisis de datos de la prueba de campo abierto, vaya a la sección de análisis en la barra lateral izquierda y elija Seguimiento de visualización"en la pestaña Resultados". A continuación, exporte los parámetros necesarios a XL.Within el software, elija una serie de variables de diferentes categorías para el análisis de datos.
Un análisis de la marcha por el sistema CatWalk XT puede ayudar a evaluar muchos parámetros diferentes relacionados con las huellas, la postura y la marcha de los modelos animales. Una pasarela de cristal se ilumina con luz verde y la luz dispersada por las huellas de los animales se captura con una cámara de vídeo de alta velocidad, que se encuentra debajo de la pasarela. Las señales se pueden analizar con el software CatWalk XT.
El experimento tiene que realizarse en condiciones oscuras. Comience configurando el sistema CatWalk XT. Elija la configuración experimental.
Coloque la cámara en su posición y ajuste el enfoque. Configure la configuración de detección. Configure las paredes del pasillo del sistema CatWalk y asegúrese de que las paredes permanezcan paralelas a la pasarela.
Defina la longitud de la pasarela y calibre la pasarela. A continuación, ajuste una imagen de fondo. Se necesita una pasarela limpia y vacía para la imagen de fondo.
La rata debe cruzar la pasarela sin ninguna interrupción. De acuerdo con los criterios de ejecución definidos, se necesitan tres corridas compatibles por rata para el análisis de datos. Entrene a los animales durante al menos ocho días antes de comenzar con el experimento real.
La Pasarela debe realizarse al menos una vez a la semana, con 6 a 10 corridas para garantizar un rendimiento continuo de la tarea. Para el análisis de datos, evalúe solo las ejecuciones compatibles. Clasifique las impresiones de patas automáticamente con el software CatWalk XT.
Revise las etiquetas de impresión de pata manualmente. Corrija las etiquetas de impresión de patas incorrectas, agregue etiquetas de impresiones de patas no detectadas y elimine cualquier ruido y etiquetas incorrectas. Los resultados numéricos se muestran en una hoja XL, que muestra una serie de parámetros básicos.
Para obtener información más detallada sobre cada huella, clasifique los dedos de las patas traseras. Este análisis requiere el módulo interactivo de mediciones de huellas. Establezca los marcadores para el análisis de huella manualmente.
Analice cada impresión de pata trasera en las tres corridas compatibles. Dibuje una línea desde el centro del primer dedo del día hasta el centro del quinto dedo del día para medir la dispersión del dedo deldo del día. Dibuje una línea desde el centro del segundo dedo deldo del piso hasta el centro del cuarto dedo del piso para medir la dispersión intermedia del dedo deldo deldo del artículo.
Dibuje una línea desde el centro del tercer dedo del pie hasta el talón de la pata trasera para medir la longitud de impresión manual. Revise los resultados numéricos de las mediciones interactivas de la huella que se muestran en una hoja separada. Los déficits de la marcha se pueden determinar por la tarea que camina de la viga.
El enfoque de la tarea de caminar por el haz en este tema de investigación específico será el análisis de la coordinación motora y no la evaluación del equilibrio motor. Para la tarea de caminar por el haz, se necesita un haz, espaciador, mesa, fondo uniforme y una videocámara. Utilice una viga de madera de 90 centímetros de largo, 1,7 centímetros de ancho y 2 centímetros de alto.
Entrena a los animales durante siete días. Coloque la rata en la plataforma de arranque de la viga. La rata debe cruzar la viga tres veces sin ninguna interrupción.
Incluso si la rata alcanza tres corridas compatibles dentro de las primeras tres corridas, se debe llevar a cabo un mínimo de 6 a 10 corridas para el rendimiento continuo de la tarea. Seleccione las secuencias de vídeo de tres corridas compatibles de la grabación. Defina el punto de hora de inicio y el punto de hora de finalización de las tres ejecuciones compatibles seleccionadas.
Aquí, el punto de tiempo de inicio está etiquetado por una línea negra en el haz, y la colocación de la primera extremidad posterior detrás de la línea negra se define como el punto de tiempo de inicio de la carrera. La colocación de la primera extremidad trasera en la plataforma al final de la viga define el punto de tiempo final. A continuación, calcule el tiempo necesario para que la rata cruce la viga.
Puntuar el número de pasos y errores de tres corridas compatibles para ambas extremidades traseras por separado, mediante el uso de la función de zoom y cámara lenta del software. Los errores incluyen resbalones totales de pies y resbalones de medio pie. Un deslizamiento total del pie se define como una colocación del pie que es seguida por un deslizamiento profundo, causando una pérdida de contacto de la pata afectada con la viga.
Un medio deslizamiento se define como la pata que se desliza fuera de la pared lateral de la viga sin perder el contacto completo. Calcular el porcentaje de deslizamientos de pie en relación con el número de pasos para cruzar la viga. La tarea de caminar peldaños de escalera puede evaluar la función motora, la colocación de las extremidades delanteras y traseras, y la coordinación entre las extremidades.
Se necesita un aparato de peldaños de escalera, espaciador, mesa, fondo uniforme y videocámara para esta prueba de comportamiento. El aparato de peldaños horizontales consiste en peldaños metálicos y paredes laterales de policarbonato transparente. Entrena a los animales durante ocho días.
Coloque la rata en la zona de inicio de los operadores de peldaños de escalera. La rata tiene que cruzar la pasarela de 100 centímetros del aparato de peldaños de escalera tres veces sin interrupción, para que pueda calificar como una carrera compatible. Seleccione las secuencias de vídeo de tres corridas compatibles de la grabación.
Defina el punto de hora de inicio y el punto de hora de finalización de las tres ejecuciones compatibles seleccionadas. La colocación de la extremidad trasera detrás de la primera línea negra en la pared lateral del aparato define el punto de tiempo de inicio de la carrera. La colocación de la primera extremidad frontal detrás de la segunda línea negra en la pared lateral del aparato define el punto de tiempo final de la carrera.
A continuación, calcule la duración de la carrera a través de la pasarela. Puntuar las tres corridas compatibles con la escala de 7 categorías de Mets y colegas mediante el uso de la cámara lenta o la función fotograma a fotograma del software. Determine el número de pasos y el número de errores de acuerdo con las categorías de la escala para cada miembro por separado.
La escala distingue entre las siguientes categorías. Falta total. Resbalón profundo.
Ligero resbalón. Replacement.Correction. Colocación parcial. Y correcta colocación.
A continuación, calcule los errores por paso. Los resultados representativos de la prueba de campo abierto de cinco minutos muestran que la lesión por aplastamiento nervioso, cinco semanas después de la cirugía, no tiene ningún efecto sobre la actividad locomotriz. El análisis de la marcha con el sistema CatWalk XT genera muchos parámetros diferentes.
Se pudieron detectar alteraciones significativas para la velocidad promedio de carrera, la longitud de la zancada y el área de impresión de la pata trasera derecha lesionada por los nervios. Las ratas de tipo salvaje lesionadas por los nervios mostraron un tiempo de latencia significativamente mayor para cruzar la viga, en comparación con las ratas ingenuas de tipo salvaje cinco semanas después de la lesión. Como lectura adicional de la tarea de caminar de la viga, los resbalones completos y los medios resbalones del miembro trasero nervio-dañado fueron contados y considerados como error para el análisis estadístico.
El porcentaje de errores por paso del miembro posterior derecho nervio-dañado fue aumentado perceptiblemente del tipo salvaje nervio-dañado ratas, comparadas al tipo salvaje ratas ingenuas. Los datos representativos de la tarea de caminar peldaños de escalera no muestran alteraciones significativas en el tiempo de latencia para cruzar la pasarela del aparato de peldaños de escalera, o en el porcentaje de errores por paso del miembro posterior derecho lesionado por nervio. El análisis del porcentaje de error por paso del miembro posterior lesionado de nervios consideró solo la puntuación de 0 a 2 de la escala de 7 categorías de Mets y colegas.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo realizar una lesión por aplastamiento del nervio ciático, y cómo implementar una evaluación multifactorial del comportamiento motor en ratas después del aplastamiento unilateral del nervio ciático. Para lograr resultados consistentes, reproducibles y comparables después de una lesión por aplastamiento del nervio ciático, un método estandarizado para inducir el aplastamiento nervioso es esencial, así como una caracterización fenotípicamente estandarizada. El entrenamiento adecuado para la prueba de comportamiento específica proporciona las ventajas de ahorrar tiempo durante la evaluación del experimento y obtener mejores resultados.
