Esta investigación fue apoyada por conceder R01NS062842 del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Institutos Nacionales de Salud (VVD) y por las subvenciones R21 NS064403 del Instituto Nacional de Desórdenes Neurológicos y Derrame Cerebral Instituto Nacional de Salud a través de la ARRA (VVD) y R21 EB006301 Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, Instituto Nacional de Salud (VVD).

Las secciones de la máquina molecular basado en la detección deben estar preparados, ya que su preparación requiere más tiempo que el montaje del dispositivo molecular. La construcción funciona bien con 5-6μm de espesor secciones cortadas de paraformaldehído-fijo, los bloques de tejido incluidos en parafina. Utilizar las marcas de diapositivas que conservan secciones, tales como ProbeOn Plus diapositivas cargado y precleaned (Fisher Scientific) o similar. Se recomienda en un primer momento con un tejido con un patrón bien conocido de los daños en el ADN que contiene DNasa I-II y se rompe DNasa tipo, como la dexametasona, tratados con la rata de apoptosis timo 13,14. 1. Preparación de las secciones <ol><li> Coloque las secciones en un rack de diapositivas y dewax en xileno durante 15 minutos, el traslado a un baño de xileno fresco durante 5 minutos. </li><li> Rehidratar al pasar por las concentraciones de etanol clasificado: 96% de etanol 2x5min, etanol al 80% - 5 minutos, el agua - 2x5 min. </li><li> Recopilación de la sección con Proteínase K. Use 100μL de una solución 50μg/mL por sección. Incubar 15 &#39;a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda. El tiempo puede necesitar un ajuste en función del tipo de tejido. Tejidos duros puede requerir más tiempo de digestión. Tiempos de 15-25 minutos se suelen utilizar. Digestión insuficiente puede resultar en la señal más débil. Overdigestion en los resultados por otra parte en la desaparición de la señal y la interrupción sección. </li><li> Enjuague con agua destilada para min 2x10. </li><li> Aplicar 100 L por parte del 2% de BSA para preblocking. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente (23 ° C). Durante este tiempo, montar la máquina molecular. </li></ol> 2. Máquinas de ensamblaje molecular Todos los reactivos se escalan para 25 l de volumen total, lo cual es suficiente para una detección simple en una sección de tamaño del tejido medio (10x10mm). El volumen puede ampliarse según sea necesario. <ol><li> Combine en un pequeño tubo de plástico en este orden: </li></ol><table border="1"><tbody> &lt;tr&gt; <td><ol><li> Agua bidestilada; </li><li> 15% de polietilenglicol-8000; </li><li> Solución de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, (es decir, regulares amortiguación T4 ADN ligasa); </li><li> 70 pmoles de oligonucleótido 1, </li><li> 215 pmoles (1,76 a 7,1 mg) VACC TOPO </li><li> 10 unidades de T4 ADN ligasa (500 U / mL) </li></ol></td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Mezclar suavemente con la pipeta. La construcción molecular casi instantáneamente auto-ensambla en esta solución y se puede utilizar de inmediato a temperatura ambiente (23 ° C). El aumento de la temperatura a 37 ° C bloquea la T4 ADN ligasa componente basado en el etiquetado. </li></ol> 3. Uso de máquinas moleculares en secciones de tejido de 5&#39;OH etiqueta de doble y 5&#39;PO4 roturas en el ADN <ol><li> Aspirar la solución preblocking y aplicar 25μL de la mezcla de reacción completa que contiene 70 pmoles de oligonucleótido 1, 53 a 215 pmoles (1,76 a 7,1 mg) VACCTOPO y 10 unidades de T4 ADN ligasa (500 U / ml) en solución de 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, y el 15% de polietilenglicol-8000. La misma secuencia de oligonucleótidos llevar una sola etiqueta FITC, oligonucleótidos 2, se puede utilizar en lugar de para la detección de un solo tipo de roturas en el ADN. En tal caso, omitir ligasa de la reacción de marcaje. También en esta situación una solución de 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 15% de PEG-8000 puede utilizarse en lugar de tampón T4 ADN ligasa. </li><li> Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda con un cubreobjetos de plástico. Protegerlo de la luz. Descenso de la temperatura a 16 ° C reduce la señal de la ligasa basado, el aumento de la temperatura a 37 º C elimina por completo la señal de la ligasa basado. Una inhibición parcial de la ligasa a veces ocurre en la mezcla de reacción, posiblemente debido a los contaminantes introducidos en los preparativos topoisomerasa. Por lo tanto, ya la incubación (2-4 horas) puede ser necesario especialmente cuando snúmeros ignificant de la ligasa de la etiqueta se rompe están presentes. Aunque ambos ligasa y las señales de topo se puede observar en esta etapa, en muchos casos la señal de la ligasa puede ser reforzada por una nueva aplicación de la mezcla de reacción sin VACC TOPO y doble etiquetado de oligonucleótidos, pero que contiene un oligonucleótido en forma de horquilla (oligonucleótidos 3) (35 mg / ml) y T4 ADN ligasa (250 U / mL). Para mejorar la señal de siga con el paso 3, para ver la reacción sin aumento vaya al Paso 5. </li><li> Quitar los cubreobjetos con cuidado la inmersión del desliza verticalmente en un frasco de Coplin con agua a temperatura ambiente. Aspirar el exceso de agua. </li><li> Mejorar la señal de la ligasa mediante la aplicación de 25 l de mezcla de reacción sin VACC TOPO y oligonucleótidos 1, pero que contienen oligonucleótidos 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl 2, 0,1 mM ditioeritritol, 1 mM ATP, y el 15% de glicol de polietileno 8000, 5 unidades de T4 ADN ligasa, 35 mg / mL de oligonucleótidos 3 (horquilla romos). El volumen total de la solución de etiquetado can ser ampliado para dar cabida a las secciones más grandes. Incubar durante 18 horas (overnight) a temperatura ambiente (23 ° C) en una cámara húmeda con un cubreobjetos de plástico. </li><li> Quitar los cubreobjetos con cuidado la inmersión del desliza verticalmente en un frasco Coplin con agua a temperatura ambiente. Lavar la sección de 3x10 minutos en agua destilada. </li><li> Enjuague con tampón de bicarbonato de sodio. Solución alcalina de enjuague mejora FITC fluorescencia, que es sensible al pH y se reduce significativamente por debajo de pH 7. </li><li> Cubierta de la sección con una solución antifading (Vectashield con DAPI), cubreobjetos y analizar la señal utilizando un microscopio de fluorescencia. De doble hebra de ADN se rompe con 5&#39;OH presenta fluorescencia verde, 5&#39;PO 4 se rompe - se presentan fluorescencia roja (Figura 2). </li></ol> 4. Resultados representante <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig2.jpg" /> Figura 1. Semi-artificial de la máquina molecular detecta dos tipos deDaños en el ADN in situ. La máquina fluorescente cuando se auto-ensambla VACC TOPO se une a la horquilla de doble-32-mer. La máquina empieza a funcionar por sí mismo la división en dos unidades de detector a través de la topoisomerasa-se corta en el extremo 3 &#39;de la secuencia de reconocimiento. Esto se traduce en un proceso cíclico en el cual la unidad marcada con FITC separa continuamente y religates de nuevo a la rodamina marcado con la unidad. Esto continúa hasta que una rotura del ADN detectable se encuentra. Cuando tal aceptor alternativo (5&#39;OH ruptura contundente ADN final) está presente en la sección de tejido, la parte FITC ligará a él. La parte restante de rodamina se adhieren a 5 &#39;PO 4 rompe extremo romo de ADN con la ayuda de T4 ADN ligasa. En consecuencia, ambos tipos de roturas en el ADN son a la vez detectado. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3628/3628fig1.jpg" /> Figura 2. Etiquetas moleculares de la máquina de doble dos tipos de roturas en el ADNen una sección de tejido de dexametasona tratados con el timo. Romos roturas en el ADN de DNasa I y II DNasa tipo se detectan en las áreas corticales del timo en la apoptosis. Fluorescencia verde frente al citoplasma (5&#39;OH roturas en el ADN) marca macrófagos cortical digerir los materiales nucleares de los timocitos apoptóticos. Esta señal es producida por VACC TOPO, y se localiza en fagolisosomas con el ADN que contiene 5&#39;OH doble filamento se rompe 11,12. Fluorescencia roja (5&#39;PO cuatro descansos) los núcleos de las etiquetas de los timocitos apoptóticos no devorados por los macrófagos. Enorme número de timocitos al mismo tiempo la apoptosis acompañada por la generación de 5&#39;PO 4 de doble cadena se rompe, visualizado por la ligasa basado en el etiquetado. Estos descansos se encuentran en la periferia nuclear, la formación de patrones en forma de anillo. Todos los núcleos celulares son visualizados por la contratinción con DAPI (azul fluorescente).

<ol>
	<li>Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).</li><li>Schuldt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Pol+expeditions.">Dynamic Pol expeditions.</a> Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).</li><li>Urry, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+machines:+how+motion+and+other+functions+of+living+organisms+can+result+from+reversible+chemical+changes.">Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).</li><li>Schneider, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+of+molecular+machines+I.+Channel+capacity+of+molecular+machines.">Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines.</a> J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).</li><li>McClare, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+machines,+Maxwell's+demon+and+living+organisms.">Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms.</a> J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).</li><li>Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome+as+a+molecular+machine.">Ribosome as a molecular machine.</a> FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).</li><li>Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+molecular+machines:+pH-induced+intramolecular+motions+in+a+fluorescent+nickel(II)+scorpionate+complex.">Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex.</a> Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).</li><li>Drexler, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , (1992).</li><li>Freitas, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nanomedicine: basic capabilities. , (1999).</li><li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+probes+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+(FRET):+designs+and+applications.">DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications.</a> BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).</li><li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+probes+detecting+the+phagocytic+phase+of+apoptosis:+enzyme-substrate+complexes+of+topoisomerase+and+DNA.">Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA.</a> Molecules. 16, 4599-4614 (2011).</li><li>Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-artificial+fluorescent+molecular+machine+for+DNA+damage+detection.">Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection.</a> Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).</li><li>Didenko, V. V., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presence+of+double-strand+breaks+with+single-base+3'+overhangs+in+cells+undergoing+apoptosis+but+not+necrosis.">Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis.</a> J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).</li><li>Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotin-labeled+hairpin+oligonucleotides.+Probes+to+detect+double-strand+breaks+in+DNA+in+apoptotic+cells.">Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells.</a> Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).</li><li>Jones, R. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Soft Machines: Nanotechnology and life. , (2007).</li><li>Samejima, K., Earnshaw, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trashing+the+genome:+Role+of+nucleases+during+apoptosis.">Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este video, que muestra cómo montar y utilizar un doble marcaje de ADN sensor de daño. El sensor es una máquina molecular impulsado por bio-molecular del motor, un virus-proteína codificada TOPO VACC vinculados con componentes artificiales. El desarrollo presenta un ejemplo de un enfoque bio-permitió que aboga por la adaptación de las estructuras biológicas, arquitecturas y piezas reales y los componentes de las células en el diseño de productos no tóxicos dispositivos a escala molecular 12,15. E...

<ol><li> Xileno </li><li> 80 y 96% de etanol. </li><li> 2% de solución de albúmina de suero bovino (BSA) en agua destilada. </li><li> Oligonucleótido 1: una horquilla doble, doble etiquetado con fluoresceína y tetrametilrodamina: </li></ol> 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA CCC GGT TTA ACG CAT I EN GCG TT-3 &#39;; F - FITC-dT; R - tetrametilrodamina-dT. Otros desplazada hacia el rojo fluoróforos como BODIPY TR, rodamina o TAMRA se puede utilizar en lugar de tetrametilrodamina como R. Alternativamente, puede utilizar oligonucleótidos 2 -. Un solo doble horquilla marcada con fluoresceína (para la detección de un solo tipo de roturas en el ADN (ADNasa II-único tipo) La sonda de un solo fluoróforo de carga es considerablemente menos costoso y es conveniente siempre que sea una sola tipo de rotura de ADN a etiquetar: 5&#39;-AAG GGA CCT GC F GCA CCC GGT TTA ACG CAT ATG CGT T-3 &#39;; F - FITC-dT </p&gt; <ol start="5"><li> Oligonucleótidos 3. Romos rodamina marcado con horquilla para la mejora de la señal ligadura situ con ADN ligasa T4: 5&#39;-GCG CTA GAC C R G GTC CGC TAG-3 &#39;, R - tetrametilrodamina-dT </li><li> Vaccinia DNA topoisomerasa l (VACC TOPO) - 3000 U / l (Tecnologías de Vivid). En los experimentos iniciales se utilizaron 215 pmoles (7,1 mg) de la TOPO VACC por cada l 25 de la mezcla de reacción. Sin embargo, la concentración de la topoisomerasa puede reducirse significativamente sin la pérdida de sensibilidad. Más tarde utilizó una cantidad cuatro veces menor de VACC TOPO por sección (1,76 g en 25 l de la mezcla de reacción por sección), con resultados similares. La reducción de la cantidad de la enzima a 880 ng (en 25 l de la mezcla de reacción) dio lugar a una señal más débil y 8,8 ng de VACC TOPO producido ninguna señal detectable. </li><li> ADN ligasa de T4 5 U / l (Roche). Esta preparación ligasa altamente concentrada ofrece la mejor señal en nuestras condiciones experimentales. </li&gt; <li> 10 x tampón de reacción de ADN ligasa T4: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl 2, 10 ditioeritritol mM, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP en tampón de reacción se destruye con facilidad en los ciclos repetitivos de descongelación-congelación. Alícuota del buffer en pequeñas porciones de 15-20 l y almacenar a - 20 ° C. Use una vez. </li><li> 30% (w / v) de PEG-8000 (Sigma) en agua bidestilada. 15% de PEG-8000 en la mezcla de reacción que estimula fuertemente la detección, el aumento de las concentraciones efectivas de sus componentes por la exclusión de volumen. </li><li> Proteinasa K (Roche) 20 mg / ml de la solución madre en agua destilada. Conservar a - 20 ° C. En la solución se aplica una reacción 50mg/ml en PBS, preparado a partir de las acciones. No vuelva a usar. </li><li> Vectashield con DAPI (Vector Laboratories). </li><li> Bicarbonato de sodio: 50 M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2. </li><li> Vidrio 22x22mm o 22x40mm o cubreobjetos de plástico. Cubreobjetos de plástico son preferibles durante la reacción, ya que unare fácil de quitar de la sección. </li></ol>

in vitro assembly of semi-artificial molecular machine and its use for detection of dna damage

De origen natural bio-molecular máquinas trabajan en todas las células vivas y mostrar una gran variedad de diseños 1-6. Sin embargo, el desarrollo de máquinas moleculares artificiales centros de dispositivos con capacidad de movimiento direccional, es decir, los motores moleculares, y en su reducida partes mecánicas (ruedas, ejes, etc colgantes) 7-9. Esto imita las máquinas macro-, a pesar de que las propiedades físicas esenciales para estos dispositivos, como la inercia y la conservación del momento, no se pueden usar en los entornos nanomundo 10. Diseños alternativos, que no siguen los esquemas mecánicos macromachines y utilizar los mecanismos desarrollados en la evolución de las moléculas biológicas, pueden tomar ventaja de las condiciones específicas del nanomundo. Además, la adaptación real de las moléculas biológicas con fines de nano-diseño reduce los peligros potenciales de los productos la nanotecnología puede plantear. Aquí se demuestra el montaje y la aplicación de uno de estos bio-permitió construir, comoemi-artificial dispositivo molecular que combina una máquina molecular de origen natural con componentes artificiales. Desde el punto de vista de la enzimología, nuestra construcción es un diseñador fluorescentes complejo enzima-sustrato juntos para realizar una función útil específica. Este conjunto es, por definición, una máquina molecular, ya que contiene un 12. Sin embargo, su integración con la parte de ingeniería - horquilla de doble fluorescente - que re-dirige a una nueva tarea de etiquetado daño en el ADN 12. Nuestra construcción ensambla de un ADN de 32-mer y una enzima topoisomerasa I vaccinia (VACC TOPO). La máquina usa su propio material para la fabricación de dos unidades de la etiqueta fluorescente detector (Figura 1). Una de las unidades (fluorescencia verde) lleva VACC TOPO covalentemente a su extremo 3 &#39;y la otra unidad (fluorescencia roja) es una horquilla libre con un 3&#39;OH terminal. Las unidades son de corta duración y rápidamente montamos de nuevo en la construcción original, que posteriormente recleaves.En la ausencia de ADN se rompe estas dos unidades separadas y religate continuamente de una manera cíclica. En secciones de tejido con daño en el ADN, el detector de la topoisomerasa-llevar selectivamente se une a roturas en el ADN de extremos romos con 5&#39;OH (DNasa II-tipo se rompe) 11,12, con fluorescencia que el etiquetado. El segundo, sin enzimas horquilla formada después de la escisión de oligonucleótidos, se ligan a un 5&#39;PO 4 romos break (DNasa I-tipo se rompe) 11,12, si la ADN ligasa de T4 está presente en la solución de 13,14. Cuando la ADN ligasa de T4 se añade a una sección de tejido o una solución que contiene ADN con 5&#39;PO cuatro extremos romos se rompe, la ligasa reacciona con 5&#39;PO cuatro extremos de ADN, formando semi-estable enzima ADN complejos. Las horquillas romos va a interactuar con estos complejos de la liberación de ganchos para el cabello ligasa y la vinculación covalente al ADN, por lo que el etiquetado 5&#39;PO 4 romos roturas en el ADN. Este desarrollo es un ejemplo de un nuevo enfoque práctico ªdiseño e de máquinas moleculares y ofrece un sensor de útiles para la detección de la apoptosis y el daño del ADN en las células y los tejidos fijos.

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage at JoVE.com

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Demostramos la asamblea y la aplicación de un dispositivo a escala molecular, alimentado por una proteína de la topoisomerasa. La construcción es un sensor bio-molecular que las etiquetas de dos grandes tipos de ADN se rompe en secciones de tejido uniendo dos fluoróforos diferentes a sus fines.

En la Asamblea in vitro de la semi-artificial de la máquina molecular y su utilización para la detección del daño del ADN

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

in-vitro-assembly-semi-artificial-molecular-machine-its-use-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

11.5K vistas.  Baylor College of Medicine. Demostramos la asamblea y la aplicación de un dispositivo a escala molecular, alimentado por una proteína de la topoisomerasa. La construcción es un sensor bio-molecular que las etiquetas de dos grandes tipos de ADN se rompe en secciones de tejido uniendo dos fluoróforos diferentes a sus fines.

Video: In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

Fabricación de ADN electroquímico biosensores para la detección Reagentless de ácidos nucleicos, proteínas y moléculas pequeñas

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

Investigación

Bioingeniería

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Un gran procesamiento Plataforma 96-Bueno, para medir el daño del ADN en las células en micromatriz Humanos

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Síntesis de cationizada Magnetoferritin para la magnetización ultra-rápido de las células

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

Construcción y uso de una cámara de estimulación eléctrica para mejorar la diferenciación osteogénica de células madre mesenquimales, estromales In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically been studied in vivo in animal models showing characteristic patterns of cell migration. However, in vivo models have several limitations, including intercellular mediators that are difficult to access and analyze, as well as the inability to directly analyze human neutrophils. Because of these limitations, there is a need for an in vitro platform that studies swarming with human neutrophils and provides easy access to the molecular signals generated during swarming. Here, a multistep microstamping process is used to generate a bioparticle microarray that stimulates swarming by mimicking an in vivo infection. The bioparticle microarray induces neutrophils to swarm in a controlled and stable manner. On the microarray, neutrophils increase in speed and form stable swarms around bioparticle clusters. Additionally, supernatant generated by the neutrophils was analyzed and 16 proteins were discovered to have been differentially expressed over the course of swarming. This in vitro swarming platform facilitates direct analysis of neutrophil migration and protein release in a reproducible, spatially controlled manner.

This protocol generates bioparticle microarrays that provide spatially controlled neutrophil swarming. It provides easy access to the mediators that neutrophils release during migration and allows for quantitative imaging analysis.

Microarrays de biopartículas para el análisis quimiotáctico y molecular del enjambre de neutrófilos humanos in vitro

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells

Efficient intracellular delivery of biomolecules is required for a broad range of biomedical research and cell-based therapeutic applications. Ultrasound-mediated sonoporation is an emerging technique for rapid intracellular delivery of biomolecules. Sonoporation occurs when cavitation of gas-filled microbubbles forms transient pores in nearby cell membranes, which enables rapid uptake of biomolecules from the surrounding fluid. Current techniques for in vitro sonoporation of cells in suspension are limited by slow throughput, variability in the ultrasound exposure conditions for each cell, and high cost. To address these limitations, a low-cost acoustofluidic device has been developed which integrates an ultrasound transducer in a PDMS-based fluidic device to induce consistent sonoporation of cells as they flow through the channels in combination with ultrasound contrast agents. The device is fabricated using standard photolithography techniques to produce the PDMS-based fluidic chip. An ultrasound piezo disk transducer is attached to the device and driven by a microcontroller. The assembly can be integrated inside a 3D-printed case for added protection. Cells and microbubbles are pushed through the device using a syringe pump or a peristaltic pump connected to PVC tubing. Enhanced delivery of biomolecules to human T cells and lung cancer cells is demonstrated with this acoustofluidic system. Compared to bulk treatment approaches, this acoustofluidic system increases throughput and reduces variability, which can improve cell processing methods for biomedical research applications and manufacturing of cell-based therapeutics.

This protocol describes the assembly and operation of a low-cost acoustofluidic device for rapid molecular delivery to cells via sonoporation induced by ultrasound contrast agents.