Esta técnica facilita la observación en tiempo real de la actividad del calcio sináptico como parámetro fisiológico para los procesos celulares subyacentes al aprendizaje y la formación de la memoria en drosophila melanogaster. Al comparar las respuestas neuronales a los olores antes y después del entrenamiento asociativo, podemos dibujar correlaciones directas entre la actividad sináptica y la formación del rastro de memoria en moscas frutales individuales. Producir moscas de la fruta transgénicas en las que neuronas específicas de interés expresen un indicador de calcio genéticamente codificado crucen las moscas hembra-virgen y macho que llevan las construcciones deseadas GAL4 y UAS, y envejecen la progenie femenina hasta tres a seis días después de la eclosión.
Para preparar una mosca para la toma de imágenes, utilice fórceps finos para colocar una mosca anestesiada con hielo en una cámara de imágenes preparada a medida. Usando un microscopio de disección para colocar el tórax y las piernas en contacto con los cables eléctricos en la parte inferior de la cámara, y con la cabeza acostada. Fije la mosca en su lugar con cinta adhesiva transparente, y utilice una cuchilla de bisturí quirúrgico para cortar una ventana en la cinta alrededor de la cabeza, dejando la antena cubierta y sólo la parte anterior de la parte anterior del tórax expuesta.
Utilice un pasador de insecto sostenido por mandíbulas cóncava-convexas para rodear cuidadosamente los lados y la parte posterior de la cabeza con pegamento de curado de luz azul. Y utilice una lámpara LED de emisión de luz azul para ajustar el pegamento. Cuando el pegamento esté completamente establecido, borre cualquier pegamento residual sin endurecido de la superficie dorsal de la cabeza de la mosca y cubra la cutícula expuesta de la cabeza con una gota de la solución de Ringer.
Usando un cuchillo de puñalada de hoja muy fina, corta la cutícula a través de la parte posterior de la cabeza, comenzando en el ocelli y cortando cada lado medial a los ojos para formar una solapa de la cutícula que se puede arrancar fácilmente usando fórceps. Retire cualquier exceso de cutícula que pueda bloquear la región cerebral de interés y utilice fórceps finos para limpiar cuidadosamente la superficie dorsal de cualquier tráquea, teniendo cuidado de evitar la interrupción del tejido cerebral en sí. Retire y refresque la solución del Ringer según sea necesario para limpiar el área de los restos de tejido.
Y coloque una aguja de entrega de olores hipodérmicos aproximadamente a un centímetro de la cabeza de la mosca, teniendo cuidado de que no hay nada que pueda obstruir la entrega de olores a la antena. A continuación, conecte la cámara de imágenes al sistema de administración de olores a través de la aguja de administración de olores hipodérmicos. Y deje que la mosca 10 minutos para recuperarse de la anestesia y la cirugía.
Para la visualización de los indicadores de calcio basados en GFP, ajuste el láser de un microscopio multifotón equipado con un láser infrarrojo y un objetivo de inmersión de agua instalado en una mesa aislada de vibración a una longitud de onda de excitación de 920 nanómetros e instale un filtro de paso de banda GFP. Usando la perilla de ajuste Z del curso, escanee a través del eje Z del cerebro para localizar la región cerebral de interés. Utilice la función de recorte para centrar el escaneo solo en el área de interés, para minimizar el tiempo de escaneo.
Y gire la vista de escaneo de tal manera que la parte anterior de la cabeza esté mirando hacia abajo. A continuación, ajuste el tamaño del fotograma a 512 por 512 píxeles y seleccione la región que desea escanear. Teniendo en cuenta el tiempo de escaneo calculado para cada fotograma, para lograr una velocidad de fotogramas de al menos cuatro hercios.
Para la visualización transitoria de calcio evocada por olores, inicie un paquete macro preprogramado capaz de vincular el software de adquisición de imágenes y el programa de entrega de olores e inicie la medición en el software del microscopio durante 6,25 segundos para establecer un valor de referencia F0. En el sistema de suministro de olores, proporcione un estímulo de olor de 2,5 segundos indicado aquí por la iluminación de LOS LED provocados por la apertura y el cierre de válvulas de copa de olor específicas. Seguido de 12,5 segundos de grabación al final del desplazamiento del olor.
A continuación, repita la entrega para un segundo y tercer olor de la misma manera. Para realizar el acondicionamiento asociativo en esta configuración, utilice el sistema de administración de olores controlado por ordenador para presentar el estímulo acondicionado-más olor durante 60 segundos junto con 12 descargas eléctricas de 90 voltios. Después de una rotura de 60 segundos presentar el estímulo condicionado-menos-olor solo durante 60 segundos sin descarga eléctrica.
Mida de nuevo el olor posterior al entrenamiento evocó la transiencia del calcio repitiendo el protocolo de estimulación del olor previo al entrenamiento tres minutos después de finalizar la fase de entrenamiento. A continuación, guarde los archivos de imágenes en un formato adecuado para un análisis de imagen posterior. Aquí se pueden observar imágenes representativas de la neurona de salida del cuerpo de setas, adquiridas como se ha demostrado.
La expresión compartimentada específica del sensor dHomer-GCaMP3, que no se expresa en los compartimentos axonales de la neurona, demuestra una señal puntuada en el compartimiento dendrítico. Se pueden observar respuestas claras aunque de olor de menor amplitud en moscas que expresan dHomer-GCaMp3, en comparación con las moscas que expresan GCaMP6f citosólico. Aquí, los rastros representativos de calcio de una mosca individual demuestran variaciones en el nivel de ruido y amplitud que se pueden obtener entre preparaciones individuales.
Esta técnica ha abierto la posibilidad de visualizar a nivel subcelular, cómo se modulan las representaciones olfativas y cómo se forman las fases de memoria a través del acondicionamiento. Tales experimentos serán vitales para ampliar nuestra comprensión de las estructuras cerebrales complejas como el cuerpo de la seta, y para caracterizar cómo los recuerdos asociativos se almacenan a través de las poblaciones distribuidas de neuronas.
