Questo lavoro è stato supportato dal NIH K08NS065157 (al TAF) Inoltre, il Centro Penn per disordini muscoloscheletrici, Numero P30AR050950 Award dal National Institute of Arthritis, malattie del sistema muscoloscheletrico e Pelle sostenuto questo lavoro (TAF e Steven S. Scherer). Infine, Shriners Pediatric Research finanziamento Seed Center (TAF) ha sostenuto questo lavoro. Vorremmo ringraziare il dottor Young-Jin Son inizialmente per dimostrare tutta la procedura di montaggio e di Amy A. Kim per la sua assistenza nella produzione i disegni della figura 1.

1. Soggetti animali 1,1. Trattamento <ol><li> Tutte le procedure sugli animali deve essere effettuata con l&#39;approvazione della Animal Care dell&#39;istituzione locale e del comitato etico e in conformità con l&#39;uso e il Comitato e le linee guida dei National Institutes of Health, con le misure adottate per ridurre al minimo il dolore e disagio. </li><li> I nostri topi sono stati alloggiati in condizioni di temperatura controllata di 12 ore di luce di retromarcia e del ciclo di scuro, mentre il mouse alimentato chow e acqua ad libitum. </li><li> Per gli studi di rigenerazione adulto, topi deve essere di almeno 6 settimane di età, quando la calca nervo sciatico viene eseguita. Questa età è oltre il momento in cui la potatura di polyneural giunzioni neuromuscolari luogo. </li><li> In questi esperimenti, abbiamo utilizzato 6-8 settimane vecchio C57BL / 6 topi acquistati presso Charles River. Quando si confrontano rigenerazione dopo schiacciamento del nervo sciatico (es.: tasso di crescita degli assoni) ceppi di topi dovrebbe essere la stessa, come differenze di rigenerazione assonale non sono statied tra i diversi ceppi inbred 15,16. Se topi geneticamente manipolati devono essere utilizzati, controlli cucciolata più appropriate. </li></ol> 1,2. Preparazione chirurgica <ol><li> Gli animali sono profondamente anestetizzati per la chirurgia usando un cocktail di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) tramite iniezione intraperitoneale. Ogni animale riceve anche una iniezione sottocutanea di meloxicam (10 mg / kg) per ridurre al minimo dolore post-operatorio. </li><li> Entrambi i quarti posteriori sono accuratamente rasata utilizzando un tagliaunghie chirurgici (Roboz, RC-5903) e depilazione viene completata la rimozione dei peli con la crema Nair (che si trova in farmacia). </li><li> La pelle è purificata utilizzando applicatori di cotone sterili punta e macchia Betadine chirurgico (Fisher Scientific, 19066452). </li><li> Unguento oftalmico (Fisher Scientific, 19.082.795) viene applicata agli occhi con applicatori cotone sterili punta. </li><li> Il mouse viene posizionato su una piastra pulita acciaio inossidabile, in cui è posto un pre-riscaldato homeotcoperta sistema hermic (Harvard Apparatus, 507222F). Animal temperatura viene mantenuta a 37 ° C. </li><li> Tutti gli arti sono nastrate basso, facendo attenzione a posizionare gli arti posteriori simmetricamente in modo che l&#39;articolazione del ginocchio fa un angolo retto con il corpo (figura 1, pannello A). </li><li> Il campo chirurgico viene coperto con una garza sterile. Tutti gli strumenti sono sterilizzati in autoclave o la sterilizzazione a caldo tallone (strumenti per le scienze Belle, 18000-45) e il chirurgo indossa una maschera, camice e guanti sterili. </li></ol> 2. Crush nervo sciatico riproducibile <ol><li> Dopo la preparazione, un semi-circolare incisione attraverso la linea mediana (Figura 1) è realizzato in pelle. La pelle viene delicatamente sezionato dalla muscolatura sottostante, e ripiegato a rimanere fuori strada durante la procedura. Si è tenuto umido utilizzando le applicazioni di 0,1 ml di soluzione salina sterile (Hospira, 0409-4888-20) durante la procedura. </li><li> Apertura del piano fasciale tra il gluteo e la testa anteriore del bicipite femoris rivela il nervo sciatico (figura 1, pannello A). Per un controllo chirurgico, il nervo sciatico controlaterale deve essere esposto e mobilitati, ma ha lasciato intatto. La muscolatura dei glutei viene poi ri-opposizione e suturato con un 6-0 di seta intrecciata, suture non riassorbibili (Roboz, SUT-1073-11). </li><li> Il nervo sciatico sperimentale è quindi esposto nello stesso modo, con divaricatori in atto per facilitare la visualizzazione (Figura 1, pannello B). I divaricatori vengono sterilizzati prima dell&#39;uso. Nota: Anche se i sistemi retrattori sono disponibili in commercio, sono spesso molto costosi. Siamo stati in grado di fare un soddisfacente sistema divaricatore con forniture hardware economico e perni insetti (vedi sezione Materiali). </li><li> Il nervo sciatico è quindi delicatamente liberata dal tessuto connettivo che circonda con le forbici iridectomia. </li><li> Utilizzando un fine 5/45 (Strumenti di scienze Arti, 11251-35) pinza, il nervo è posto sulla parte inferiore della mandibola una pinza emostatica super-sottili (Science troppo benels, 13020-12). I tre fascicoli sono allineati in sequenza, non uno sopra l&#39;altro (figura 1, riquadro B). Le pinze emostatiche sono state incise con un segno a 1.5 mm dalla loro punta. La parte più esterna dello sciatico è posto in linea con questo marchio prima cotta. Questo garantisce una cotta di larghezza uniforme, e che il nervo non si estende oltre le ganasce della pinza emostatica quando appiattito a causa della forza di schiacciamento. Se il nervo si estende oltre la punta della pinza il nervo saranno solo parzialmente schiacciato. </li><li> La compressione è perpendicolare al nervo a 45 mm dal terzo dito, come misurato da un filo che approssima il percorso del nervo sciatico. Il nervo è schiacciato una volta per 15 secondi a 3 scatti delle pinze emostatiche. La cura è attenzione a non allungare il nervo. Quando i hemostats sono riaperti, il nervo intero dovrebbe essere trasparente sul sito cotta. </li><li> Una seconda coppia di pinze emostatiche (identico al primo), che è stato pre-immerso inpolvere di carbonio (Fisher Scientific, C272-500) è usato per marcare il sito cotta. Il nervo è schiacciato sul sito stesso cotta per 15 secondi a 3 scatti. No di carbonio marcatura deve estendersi oltre il confine della cotta iniziale. Ciò è particolarmente importante se contrassegno esatto del sito cotta è richiesto. Prima dell&#39;uso, polvere di carbone viene sterilizzato mediante esposizione a luce UV per due ore, e successivamente viene gestito utilizzando una tecnica sterile. <ol><li> Per pre-immergere le pinze di carbonio ma esclude carbonio diffusa sul sito chirurgico, le pinze si aprono in carbonio in polvere, quindi delicatamente chiuso (ma non cliccato) chiusa, e il carbonio all&#39;esterno delle hemostats viene rimosso utilizzando garza sterile . Le pinze vengono controllati in almeno 3x per verificare che le superfici di frantumazione sono uniformemente rivestite di carbonio in polvere. Se necessario, sono ri-immersa e si asciugò. </li></ol></li><li> La muscolatura gluteo sono ri-oppone e suturata nello stesso modo come il lato controlaterale. </li><li> Infine, l&#39;incisione cutanea viene chiusa con 9 clip mm reflex (Strumenti di precisione del Mondo, 500346; applicatrice: 500345). Se 9 clip mm reflex si trovano a limitare il movimento, più piccole clip reflex o 6-0 punti di sutura (Roboz, SUT-1073-11) può essere utilizzato in sostituzione. </li></ol> 3. Post-operatorio <ol><li> Seguendo la procedura, gli animali vengono posti su un cuscinetto riscaldante a 37 ° C finché non mostrano segni di movimento. </li><li> Essi sono poi spostati nella loro gabbia di casa, dove l&#39;acqua e il cibo sono facilmente accessibili sul pavimento, sotto forma di idrogel e cibo umido. </li></ol> 4. Semi-Thin Preparazione <ol><li> Dopo una overdose di pentobarbital (300 mg / kg) la muscolatura delle gambe viene rimossa per esporre l&#39;* nervo sciatico. Con il nervo rimane in situ, il quarto posteriore è immerso in paraformaldeide al 2% e il 2% di glutaraldeide in tampone fosfato 0,1 M in ghiaccio per 30 minuti. * Se completando tutta la preparazione muscolare di montaggio, i muscoli vengono raccolteprima di esporre ed il nervo sciatico. </li><li> Il nervo viene accuratamente rimossa, facendo attenzione a gestire solo l&#39;estremità prossimale. Poi il nervo è post-fissa nella stessa fissativo per tre ore aggiuntive. </li><li> Dopo fissazione del nervo viene lavata tre volte in tampone fosfato 0,1 M. </li><li> Il nervo è immerso in tetrossido di osmio 2% in tampone fosfato 0,1 M per un&#39;ora. </li><li> Il nervo è poi disidratato per immersione sequenziale in etanolo sempre più concentrato (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%). Ogni immersione è di 15 minuti. </li><li> Il nervo disidratato viene incubato per due volte in ossido di propilene per tre minuti ciascuno. </li><li> Poi il nervo è immerso in una miscela 1:1 di ossido di propilene e incorporare 812 per almeno 6 ore (di solito una notte). </li><li> Poi il nervo è immerso in una miscela 02:01 di ossido di propilene e incorporare 812 durante la notte. </li><li> Infine, il nervo è immerso in puro Incorporare 812 per sei ore, poi incorporato nello stampo appropriato e baked a 60 ° C per 48 ore. </li><li> 1.0 micron sezioni sono tagliate dal tronco nervo distale ad una distanza impostata dal sito utilizzando uno schiacciamento Ultracut UCT ultramicrotomo (Leica) con un coltello in vetro e colorate con blu di toluidina. Sezioni sottili possono anche essere prodotti per l&#39;esame della ultrastruttura al microscopio elettronico. </li></ol> 5. Tutta Monte preparazione muscolare <ol><li> I primi topi vengono sacrificati con una overdose di pentobarbital (300 mg / kg) e gli arti posteriori sono stati rimossi alle ginocchia. </li><li> Quattro muscoli dell&#39;arto posteriore vengono rimossi per l&#39;analisi: il tibiale anteriore (TA), estensore lungo delle dita (EDL), soleo e peroneo lungo. </li><li> Tutti i muscoli vengono rimossi attraverso la dissezione attenta e appuntato attraverso il loro tessuto connettivo ad un Sylgard nero (Fisher Scientific, NC9492579) piatto rivestito. Essi sono lavate in PBS, e quindi fissati in paraformaldeide al 4% per 30 minuti. </li><li> Il TA viene quindi lavate in PBS, incorporato in OCT (Fisher Scientific, 14-373-65), e congelati rapidamente in un bagno di acetone e ghiaccio secco. <ol><li> E &#39;conservato a -80 ° C per il sezionamento sottili nel caso in cui tutta la preparazione del montaggio non riesce. In generale, il TA è troppo spesso per adeguati supporti interi. </li></ol></li><li> Il EDL, soleus e peroneo lungo vengono risciacquati per 3 x 10 minuti in PBS, posti in 0,1 M glicina * (Fisher Scientific, AC12007-0010, diluito in PBS) per 30 minuti, e risciacquate 3 x 10 minuti in PBS nuovamente. Vengono quindi bloccata in metanolo ghiacciato 100% per 5 minuti esatti a -20 ° C, risciacquati 3 x 10 minuti in PBS, e immersi in fluorescentemente coniugato alfa-bungarotossina (diluito 1:200 in PBS) per 30 minuti. I muscoli sono risciacquati per 3 x 10 minuti in PBS, seguito da 1 ora di blocco in 2% BSA (KPL, 50-61-00) e 0,2% Triton X-100 (Dot Scientific Incorporated, 9002-93-1) * in PBS e incubate per una notte, mentre a dondolo a 4 ° C in un cocktail di anticorpi primari diluito nello stesso blocco 2% Triton BSA/0.2%. * Glycine e soluzioni di bloccaggio sono realizzati lo stesso giorno di raccolta muscolare e si agita per 30-60 minuti a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. <ol><li> Per celebrare assoni e sinapsi neuromuscolari, si usa una combinazione di un marcatore monoclonale neurofilamenti mouse (Covance, SMI-312R, diluito 1:1000), un anticorpo monoclonale marker delle vescicole sinaptiche del mouse (SV2 DSHB, diluito 1:1000), e alfa rodamina coniugata -bungarotossina (Sigma-Aldrich, diluito 1:200). Per celebrare reattive cellule di Schwann che usiamo di coniglio anti-GAP-43 (Novus Biologicals, NB300-143, diluito 1/500). Gli anticorpi primari sono visualizzati con una IgG1 sottotipo specifico di capra coniugato con fluoresceina anticorpo anti-topo secondaria e DyLight 649 coniugato asino anti-coniglio (ImmunoResearch Jackson, diluito 1:200). </li></ol></li><li> Il giorno seguente, i muscoli sono lavate in PBS per 3 x 10 minuti, e incubate in anticorpi secondari diluito 1:200 (in soluzione al 2% Triton BSA/0.2 blocco%). Essi vengono poi risciacquate 2 x 10 minuti in PBS, FOllowed da 5 minuti di immersione in DAPI (Invitrogen, D3571, diluita a 300 nM in acqua deionizzata), e altri 10 minuti di risciacquo in PBS. </li><li> Ogni muscolo è poi sezionato in una Sylgard nero (Fisher Scientific, NC9492579) rivestito capsula di Petri. Inizialmente i tendini vengono rimossi i punti di inserimento nel muscolo, e quindi i muscoli sono diluiti con staccando fibre muscolari interni (Figura 3, pannelli AC). Si deve aver cura di mantenere superficie esterna del muscolo, comprese le bande piastra terminale (Figura 3, i pannelli DF). I muscoli risultanti sono montate su slitte più (Fisher Scientific, 12-550-15) con Vectashield (Vector Laboratories, H-1000) e 22 x 40 mm vetrini (Fisher Scientific, 12-548-5C) sigillati da una chiara smalto su due lati. Se correttamente montato sulla slitta i contatti placca motrice band il coprioggetti. </li></ol> 6. Rigenerazione di misura <ol><li> La rigenerazione può essere stimato in tutti e tre i muscoli (peroneo, EDL, e soleo). Spesso exammina rigenerazione quattordici giorni dopo la sbandata del nervo, un momento in cui una percentuale sostanziale di NMJs sono ri-innervate. Entrambi i punti precedenti e successivi il tempo sono anche adatti, a seconda della questione scientifica viene chiesto. In ogni muscolo, ri-innervazione della band intera piastra terminale viene esaminato. Solo en NMJs superficie viso vengono segnati. In questo modo, almeno 200 NMJs per muscolo può essere rapidamente esaminati. </li><li> Per segnare muscolare reinnervazione si determina una &quot;ri-innervazione ratio&quot;. Il denominatore è il numero di denervati giunzioni neuromuscolari, come etichettati da α-bungarotossina GAP-43 cellule di Schwann vincolante e immunoreattività. Il numeratore è il numero di ri-innervazione NMJs come etichettati da neurofilament/SV2 immunoreattività. Se necessario, NMJs può essere classificato come parzialmente (copertura incompleta del α-bungarotossina da SV2) o completamente (copertura completa di α-bungarotossina da SV2) re-innervata. Per esempi di NMJs re-innervati e denervati Figura 3, i pannelli G e H. </li></ol> 7. Risultati rappresentativi <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig1.jpg" /> Figura 1. Schema dell&#39;anatomia dell&#39;arto posteriore, importante per schiacciamento del nervo. A. Un semi-circolare incisione cutanea è stata effettuata rivelando la muscolatura sottostante. B. La muscolatura dei glutei è stato separato, e il nervo sciatico rivelato (passo 2.4). Una freccia indica il sito approssimativa cotta. Posizionamento Retractor è mostrato come una guida generale, e viene regolato nel corso di ogni intervento chirurgico per facilitare la visualizzazione dello sciatico e l&#39;approccio delle pinze emostatiche per schiacciare B (inserto). Posizionamento dello sciatico sulla mascella inferiore delle pinze emostatiche appena prima cotta (punto 2.5). Fascicoli separati sono etichettati in modo da dimostrare che sono adiacenti in orizzontale, ma non verticalmente, durante la calca. Anche se tre fascicles sono etichettati in questo diagramma, si può anche vedere un quarto fascicolo, il ramo articolare del peroneo. Per un disegno anatomico più dettagliata dei modelli di ramificazione del nervo sciatico fascicoli distale al punto di schiacciare, consultare Anatomy Greene del Topo, 188 Figura 17. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig2.jpg" /> Figura 2. A-carbonio marcato sito di schiacciamento in situ e blu toluidina macchiati, semi-sottili sezioni schiacciato nervo sciatico. A. Un esempio di un sito di schiacciamento in situ (arto posteriore sinistra). Nerofumo indica il sito di schiacciamento. L&#39;asterisco indica un ramo del nervo tibiale che innerva la muscolatura della coscia e serve come utile punto di riferimento durante l&#39;intervento cotta. La divisione tibiale del nervo sciatico è delineata in blu, il peroneo in verde, e il surale in giallo. B. Semi-sezioni sottili dimostrando una cotta completo eseguito con la forza emostaticops. C. Semi-sezioni sottili che dimostrano una cotta incompleta eseguita con una pinza ad angolo. In entrambe le immagini profili di degenerazione della mielina sono contrassegnati con punte di freccia. Nel pannello frecce C indicare esempi di profili mielina conservati e un gruppo di assoni risparmiati. Barra della scala è di 10 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3606/3606fig3.jpg" /> Figura 3 intero schema di montaggio e muscolare NMJs rappresentativi AC:.. Immagini di rendering di EDL (A), peroneo lungo (B), e il soleo (C) i muscoli dopo la rimozione da arti posteriori. I muscoli mostrati sono da destra arti posteriori. Ginocchio e della caviglia anatomico orientamento sono inclusi anche per riferimento. Tendini sono bianco colorato ed illustrato in una linea nera quando posizionato sulla sommità del muscolo. Vengono delineate in una linea nera tratteggiata quando estendono sotto il muscolo. I tagli sono mostrati in rosso linee tratteggiate.Muscle viene staccato dai siti di taglio, come indicato dalle frecce blu, e successivamente diluito. Dopo il diradamento, il muscolo viene separato dalle spine da taglio intorno a ciò che resta dei tendini bloccati: DF. Immagini renderizzate dai muscoli di montaggio intero, previa rimozione del tessuto connettivo e conseguente diradamento. Le bande piastra terminale sono riportate su ogni muscolo GH:. Muscolo soleo tutta mount quattordici giorni dopo il crush del nervo sciatico dimostrando nuovamente innervate (G) e denervati (H) giunzioni neuromuscolari. In questi pannelli, NMJs, assoni, e cellule di Schwann sono visualizzati come descritto sopra nel paragrafo 5.5.1. Recettori per l&#39;acetilcolina sono di colore rosso, verde assoni e cellule di Schwann elabora blu. Nel pannello G, le frecce indicano le aree del NMJ che sono stati ri-innervati da un assone. Nel pannello H frecce indicano GAP-43 positive processi di cellule di Schwann. Si noti l&#39;assenza di assoni. Barra della scala è di 10 micron.

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	<li>Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+neurotoxic+and+neuroprotective+agents+on+peripheral+nerve+regeneration+assayed+by+time-lapse+imaging+in+vivo.">Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).</li><li>Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+A+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: A confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Exp. Neurol. 207, 64-74 (2007).</li><li>Amado, S., Sim&#241;es, M. J., Armada-da-Silva, P. A. S., Lu&#237;s, A. L., Shirosaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hybrid+chitosan+membranes+and+N1E-115+cells+for+promoting+nerve+regeneration+in+an+axonotmesis+rat+model.">Use of hybrid chitosan membranes and N1E-115 cells for promoting nerve regeneration in an axonotmesis rat model.</a> Biomaterials. 29, 4409-4419 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Rodrigues, J. M., Geuna, S., Amado, S., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+cell+transplantation+effects+on+sciatic+nerve+regeneration+after+a+standardized+crush+injury+in+the+rat.">Neural cell transplantation effects on sciatic nerve regeneration after a standardized crush injury in the rat.</a> Microsurgery. 28, 458-470 (2008).</li><li>Lu&#237;s, A. L., Amado, S., Geuna, S., Rodrigues, J. M., Sim&#240;es, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+and+morphological+assessment+of+a+standardized+rat+sciatic+nerve+crush+injury+with+a+non-serrated+clamp.">Long-term functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp.</a> J. Neurosci. Methods. 163, 92-104 (2007).</li><li>Baptista, A. F., de Souza Gomes, J. R., Oliveira, J. T., Santos, S. M. G., Vannier-Santos, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+assess+function+after+sciatic+nerve+lesion+in+the+mouse+-+adaptation+of+the+sciatic+static+index.">A new approach to assess function after sciatic nerve lesion in the mouse - adaptation of the sciatic static index.</a> J. Neurosci. Methods. 161, 259-264 (2007).</li><li>Ronchi, G., Raimondo, S., Varej&#227;o, A. S. P., Tos, P., Perroteau, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+crush+injury+of+the+mouse+median+nerve.">Standardized crush injury of the mouse median nerve.</a> J. Neurosci. Methods. 188, 71-75 (2010).</li><li>Berg, A., Zelano, J., Cullheim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin+G-2+ligand+mRNA+is+downregulated+in+spinal+motoneurons+after+sciatic+nerve+lesion.">Netrin G-2 ligand mRNA is downregulated in spinal motoneurons after sciatic nerve lesion.</a> Neuroreport. 21, 782-785 (2010).</li><li>Girolami, E. I., Bouhy, D., Haber, M., Johnson, H., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+potential+role+of+SOCS1+and+SOCS3+in+Wallerian+degeneration+in+injured+peripheral+nerve.">Differential expression and potential role of SOCS1 and SOCS3 in Wallerian degeneration in injured peripheral nerve.</a> Exp. Neurol. 223, 173-182 (2010).</li><li>Hossain-Ibrahim, M. K., Rezajooi, K., Stallcup, W. B., Lieberman, A. R., Anderson, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+axonal+regeneration+in+the+central+and+peripheral+nervous+systems+of+the+NG2-deficient+mouse.">Analysis of axonal regeneration in the central and peripheral nervous systems of the NG2-deficient mouse.</a> BMC Neurosci. 8, 80-80 (2007).</li><li>Thornton, M. R., Mantovani, C., Birchall, M. A., Terenghi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+N-CAM+and+N-cadherin+expression+in+axotomized+and+crushed+rat+sciatic+nerve.">Quantification of N-CAM and N-cadherin expression in axotomized and crushed rat sciatic nerve.</a> J. Anat. 206, 69-78 (2005).</li><li>Beer, G. M., Steurer, J., Meyer, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+nerve+crushes+with+a+non-serrated+clamp.">Standardizing nerve crushes with a non-serrated clamp.</a> J. Reconstr. Microsurg. 17, 531-534 (2001).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Abbiamo presentato un metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico affidabile completo con marcatura precisa del sito cotta. Come accennato in precedenza, crush del nervo sciatico è un modello comune di lesione dei nervi periferici nei topi e nei ratti. Sebbene ogni metodo di compressione ha i suoi vantaggi e svantaggi, abbiamo trovato questo metodo ha prodotto una cotta completo che era facilmente contrassegnata con un minimo di attrezzature speciali (ad esempio pinze speciali, ecc.) <p class="jove_st...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Clipper Mini 0000 il n Lama </td><td> Roboz </td><td> RC-5903 </td></tr><tr><td> Nair Remover Capelli (9 oz.) </td><td> Chiesa e Dwight Co., Inc. </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Betadine Scrub chirurgico (1 gallone) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19066452 </td></tr><tr><td> Unguento oftalmico (1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19082795 </td></tr></tbody></table> Strumenti chirurgici: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> FST 250 Hot tallone sterilizzatore </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 18000-45 </td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Scissors Iris (11 cm di lunghezza) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500216 </td></tr><tr><td> Potts-Smith Pinza (Straight, 18 centimetri; 1x2 Teeth) </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11024-18 </td></tr><tr><td> McPherson-Vännäs Scissors (5 lame mm) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 14124-G </td></tr><tr><td> Dumont # 5 - Pinza Dumoxel standard Tip </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11252-30 </td></tr><tr><td> Dumont # 5/45 - Pinza Dumoxel standard Tip </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 11251-35 </td></tr><tr><td> Ultra hemostats Arti (Diritto; superfici interne lisce) </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 13020-12 </td></tr><tr><td> Carbone attivo in polvere (500 g) </td><td> Fisher Scientific </td><td> C272-500 </td></tr><tr><td> Dimensione 6-0 suture con C-1 ago (sterile, Seta, Nero, intrecciato,Non assorbibile, 18 &quot;Length, Box di 36) </td><td> Roboz </td><td> SUT-1073-1011 </td></tr><tr><td> Reflex Applier Clip (per 9 clip mm) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500345 </td></tr><tr><td> 9 mm in acciaio inossidabile Clips Reflex (100/box) </td><td> Mondo Strumenti di precisione </td><td> 500346 </td></tr></tbody></table> Animal Care: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 0,9% cloruro di sodio per iniezione (conservanti, 20 mL) </td><td> Hospira </td><td> 0409-4888-20 </td></tr><tr><td> Sistema completo Blanket omeotermi con sonda flessibile (Medium, 115 VAC, 60 Hz) </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 507222F </td></tr></tbody></table> Platfor chirurgicom retrattori di: (Acquistato nel negozio di ferramenta locale) <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione /) </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Piattaforma in acciaio inossidabile (Lavorato; x1 ~ 12 &quot;x12&quot; / 8 &quot;) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Magneti Button (Esempio: Eclipse e825) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Viti in acciaio inox (3 &quot;Long; Diametro Determinato da Magneti Button) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Dadi in acciaio inox (di dimensioni adatte a Bulloni) </td><td> 9 </td></tr><tr><td> Elastici (Tension Light) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Pins insetti (entrambe le estremità piegate a formare ganci) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Semi-Fluidifica: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore &lt;/ Strong&gt; </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Paraformaldeide (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Sodio fosfato bibasico anidro (500 g; utilizzato per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico anidro (1 kg, utilizzati per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide (50%, 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18431 </td></tr><tr><td> Osmio di diazoto (4% acquosa, 10 x 10 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18465 </td></tr><tr><td> Ossido di propilene (450 mL) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 18601 </td></tr><tr><td> Incorpora 812 (Kit, per i blocchi duri / contrasto immagine ad alta) </td><td> Scienze della microscopia elettronica </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> Toluidine blu (25 g) </td><td> Ted Pella, Inc. </td><td> 19451 </td></tr></tbody></table> Tutta Monte Preparazione muscolare e Immunoistochimica: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome (descrizione / quantità) </td><td> Fornitore </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Paraformaldeide (1 kg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6148-1KG </td></tr><tr><td> Sodio fosfato bibasico anidro (500 g; utilizzato per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> S375-500 </td></tr><tr><td> Sodio fosfato monobasico anidro (1 kg, utilizzati per preparare tampone fosfato) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> 10% di BSA diluente / Blocking Solution (200 mL) </td><td> Kirkegaard &amp; Perry Laboratories, Inc. </td><td> 50-61-00 </td></tr><tr><td> Triton X-100 (100 mL) </td&gt; <td> Dot scientifico Incorporated </td><td> 9002-93-1 </td></tr><tr><td> Glicina, 98% (1 kg) </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC12007-0010 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Cryo-OCT Compound (causa del 12, 4 bottiglie oz) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-373-65 </td></tr><tr><td> Sylgard DOW 170 (2 Kit lb) </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC9492579 </td></tr><tr><td> Insetti in acciaio inox Pins, Size 1, 100/PKG) </td><td> Strumenti di Scienza Fine </td><td> 26001-40 </td></tr><tr><td> Tetrametilrodamina-A-bungarotossina (0,5 mg) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0195-.5MG </td></tr><tr><td> Mouse anticorpo monoclonale contro SMI-312 (0,1 ml) </td><td> Covance </td><td> SMI-312R </td></tr><tr><td> Mouse anticorpo monoclonale contro SV2 (0,1 mL) </td><td> Developmental Studies ibridomi Bank (DSHB) </td><td> SV2 </td></tr><tr><td> Coniglio PolyAnticorpo clonale Contro GAP-43 </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB300-143 </td></tr><tr><td> Flourescein capra coniugato anti-topo IgG, Fcy Subclass uno specifico </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=115-095-205&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">11 5-095-205</a> </td></tr><tr><td> DyLight 649 coniugata Donkey Anti-Rabbit IgG </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> <a href="http://www.jacksonimmuno.com/MERCHANT2/merchant.mv?Screen=BASK&amp;Store_Code=JI&amp;Action=ADPR&amp;Product_Code=711-495-152&amp;Attributes=Yes&amp;Quantity=1">711-495-152</a> </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-Diamidino-2-fenilindolo (DAPI, dilactate; 10 mg) </td><td> Invitrogen </td><td> D3571 </td&gt; </tr><tr><td> Vectashield Mezzo di montaggio (10 mL) </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-1000 </td></tr><tr><td> SuperFrost Plus preparati microscopici (Bianco; Dimensioni: 75 x 25 mm, confezione da 144) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium Occhiali copertina (dimensioni: 40 x 22 mm, confezione da 1 oz.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-548-5C </td></tr></tbody></table>

reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis

Rigenerazione del sistema nervoso periferico (SNP) è ampiamente studiata sia per la sua rilevanza per le malattie umane e comprendere la robusta risposta rigenerativa montato dai neuroni PNS così eventualmente illuminano i fallimenti di rigenerazione CNS 1. Schiacciamento del nervo sciatico (assonotmesi) è uno dei modelli più comuni di lesioni dei nervi periferici nei roditori 2. Frantumazione interrompe tutti gli assoni delle cellule di Schwann, ma lamine basali sono conservati in modo che la rigenerazione è ottimale 3,4. Ciò consente al ricercatore di studiare proprio la capacità di un assone di interagire sia con il cellule di Schwann e lamine basale 4. I ratti sono stati generalmente i modelli animali preferiti per schiacciamento del nervo sperimentale. Essi sono ampiamente disponibili e la loro nervo sciatico lesionato fornisce una ragionevole approssimazione delle lesioni nervose umane 5,4. Anche se di dimensioni inferiori rispetto ratto del nervo, il nervo mouse è dotato di molte qualità simili. Ma, soprattutto, mousmodelli E sono sempre più prezioso per l&#39;ampia disponibilità di linee transgeniche permette ora una dissezione dettagliata delle singole molecole fondamentali per la rigenerazione del nervo 6, 7. Precedenti ricercatori hanno usato diversi metodi per produrre uno schiacciamento del nervo o lesioni anche semplici pinzette angolate, pinze fredde, pinze emostatiche, pinze vascolari, e morsetti investigatore progettati 8,9,10,11,12. Gli investigatori hanno anche utilizzato vari metodi di marcatura del sito procurando lesioni sutura, particelle di carbonio e perline fluorescenti 13,14,1. Descriviamo il nostro metodo per ottenere uno schiacciamento del nervo sciatico riproducibile completa con un accurato e persistente marcatura del crush-sito utilizzando una pinza emostatica e sottili di carbonio conseguente schiacciamento-site marcatura. Come parte della nostra descrizione della procedura crush del nervo sciatico abbiamo anche incluso un metodo relativamente semplice di montare tutto muscoli che usiamo per quantificare successivamente rigenerazione.

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Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

In questo rapporto si descrive un metodo per schiacciare nervo sciatico mouse. Questo metodo utilizza pinze emostatiche immediatamente disponibili e facilmente riproducibile e produce completo schiacciamento del nervo sciatico. Inoltre, si descrive un metodo per preparare supporti muscolo intero adatti per l&#39;analisi di rigenerazione nervosa dopo schiacciamento del nervo sciatico.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

reproducible-mouse-sciatic-nerve-crush-subsequent-assessment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

33.6K Views.  Temple University. In questo rapporto si descrive un metodo per schiacciare nervo sciatico mouse. Questo metodo utilizza pinze emostatiche immediatamente disponibili e facilmente riproducibile e produce completo schiacciamento del nervo sciatico. Inoltre, si descrive un metodo per preparare supporti muscolo intero adatti per l'analisi di rigenerazione nervosa dopo schiacciamento del nervo sciatico.

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Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

Isolamento Axoplasm da Nerve Rat sciatico

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Ricerca

Neuroscienze

Assessment of Social Interaction Behaviors

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and stability of the networks and relationships that define societies. For animals, such as mice, recognition of conspecifics may be important for maintaining social hierarchy and for mate choice 1.
A variety of neuropsychiatric disorders are characterized by disruptions in social behavior and social recognition, including depression, autism spectrum disorders, bipolar disorders, obsessive-compulsive disorders, and schizophrenia. Studies of humans as well as animal models (e.g., Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Mus musculus, Rattus norvegicus) have identified genes involved in the regulation of social behavior 2. To assess sociability in animal models, several behavioral tests have been developed (reviewed in 3). Integrative research using animal models and appropriate tests for social behavior may lead to the development of improved treatments for social psychopathologies.
The three-chamber paradigm test known as Crawley's sociability and preference for social novelty protocol has been successfully employed to study social affiliation and social memory in several inbred and mutant mouse lines (e.g. 4-7). The main principle of this test is based on the free choice by a subject mouse to spend time in any of three box's compartments during two experimental sessions, including indirect contact with one or two mice with which it is unfamiliar. To quantitate social tendencies of the experimental mouse, the main tasks are to measure a) the time spent with a novel conspecific and b) preference for a novel vs. a familiar conspecific. Thus, the experimental design of this test allows evaluation of two critical but distinguishable aspects of social behavior, such as social affiliation/motivation, as well as social memory and novelty. "Sociability" in this case is defined as propensity to spend time with another mouse, as compared to time spent alone in an identical but empty chamber 7. "Preference for social novelty" is defined as propensity to spend time with a previously unencountered mouse rather than with a familiar mouse 7. This test provides robust results, which then must be carefully analyzed, interpreted and supported/confirmed by alternative sociability tests. In addition to specific applications, Crawley's sociability test can be included as an important component of general behavioral screen of mutant mice.

Here we describe a detailed protocol for examination of sociability in mice by using Crawley's sociability and preference for social novelty test. We describe the advantages and possible applications for this procedure, including critical details important for correct interpretation of the results.

Valutazione dei comportamenti di interazione sociale

Social interactions are a fundamental and adaptive component of the biology of numerous species. Social recognition is critical for the structure and ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled samples with little to no tissue damage enables us to analyze cell morphology and to compare individual samples to each other, hence allowing the identification of mutant anomalies.
In the demonstrated dissection method the nervous system remains mostly inside the adult fly. Through a dorsal incision, the abdomen and thorax are opened and most of the internal organs are removed. Only the dorsal side of the ventral nerve cord (VNC) and the cervical connective 
(CvC) containing the big axons of the giant fibers (GFs)1 are exposed, while the brain containing the GF cell body and dendrites remains2 in the 
intact head. In this preparation most nerves of the VNC should remain attached to their muscles. 
Following the dissection, the intracellular filling of the giant fiber (GF) with a fluorescent dye is demonstrated. In the CvC the GF axons are located at the dorsal surface and thus can be easily visualized under a microscope with differential interference contrast (DIC) optics. This allows the injection of the GF axons with dye at this site to label the entire GF including the axons and their terminals in the VNC. This method results in reliable and strong staining of the GFs allowing the neurons to be imaged immediately after filling with an epifluorescent microscope. Alternatively, the fluorescent signal can be enhanced using standard immunohistochemistry procedures3 suitable for high resolution confocal microscopy.

Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection

An in vivo dissection of the adult Drosophila ventral nerve cord (VNC) is demonstrated. This particular dissection method causes little damage to the VNC allowing the subsequent labeling of the giant fiber neurons with fluorescent dye for high resolution imaging.

Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra

To analyze the axonal and dendritic morphology of neurons, it is essential to obtain accurate labeling of neuronal structures. Preparing well labeled ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Whole-mount Imaging di embrione di topo Sensory Axon Proiezioni

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Gene Transfer di cellule di Schwann nel nervo sciatico roditori da elettroporazione

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Whole-Mount Staining, Visualization, and Analysis of Fungiform, Circumvallate, and Palate Taste Buds

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells communicate with nerve fibers that carry this information to the brain. Because taste-transducing cells continuously die and are replaced throughout adulthood, the taste-bud environment is both complex and dynamic, requiring detailed analyses of its cell types, their locations, and any physical relationships between them. Detailed analyses have been limited by tongue-tissue heterogeneity and density that have significantly reduced antibody permeability. These obstacles require sectioning protocols that result in splitting taste buds across sections so that measurements are only approximated, and cell relationships are lost. To overcome these challenges, the methods described herein involve collecting, imaging, and analyzing whole taste buds and individual terminal arbors from three taste regions: fungiform papillae, circumvallate papillae, and the palate. Collecting whole taste buds reduces bias and technical variability and can be used to report absolute numbers for features including taste-bud volume, total taste-bud innervation, transducing-cell counts, and the morphology of individual terminal arbors. To demonstrate the advantages of this method, this paper provides comparisons of taste bud and innervation volumes between fungiform and circumvallate taste buds using a general taste-bud marker and a label for all taste fibers. A workflow for the use of sparse-cell genetic labeling of taste neurons (with labeled subsets of taste-transducing cells) is also provided. This workflow analyzes the structures of individual taste-nerve arbors, cell type numbers, and the physical relationships between cells using image analysis software. Together, these workflows provide a novel approach for tissue preparation and analysis of both whole taste buds and the complete morphology of their innervating arbors.

This paper describes methods for tissue preparation, staining, and analysis of whole fungiform, circumvallate, and palate taste buds that consistently yield whole and intact taste buds (including the nerve fibers that innervate them) and maintain the relationships between structures within taste buds and the surrounding papilla.

Colorazione, visualizzazione e analisi di papille gustative fungiformi, circumvallate e palato

Taste buds are collections of taste-transducing cells specialized to detect subsets of chemical stimuli in the oral cavity. These transducing cells ...