Doy las gracias a L Watanabe, Gorczyca M y otros miembros del laboratorio de Yoshihara por sus valiosos comentarios y discusión. Doy las gracias a K. Scott y Looger L. para las poblaciones de mosca, S Yokoyama para la demostración de experimentos, Shinya Iguchi para la ayuda técnica y Nobuko Yoshihara de información relevante. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental de subvenciones MH85958, y la Fundación Worcester de MI

1. La construcción de las MOSCAS <ol><li> Forma una plataforma de la tapa de 35 mm de plato Falcon por fusión de la pared lateral y el tallado de ella para formar un ángulo apropiado y el espesor (Figura 1a; Figura 2). Haga un agujero en la plataforma para aceptar la cabeza mosca (Figura 1a, b), de tal manera que las partes de la boca son libremente expuesto al exterior de la cámara (Figura 1a). Cortar el extremo de una punta Pipetman, con el juego del tamaño de la mosca para ser observados. Pegar la punta a la plataforma, como se muestra en la Figura 1a para completar las moscas (Figura 2). </li></ol> 2. Preparación de la mosca para la observación <ol><li> Starve una mosca adulta durante 24 horas a 25 ° C antes del experimento, colocándolo en un vial con sólo una toalla de papel húmeda, si es necesario inanición. </li><li> Anestesie la mosca colocándolo en un tubo de 15 ml de plástico de pie sobre el hielo. </li><li> Con unas pinzas, inserte una mosca en la cámara de laVUELA, y empuje suavemente la marcha hasta que se es incapaz de moverse. Luego, inserte un tapón para retener la marcha. (Figura 1a, b). </li><li> Selle las partes circundantes de la trompa proximal (tribuna) hasta el borde interior del agujero; Aplique una pequeña cantidad de adhesivo fotopolimerizable (Tetric EvoFlow) a los lados y por encima de la tribuna desde el exterior (flechas en la Figura 3). También aplicar el pegamento desde el interior de las moscas al espacio entre la parte dorsal de la cabeza y el borde interior del orificio (Figura 1b). Para permitir que la tribuna se mueva libremente, se debe tener cuidado para evitar cualquier pegamento de contacto con la tribuna con una pestaña (o algo similar) para extender el pegamento. Por último, para curar el pegamento con el más débil de la iluminación de la luz azul suficiente para curar para evitar daños a la marcha de un calor excesivo. Retire el tapón. </li><li> Un hilo para mantener la tribuna parcialmente levantado (flecha en la Figura 3) se pueden emplear para estabilizar el vuelo &quot;s la cabeza, evitando golpes de la parte faríngea de SOG y para exponer la parte ventral de la SOG, especialmente para las terminales presinápticas de imágenes de las neuronas Gr5a 8, que están cubiertos por parte de la faringe cuando la trompa está completamente retraída. </li><li> Completa la superficie de la plataforma con una solución salina que contiene azúcar (en mM): NaCl, 140; KCl, 2; MgCl 2, 4,5; CaCl 2, 1,5; y HEPES-NaOH, 5 con un pH de 7,1 10. Esta solución salina libre de sacarosa tiene tonicidad similares a los de uso común de sacarosa que contienen soluciones salinas tales como HL3.1 11. </li><li> Abra la cápsula de la cabeza con una cuchilla de tungsteno y las pinzas con puntas afiladas como tijeras, que es un dispositivo fabricado a medida y diseñado originalmente por el Dr. Kageyuki Yamaoka, Japón, para recortar la cutícula y la tráquea para exponer el SOG (Figura 4). El borde ventral de la cutícula cabeza fue cortada como ventral como sea posible mientras que el corte borde dorsal no fue tan crítico. En primer lugar, hacer una incisión a través de laborde posterior utilizando una cuchilla de tungsteno. A continuación, cortar a través del lado y los bordes anteriores utilizando las pinzas afiladas. La pieza de la cutícula corte debe ser levantado con las pinzas y se retira. Los nervios de las antenas y las antenas deben ser cortadas por las pinzas afiladas. </li><li> A fin de evitar artefactos de movimiento durante las grabaciones, el cerebro debe ser estabilizado mediante la eliminación de ciertas partes de la marcha. En primer lugar, eliminar selectivamente los sacos de aire entre la SOG y la cutícula. Cortar el esófago en el extremo hacia la faringe y al final de entrar en el SOG para eliminar la conexión entre la faringe y el cerebro. Luego tire del músculo 16 12, y finalmente, separar cualquier tráquea que conecta el cerebro y la cutícula. </li><li> Nos pusimos nuestras moscas en el escenario de un microscopio Olympus BX51WI conectado a un sistema de microscopía confocal de disco giratorio (Improvisación en PerkinElmer) (Figura 5). Una lente de inmersión en agua, por ejemplo 40X/0.8 NA, se sumergió en el baño (Figura 6 </strong&gt;). </li></ol> 3. Ca 2 + de imágenes del cerebro <ol><li> Ca 2 + imágenes usando GCaMP3.0 1, 9 se realizó mediante el método establecido por Marella y col. 8 (Figura 6). Utilizando un microscopio confocal de disco giratorio (Improvisación), tomar una sola sección óptica a 4 Hz con un tiempo de exposición de 122ms con 491nm láser de excitación, centrándose en la región de interés (un cuerpo celular de una neurona motora, o una interneurona, o terminales presinápticos gustativos de las neuronas sensoriales) con el software de la velocidad, ver. 4,3 (Improvisación). </li></ol> 4. Estimular la probóscide <ol><li> Aspirar solución 100 mM de sacarosa acuosa en una aguja hipodérmica con una mecha pequeña (hecha de papel japonés Washi, véase la Tabla de los reactivos específicos) que sobresale de la punta (Figura 7). </li><li> Descarga una pequeña gota de solución de sacarosa en la mecha, a continuación, se aspire, inmediatamente before la aplicación de la mecha empapada en papel washi a la punta de la trompa. La mecha de papel Washi sólo debe ser aplicado por un instante para evitar la saciedad (Figura 8). Monitorizar la respuesta de Extensión probóscide (PER) el comportamiento mediante una cámara CCD conectada a un microscopio de disección (Figura 5) simultáneamente con Ca 2 + de imágenes. Los datos deben tomarse dentro de una hora después de comenzar la disección porque la respuesta PER no se mantiene más de una hora bajo estas condiciones. </li></ol> 5. Los resultados representativos Las neuronas motoras del transportador de tribuna, un par de músculos principales responsables de levantar la tribuna para la extensión de trompa, se ha informado que muestran respuestas sólidas a los estímulos dulces 13. Figura 9 muestra las señales de Ca 2 + a través GCaMP3.0 1, 9 expresada por un Ga 4, conductor, E49 13, a partir de un cuerpo celular de la neurona motora. Como se muestra en el video, un Robuc PER se observó en sincronía con un incremento en el Ca 2 + señal. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de la mosca de imagen cerebral en vivo y la etapa de Electrofisiología (moscas). una, las moscas se construye de tal manera que el ángulo de la pared permite la cabeza mosca a salir recta. Tres segmentos de la trompa de moscas están codificados por colores, la tribuna es de color magenta. La mosca se inserta en la cámara con fórceps, y una pieza cortada desde el extremo de una punta Pipetman está enchufado en la parte posterior de la cámara para bloquear la mosca de escape. B, el agujero se agujerea para ajustarse a la cabeza de la mosca. Los huecos restantes están sellados con pegamento fotopolimerizable como se indica para asegurar que no hay fugas. Después de que el pegamento se haya curado, la punta Pipetman como un tapón se retira. La solución salina se vertió en las moscas tales que la superficie del cerebro está completamente cubierto. Es necesario garantizar que no hay fugas salinaIng a cabo en el extremo anterior de la cabeza mosca. El área sombreada rodeada por la línea discontinua en el panel B muestra la parte que se diseccionaron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig2.jpg" /> Figura 2. Fotografía de las moscas. La pared forma de media luna de pegamento (de una pistola de pegamento) se hace para controlar el flujo de solución salina durante la perfusión, y para reducir la cantidad de solución utilizada. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig3.jpg" /> Figura 3. Vista frontal de una mosca montada en las moscas. Esta imagen muestra cómo una mosca se encuentra en las moscas, y cómo la cola de luz de curado se aplica alrededor de la cabeza de la mosca (flechas) para crear un sello a prueba de solución salina. Si las fugas de solución salina a través de la probóscide de la mosca, entonces el experimento fracasará. El hilo (puntas de flecha) atado a la etapa es llevar a cabo la trompa en su posición, de modo que no es completamente retracción<html> Ted. De lo contrario, obstruyen la porción más ventral de la SOG y hacer que los artefactos de movimiento. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig4.jpg" /> Figura 4. Top-visión de las moscas con una mosca disecada. Esta imagen muestra la exposición SOG de que se elimine la mosca cutícula siguiente. El esófago, músculo y 16 tráqueas conectado al cerebro, así como seleccionados sacos de aire también se han eliminado para evitar perturbar el cerebro, que puede conducir a artefactos en las señales de calcio. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig5.jpg" /> Figura 5. El aparato de monitorización. Este aparato está montado a partir de un microscopio Olympus BX51WI conectada a un sistema microscopio confocal de disco giratorio (Improvisación), y un montaje lateral Nikon SMZ800 microscopio. Esta configuración permite la formación de imágenes en vivo de la actividad cerebral durante POR comportamiento. 6 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3625/3625fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Las fotografías que muestran la vista lateral de las moscas. La fina capa de solución salina se intercala entre el 40X de inmersión en agua del objetivo y la mosca. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig7.jpg" /> Figura 7. Esquema para hacer la mecha de papel Washi. Gampi-Washi es un pergamino de papel tradicional japonés que es extremadamente fina y suave (Haibara, Japón). También es muy fuerte y puede retener una gran cantidad de líquido. El papel Washi debe ser cortado en un trapecio con dimensiones muy específicas; 0,3 mm y 0,7 mm de ancho, y 4-5 mm de longitud (uno). Este trapezoide se inserta entonces desde el lado de 0,7 mm en la punta de una aguja hipodérmica 23 G y también se pueden estabilizar mediante la inserción de un pasador de insecto, que se dobla para una forma de V (b). C, el papel Washi se convierte después de la exposición transparentea un líquido, lo que es ideal para este experimento. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig8.jpg" /> Figura 8. La estimulación de la trompa de las moscas con el Washi-mecha. La mecha de papel Washi en la punta de una aguja hipodérmica se aplica por un instante utilizando un manipulador joystick con una mano. La aguja se conecta a través de un tubo flexible a un inyector manipulado con la otra mano, para aspirar y descargar solución de sacarosa. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3625/3625fig9.jpg" /> Figura 9. Los resultados representativos. A, por el comportamiento registrado por la cámara CCD instalado en el microscopio estereoscópico. Vistas frontales de una mosca muerta de hambre con una probóscide largos (flechas) antes de la estimulación, en la estimulación, y después de la estimulación con una mecha que contenía 100 mM de sacarosa solución acuosa (cabeza de flecha). La iluminación se logra mediante un láser nm 491 utilizadode GCaMP fluorescencia. b, sacarosa-inducida GCaMP 3,0 de respuesta en la neurona del motor para el transportador de la tribuna del músculo en el estado de hambre. El panel superior, antes de la estimulación, el panel inferior, inmediatamente después de la estimulación. Barra de escala, a 10 m. C, la cuantificación de la respuesta inducida por sacarosa GCaMP 3.0. La neurona motora responde a un estímulo de sacarosa por un fuerte aumento de la fluorescencia seguida por una fase de restauración de varios segundos a la línea base.

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<p class="jove_content"&gt; No tengo nada que revelar.</p

Los MOSCAS permite la grabación simultánea de señales de Ca 2 + y el comportamiento de PER. Incluso con el cerebro expuesto a la solución salina normal, POR comportamiento se observó. Usando la mecha Gampi-Washi en lugar de una mecha Kimwipe utilizado en la method7 capilar original facilita un comportamiento POR altamente reproducible y estable y evita la necesidad de ser experto en la fabricación y la elección de una mecha Kimwipe buena. Los consejos de experimentación se ha dicho nos ha permitido evitar con éxito las perturbaciones por el movimiento de la trompa, lo que lleva a una grabación muy estable de Ca 2 + señales con poco ruido. En ocasiones, la extirpación de tejido no era suficiente para exponer a las células o suprimir el movimiento de manera adecuada, dando lugar a malos resultados. Sin embargo, una vez que eran expertos, más del 80% de las preparaciones producido buenos resultados. Esta metodología es no sólo para el Ca 2 + de imágenes, pero también se puede adaptar a cualquier imágenes en vivo mientras se observa POR comportamiento. Por ejemplo, podemos acceder a cualquier celular a través de lael uso de un electrodo para grabar directamente la actividad. Combinado con el microscopio de excitación de dos fotones, que son capaces de realizar imágenes de lapso de tiempo de la estructura sináptica, lo que puede estar relacionado con cambios de comportamiento. Por lo tanto, este método de imágenes cerebrales con la observación del comportamiento no sólo es valiosa para la disección funcional de la red neuronal, pero podría ser utilizado como una herramienta potente para correlacionar 14 plasticidad sináptica a los mecanismos que subyacen a la memoria.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Equipo / Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Tetric EvoFlow </td><td> Ivoclar Vivadent </td><td> M04115 </td><td> Fotopolimerizable pegamento </td></tr><tr><td> BX51WI Microscopio </td><td> Olimpo </td><td> BX51WI </td><td> Con 40x (NA 0,8) la lente objetivo de inmersión en el agua </td></tr><tr><td> Spinning sistema de disco microscopio confocal </td><td> Improvisación de PerkinElmer </td><td></td><td> Con láser de 491 nm </td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ-800 </td><td> Se adjunta a un brazo oscilante. Visión estéreo está disponible con grabación de vídeo </td></tr><tr><td> Gampi-papel washi </td><td> Haibara, Japón </td><td></td><td> Un tipo especial de papel tradicional japonés </td></tr><tr><td> CCD de la cámara </td><td> Imaging Source </td><td> DFK41AU02 </td><td> 1/2 &quot;1080 × 960 píxeles SONY CCD </td></tr><tr><td> Joystick manipulador </td><td> Narishige </td><td> MN-151 </td><td></td></tr><tr><td> Inyector </td><td> Narishige </td><td> IM-5B </td><td></td></tr></tbody></table>

simultaneous recording of calcium signals from identified neurons and feeding behavior of drosophila melanogaster

Para el estudio de redes neuronales en términos de su función en el comportamiento, debemos analizar cómo las neuronas funcionan cuando cada patrón de comportamiento se genera. Por lo tanto, las grabaciones simultáneas de la actividad neuronal y el comportamiento son esenciales para la actividad del cerebro se correlaciona con el comportamiento. Para este tipo de análisis de comportamiento, la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, nos permite incorporar genéticamente codificados indicadores de calcio, tales como GCaMP 1, para controlar la actividad neuronal, y utilizar sofisticadas técnicas de manipulación genética para la optogenética o termogenico que activen específicamente identificado las neuronas 2-5. El uso de una técnica termogenico, nos ha llevado a encontrar las neuronas esenciales para el comportamiento de alimentación (Flood et al., En revisión). Como parte principal de la conducta alimentaria, un adulto de Drosophila se extiende su probóscide para la alimentación de 6 (respuesta de trompa de extensión; PER), en respuesta a un estímulo dulce de las células sensoriales en su probóscide o tarso. Combining el protocolo para PER 7, con una técnica de imágenes de calcio 8 utilizando GCaMP3.0 1, 9, he establecido un sistema experimental, donde se puede monitorear la actividad de las neuronas en el centro de alimentación - el ganglio suboesophageal (SOG), simultáneamente con la observación del comportamiento de la probóscide. He diseñado un aparato (&quot;mosca del cerebro en vivo de imágenes y electrofisiología Etapa&quot;: &quot;Las moscas&quot;) para dar cabida a un adulto de Drosophila, lo que permite su probóscide para moverse libremente, mientras que su cerebro está expuesto al baño de Ca 2 + de imágenes a través de una lente de inmersión en el agua . Las moscas es también apropiado para muchos tipos de experimentos en directo en el cerebro de la mosca como el registro electrofisiológico o una imagen de lapso de tiempo de la morfología sináptica. Debido a que los resultados de las imágenes en directo puede estar directamente relacionado con el comportamiento POR simultánea, esta metodología puede proporcionar un excelente sistema experimental para estudiar el procesamiento de información de las redes neuronales, y cómo este cactividad ellular está acoplado a los procesos de plástico y la memoria.

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Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

La mosca de la fruta,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, Se extiende su probóscide para la alimentación, en respuesta a un estímulo de azúcar de su probóscide o tarso. Me han combinado observaciones de la respuesta de extensión probóscide (PER) con una técnica de imágenes de calcio, lo que nos permite monitorizar la actividad de las neuronas en el cerebro, a la vez con la observación del comportamiento.

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

simultaneous-recording-calcium-signals-from-identified-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

15.5K vistas.  University of Massachusetts Medical School. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, Se extiende su probóscide para la alimentación, en respuesta a un estímulo de azúcar de su probóscide o tarso. Me han combinado observaciones de la respuesta de extensión probóscide (PER) con una técnica de imágenes de calcio, lo que nos permite monitorizar la actividad de las neuronas en el cerebro, a la vez con la observación del comportamiento.

Video: Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

Intracelular de grabación, Sensorial Asignación de campos, y el cultivo de neuronas identificadas en el Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral cortex. We here share our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex using a method developed by Lima and colleagues1. Recordings are performed in mice expressing Channelrhodopsin-2 (ChR2) in specific neuronal subpopulations. Members of the population are identified by their response to a brief flash of blue light. This technique &#8211; termed &#8220;PINP&#8221;, or Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations &#8211; can be implemented with standard extracellular recording equipment. It can serve as an inexpensive and accessible alternative to calcium imaging or visually-guided patching, for the purpose of targeting extracellular recordings to genetically-identified cells. Here we provide a set of guidelines for optimizing the method in everyday practice. We refined our strategy specifically for targeting parvalbumin-positive (PV+) cells, but have found that it works for other interneuron types as well, such as somatostatin-expressing (SOM+) and calretinin-expressing (CR+) interneurons.

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Here we describe our strategy for obtaining stable, well-isolated single-unit recordings from identified inhibitory interneurons in the anesthetized mouse cortex. Neurons expressing ChR2 are identified by their response to blue light. The method uses standard extracellular recording equipment, and serves as an inexpensive alternative to calcium imaging or visually-guided patching.

Una guía para<em&gt; En vivo</em&gt; Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforado grabación de patch-clamp de ratón neuronas sensoriales olfativas en neuroepitelio Intacto: Análisis funcional de las neuronas que expresan un odorante del receptor Identificado

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...