Esta investigación fue parcialmente financiada por el programa Global del centro de desarrollo de investigación a través de la Fundación de investigación nacional de Korea(NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y TIC (MSIT) (2015K1A4A3047345) y Nano· Programa de desarrollo de tecnología de materiales a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y TIC (MSIT) (2012M3A7A9671610). El Instituto de investigación de ingeniería en la Universidad Nacional de Seúl proporcionó instalaciones de investigación para este trabajo. Los autores reconocen con gratitud hacia Yoon Tae-Young (ciencias biológicas, Universidad Nacional de Seúl) en cuanto a la espectroscopia de fluorescencia para el análisis de traste.

1. diseño de 6 por 6 estante de acordeón de ADN con caDNAno14
<ol><li>Descargar e instalar caDNAno 2.0 software14 para el diseño de un rack de acordeón de ADN (caDNAno 2.5 también está disponible en https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Abrir caDNAno14 y haga clic en la Herramienta de cuadrado para añadir una nueva pieza con un enrejado de cuadrados.</li>
	<li>Número de cada viga de la parrilla de acordeón y dibujar en el panel izquierdo del enrejado del caDNAno14 (figura 2).</li>
	<li>Haga clic en la herramienta lápiz y dibujar cada haz en el panel derecho modificar el caDNAno14. Rotura de vigas cada 32 bp, que está para las uniones entre vigas adyacentes. Colocar grapas cruces en la misma posición de las articulaciones. Utilice la Herramienta lápiz y la Herramienta insertar en caDNAno14 a las articulaciones adicionales monocatenario crossovers.</li>
	<li>Haga clic en la Herramienta lápiz y conecte las articulaciones. Cada rayo tiene siete articulaciones.</li>
	<li>Generar cruces de andamio para combinar los andamios en el circuito simple utilizando el andamio previamente divulgado enrutamiento algoritmo11. No deje que el dominio obligatorio mínimo entre los filamentos de andamio y grapa de menos de 8 bp (figura 3).</li>
	<li>Colocar los andamios que no se utilizan en la Asamblea en los vértices situados en lados opuestos de la rejilla del acordeón, como se muestra en la figura 3.</li>
	<li>Haga clic en la herramienta de la rotura. Romper las cadenas donde hebras discontinuas son circulares o más de 60 bp.</li>
	<li>Diseño de los cerradura filamentos de la DNA.<ol>
<li>Haga clic en la herramienta de la rotura. Rotura 8 bp de una región de ADN básica para hacer una parte adhesiva y eliminar 8 bp de una región de ADN básica. Hay 18 partes pegajosas (figura 1) en el estante de acordeón de 6 por 6.</li>
		<li>Colocar secuencias inversas complementario a las partes pegajosas en ambos extremos de los hilos de la cerradura y conectarlos por una región puente, que consiste en filamentos de polietileno T de la longitud deseada (figura 1B).</li>
		<li>Para la reconfiguración, añadir 8 bp de las secuencias de punto de apoyo en el extremo de la DNA de cerraduras para el desplazamiento del filamento. La secuencia del punto de apoyo utilizada es en la tabla 2.</li>
		<li>Preparación de hilos de poli A que son inversa complementaria a la región de puente.</li>
		<li>Filamentos de diseño que son inversa complementaria a las cerraduras de la DNA para el experimento de reconfiguración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haga clic en la Herramienta de secuencia y haga clic en ADN de andamio. Elegir el andamio estándar M13mp18. Haga clic en la Herramienta de exportar y guardar secuencia en formato csv (tabla 1).</li>
</ol>2. simular la estructura con el oxDNA
<ol><li>Descargar e instalar el oxDNA16,17. El último código fuente está disponible en https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.</li>
	<li>Hacer a partir los archivos de configuración desde el archivo14 de caDNAno usando python script 'cadnano_interface.py', que se proporciona en el paquete de17 oxDNA16,. El uso es el siguiente: 'cadnano_interface.py python cadnano_file.json sq'. Ahora se generan la topología archivo y el archivo de configuración. Nota: El archivo de topología incluye cuántas hebras y nucleótidos en la estructura e información sobre bonos de la columna vertebral-columna vertebral entre los nucleótidos. El archivo de configuración incluye información general como rebotes, energía y tamaño de la caja. Información de orientación como el vector posición, vector de la base de la columna vertebral, vector normal, velocidad y velocidad angular de nucleótidos también está incluido (figura 4).</li>
	<li>Cambiar la información en el archivo de configuración y topología de los caDNAno14 para reflejar la información estructural verdadera de la rejilla de acordeón. Los haces están dispuestos en paralelo cuando se visualizan los archivos de configuración y topología de caDNAno14 . Sin embargo, el acordeón rack es una estructura de enrejado por lo que la distancia entre los nucleótidos de servidumbre son ahora para la simulación (figura 5).<ol>
<li>Gire y mueva cada viga a la estructura deseada. Las nueve columnas de la izquierda en el archivo de configuración están el vector posición, vector de la base de la columna vertebral y vector normal (figura 4). Para girar de un rayo, rotar de posición, vectores base de la columna vertebral y normales usando transformación de rotación. Luego mover una viga cambiando el vector de posición para ubicar como se muestra en la figura 5.</li>
		<li>Relajar la estructura usando el script en el paquete de oxDNA (ver ejemplo en $oxDNA/ejemplos/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION para más información).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar simulación de dinámica molecular para pasos 10 millones mediante el archivo de configuración relajada. El uso es como sigue: '. / oxDNA < input >' guardar los datos cada 5000 o 10000 pasos.</li>
	<li>Visualización Nota: Las estructuras se visualizaron mediante cogli.<ol>
<li>Descargar e instalar la última versión de la cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).</li>
		<li>Ejecute la cogli con los archivos de configuración y topología de la simulación de oxDNA. El uso es como sigue: '. / cogli1 -t < archivo topología >< archivo de configuración >'.</li>
		<li>Esconder la caja pulsando b.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. síntesis de la estructura
Nota: El método de síntesis está adaptado desde el anterior protocolo15,18.
<ol><li>Comprar las grapas de ADN diseñadas de un proveedor de oligonucleótidos.</li>
	<li>Ajustar la concentración de estas grapas de ADN a 100 μM con agua libre de nucleasa.<ol>
<li>Cada filamento de la DNA que constituye una estructura de 'estado libre' en un tubo de la piscina y ajustar la concentración a 2 μM de cada filamento.</li>
		<li>Piscina DNA filamentos de longitud y número de sitios de bloqueo en los tubos y ajustar la concentración a 2 μM de cada filamento. 18, 9 y 4 sitios de bloqueo se utilizan. Añadir hebras de A poli que son complementarias a la región de puente en la misma concentración.</li>
		<li>Filamentos de la piscina que son inversa complementaria al ADN cerradura filamentos de longitud en los tubos y ajustan la concentración a 2 μM de cada filamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar solución de MgCl2 de 300 nM mezclando 70 μL de agua libre de nucleasas y 30 μL de la solución de2 1 μM MgCl. Preparar un 5 x solución de Tris EDTA mezclando 95 μL de agua libre de nucleasas y 5 μL de la solución de Tris EDTA 100 x.</li>
	<li>Añadir 2 μL de la grapa ADN, 1.1 μL de solución de MgCl2 , 2 μL de solución de EDTA Tris, 7,6 μL de agua libre de nucleasas y 7.3 μL de DNA de andamio, de los cuales la concentración es de 110 nM a hacer 20 μL de acción mixta. Establecer la concentración final del andamio ADN a 40 nM, grapa ADN a 200 nM, MgCl2 a 16 mM y Tris EDTA solución 0,5 x.</li>
	<li>Rápidamente calentar la solución mixta en un termociclador a 80 ° C y enfriar a 60 ° C a razón de min 4 ° C y enfriar de 60 º C a 4 ° C a una velocidad de 40 min por ° C.</li>
</ol>4. purificación de la estructura
Nota: Las muestras de todas las estructuras se purificaron antes del análisis. En esta sección, describimos el protocolo de purificación PEG, que es una adaptación de la literatura anterior19. La muestra también puede ser purificada por electroforesis en gel como se describe en la literatura anterior15,18.
<ol><li>Preparar 5 M de NaCl y 100 x Tris-EDTA.</li>
	<li>Preparar precipitación-buffer mezclando 150 μL de PEG 8000, 500 μL de 100 x Tris EDTA y 101 μL de 5 M NaCl y 249 μL de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Preparar el búfer de destino mezclando 5.5 μL de solución 300 nM MgCl2 sección 3.3, 10 μL de solución de EDTA Tris x 5 de la sección 3.3 y 84,5 μL de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Mezcla 20 μL de la estructura sintetizada de la sección 3 y 20 μL de tampón de precipitación de la sección 4.2. Luego girar la acción mixta a 16000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante y disolver el pellet en el buffer de destino de la sección 4.3.</li>
</ol>5. reconfiguración del acordeón Rack de un «estado libre» a un 'estado bloqueado'
<ol><li>Sintetizar la estructura sin candados de ADN para el experimento de configuración.</li>
	<li>Preparar ADN cerradura filamentos de sección 3.</li>
	<li>Añadir 2 μL de ADN cerradura de manera de la longitud deseada en 20 μL de la estructura sintetizada. Concentración de filamentos de la cerradura de DNA es cinco veces mayor que la estructura.</li>
	<li>Incubar la muestra de 0, 10, 25, 50 o 100 minutos para ver cómo rápida reconfiguración.<ol>
<li>Para la incubación de 100 minutos, incubar la muestra a 50 ° C durante 30 minutos y poco a poco enfriar hasta 25 ° C a una tasa de 0,33 ° C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 50 minutos, incubar la muestra a 50 ° C durante 15 minutos y enfriar lentamente hasta 25 ° C a una velocidad de 0,66 º C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 25 minutos, incubar la muestra a 50 ° C 7.5 minutos y poco a poco enfriar hasta 25 ° C a una velocidad de 1,32 ° C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 10 minutos, incubar la muestra a 50 ° C durante 3 minutos y enfriar lentamente hasta 25 ° C a una velocidad de 3,3 ° C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 0 minutos, guardar muestra a la derecha de 4 ° C después se agregan hebras de ADN cerraduras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Justo después del paso de atadura, enfriar rápidamente la muestra a 4 ° C para evitar la desnaturalización no deseada.</li>
</ol>6. reconfiguración del Rack acordeón de un 'estado bloqueado' a un 'estado libre'
<ol><li>Sintetizar la estructura con las cerraduras del ADN de la longitud deseada para el experimento de configuración.</li>
	<li>Preparar el inversos complementarios filamentos de sección 3.</li>
	<li>Añadir 2 μL de filamentos que son inversa complementaria a los hilos de la cerradura de la longitud deseada en 20 μL de la estructura sintetizada. Concentración de filamentos de la cerradura de DNA es cinco veces mayor que la estructura.</li>
	<li>Incubar la muestra de 0, 12, 60, 120, 240 minutos para ver cómo rápida reconfiguración.<ol>
<li>Para el 12, 60, 120, incubación de 240 minutos, calentar rápidamente la muestra a 40 ° C y enfriar lentamente hasta 20 ° C durante el tiempo correspondiente a cada uno. Justo después del paso de desprendimiento, enfriar rápidamente la muestra a 4 ° C para evitar la desnaturalización no deseada.</li>
		<li>Para la incubación de 0 minutos, guardar muestra a la derecha de 4 ° C después de reversas hebras complementarias se agregan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. proyección de imagen de TEM
Nota: Protocolo imagen TEM es una adaptación de la anterior literatura18,20.
<ol><li>Preparar solución de NaOH de 1.25 M mezclando 87.5 μL de agua libre de nucleasas y 12,5 μL de solución de NaOH de 10 M.</li>
	<li>Añadir 1 μL de solución de NaOH de 1.25 M a 50 μL de la solución de formato de uranilo 2%.</li>
	<li>Vórtice de la solución durante 3 minutos y centrifugar a velocidad máxima durante 3 minutos. Depósito 3 μL de la muestra purificada en la rejilla TEM resplandor-descargado durante 3 minutos y lavar rápidamente con papel de filtro.</li>
	<li>Depósito 7 μL de solución de formato de uranilo preparado durante 30 segundos y Lave rápidamente con papel de filtro.</li>
	<li>Medir la longitud y el ángulo de la estructura de acordeón reflejada por TEM.</li>
</ol>8. análisis del traste
<ol><li>Utilizar Atto 550 y Atto 647N tinte, para que la distancia de Förster es 6.5 nm. Vuelva a colocar 58 grapa y grapa 117 en la tabla 1 con fluorescencia con filamentos. Entonces sintetizar la estructura con fluorescencia con hilos por el método descrito en la sección 3.</li>
	<li>Medir la concentración de la muestra purificada.</li>
	<li>Normalizar la muestra a 10 nM y carga 50 μL para las microplacas de 384 bien.</li>
	<li>Excitar la muestra con tintes donador y aceptor en 550 nm y medir el espectro de fluorescencia de 570 nm y 800 nm con un fluorómetro.</li>
	<li>Medir el espectro de fluorescencia de la muestra sólo donante de la misma manera.</li>
	<li>Excitar los tintes de la muestra de 650 nm y el espectro de fluorescencia y medida de 670 nm y 800 nm. Esto es para medir la concentración del aceptador.</li>
	<li>Obtener las desviaciones estándar, repitiendo el mismo experimento con muestras de tres, que se sintetizan y purificados por separado.</li>
	<li>Calcular la eficiencia de traste con la relación entre un método descrito por la ecuación a continuación21. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: intensidad de la fluorescencia de pico del aceptador de la muestra con donador y aceptor en excitación nm 550. D550: intensidad de la fluorescencia en el rango de emisión del aceptador de la donante sólo muestra excitación nm 550. DA650: intensidad de la fluorescencia de pico del aceptador de la muestra con donador y aceptor en excitación nm 650.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Andersen, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembly+of+a+nanoscale+DNA+box+with+a+controllable+lid.">Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid.</a> Nature. 459 (7243), 73-76 (2009).</li><li>Cha, T. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+principles+of+DNA+enzyme+based+walkers:+Translocation+kinetics+and+photo-regulation.">Design principles of DNA enzyme based walkers: Translocation kinetics and photo-regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (29), 9429-9437 (2015).</li><li>Gerling, T., Wagenbauer, K. F., Neuner, A. 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Los autores no tienen nada que revelar

Este Protocolo introduce todo el proceso de diseño, simulación, síntesis y análisis de la rejilla acordeón de ADN 2D básica. El diseño modificado y las reglas de la simulación se han descrito porque la regla del diseño de origami de ADN estándar, difiere en cuanto a la rejilla de acordeón de ADN tiene nucleótidos adicionales en los crossovers para flexibilidad14,15. De esta forma, esperamos que el protocolo puede acelerar varias investigaciones utiliz...

Sistemas mecánicos basados en nanoestructuras de ADN o DNA nanomáquinas en1,2,3,4,5 son únicos ya que producen movimiento de nanoescala complejas en 2D y 3D en el nanómetro a Ångström resolución, según varias biomoléculas estímulos2,3,6. Colocando materiales funcionales de estas estructuras y control de sus posiciones, estas estructuras pueden aplicarse a varias áreas. Por ejemplo, nanomáquinas de ADN se han propuesto para un reactor molecular7drogas entrega8y nanoplasmonic sistemas9,10.
Anteriormente, hemos introducido la rejilla acordeón del ADN reconfigurable, que puede manipular una red de nanoescala 2D o 3D de elementos11 (figura 1A). A diferencia de otros ADN nanomáquinas que sólo controlan una serie de elementos, la plataforma puede manipular colectivamente periódicamente vestida de elementos 2D o 3D en diferentes etapas. Anticipamos que una red de reacción química y biológica programable o un sistema de computación molecular se puede construir de nuestro sistema, aumentando el número de elementos controlables. La parrilla de acordeón de ADN es una estructura, en que la red de múltiples vigas de ADN está conectada a las articulaciones compuestas de ADN (figura 1B). Se reconfigura el acordeón rack generado por las vigas de ADN por las cerraduras de la DNA, que hibridan a la parte pegajosa de vigas y cambian el ángulo entre los rayos según la longitud de la parte puente de las esclusas (estado bloqueado). Además, multi-step reconfiguración se demuestra mediante la adición de nuevas cerraduras después de la formación del estado libre por desmontar cerraduras de ADN a través de la cadena basada en el punto de apoyo desplazamiento12,13.
En este protocolo se describe todo el proceso de diseño y síntesis de la rejilla acordeón reconfigurable de ADN. El protocolo incluye el diseño, simulación, wet-lab experimentos y análisis para la síntesis del ADN acordeón de 6 por 6 mallas y una reconfiguración de estos. La estructura de cubierta en el protocolo es el modelo básico de la investigación anterior11 y 65 nm por 65 nanómetro de tamaño, que consta de 14 vigas. En términos de diseño y simulación, el diseño estructural del soporte acordeón es diferente de ADN convencional14,de origami de la15 (es decir, firmemente embalado). Por lo tanto, se han modificado las reglas de diseño y simulación molecular de los métodos tradicionales. Para demostrar, mostramos la técnica de diseño utilizando el enfoque modificado de caDNAno14 y la simulación de la rejilla de acordeón con oxDNA16,17 de scripts adicionales. Por último, se describen ambos protocolos de TEM y traste para análisis de estructuras de rack acordeón configurado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>M13mp18 Single-stranded DNA</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N4040s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2 Solution</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>M2001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>T2142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5M Sodium Chloride solution</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>s2007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10N NaOH</td>
			<td>Biosesang</td>
			<td>S2038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl formate</td>
			<td>Thomas Science</td>
			<td>C993L42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal cycler C1000</td>
			<td>Biorad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodropic 2000</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM (LIBRA 120)&#160;&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer Enspire 2300</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Labogene</td>
			<td>LZ-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

Sistemas mecánicos basados en nanoestructuras de ADN o DNA nanomáquinas, que producen el movimiento de nanoescala complejas en 2D y 3D en el nanómetro a ångström resolución, muestran gran potencial en diversos campos de la nanotecnología como los reactores moleculares, administración de fármacos, y sistemas de nanoplasmonic. El rack acordeón ADN reconfigurable, que colectivamente se puede manipular una red de nanoescala 2D o 3D de elementos, en múltiples etapas en respuesta a las entradas de ADN, se describe. La plataforma tiene potencial para aumentar el número de elementos que pueden controlar nanomáquinas de ADN de algunos elementos a una escala de red con múltiples etapas de reconfiguración.
En este protocolo se describe todo el proceso experimental de la rejilla de acordeón ADN reconfigurable de mallas de 6 por 6. El protocolo incluye un procedimiento de regla y simulación de diseño de las estructuras y un experimento de wet-lab para la síntesis y reconfiguración. Además, el análisis de la estructura utilizando met (microscopía electrónica de transmisión) y traste (transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia) está incluido en el protocolo. Los nuevos métodos de diseño y simulación en este protocolo ayudará a los investigadores utilizar el canasto de acordeón de ADN para más aplicaciones.

La parrilla acordeón 6 diseñado por 6 ADN es simulada de la oxDNA16,17 y los resultados se muestran en la figura 6. El resultado de la simulación, se confirmó que la estructura prevista está formada sin distorsión de la estructura.
Las imágenes TEM en la figura 7 son de estructuras configuradas con una lo...

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Describimos el protocolo detallado para el diseño, simulación, wet-lab experimentos y análisis para un rack de acordeón ADN reconfigurable de mallas de 6 por 6.

Diseño y síntesis de un ADN Reconfigurable acordeón Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K vistas.  Seoul National University. Describimos el protocolo detallado para el diseño, simulación, wet-lab experimentos y análisis para un rack de acordeón ADN reconfigurable de mallas de 6 por 6.

Video: Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Síntesis de oro Nanostar con un método de la Simiente de Plata crecimiento mediada por

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Investigación

Bioingeniería

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

Diseño de un Carga mecánica Biaxial biorreactor para Ingeniería de Tejidos

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

Millifluidics para la síntesis química y Estudios mecanicistas Tiempo de resolver

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Síntesis de una proteína artificial mediada Intein hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of these porous nanofibers is of great interest due to their unique physiochemical properties. Here we elaborate on the fabrication of keratin containing poly (&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibers (i.e., PCL/keratin composite fiber). Water soluble keratin was first extracted from human hair and mixed with PCL in different ratios. The blended solution of PCL/keratin was transformed into nanofibrous membranes using a laboratory designed electrospinning set up. Fiber morphology and mechanical properties of the obtained nanofiber were observed and measured using scanning electron microscopy and tensile tester. Furthermore, degradability and chemical properties of the nanofiber were studied by FTIR. SEM images showed uniform surface morphology for PCL/keratin fibers of different compositions. These PCL/keratin fibers also showed excellent mechanical properties such as Young&#39;s modulus and failure point. Fibroblast cells were able to attach and proliferate thus proving good cell viability. Based on the characteristics discussed above, we can strongly argue that the blended nanofibers of natural and synthetic polymers can represent an excellent development of composite materials that can be used for different biomedical applications.

Electrospun nanofibers have a high surface area to weight ratio, excellent mechanical integrity, and support cell growth and proliferation. These nanofibers have a wide range of biomedical applications. Here we fabricate keratin/ PCL nanofibers, using the electrospinning technique, and characterize the fibers for possible applications in tissue engineering.

Síntesis de nanofibras a base de Queratina de Ingeniería Biomédica

Electrospinning, due to its versatility and potential for applications in various fields, is being frequently used to fabricate nanofibers. Production of ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Reconfigurable Microfluidic Channel with Pin-discretized Sidewalls

Microfluidic components need to have various shapes to realize different key microfluidic functions such as mixing, separation, particle trapping, or reactions. A microfluidic channel that deforms even after fabrication while retaining the channel shape enables high spatiotemporal reconfigurability. This reconfigurability is required in such key microfluidic functions that are difficult to achieve in existing "reconfigurable" or "integrated" microfluidic systems. We describe a method for the fabrication of a microfluidic channel with a deformable sidewall consisting of a laterally aligned array of the ends of rectangular pins. Actuating the pins in their longitudinal directions changes the pins' end positions, and thus, the shape of discretized channel sidewalls.Pin gaps can cause unwanted leakage or adhesion to adjacent pins caused by meniscus forces. To close the pin gaps, we have introduced hydrocarbon-fluoropolymer suspension-based gap filler accompanied by an elastomeric barrier. This reconfigurable microfluidic device can generate strong temporal in-channel displacement flow, or can stop the flow in any region of the channel. This feature will facilitate, on demand, the handling of cells, viscous liquids, gas bubbles, and non-fluids, even if their existence or behavior is unknown at the time of fabrication.

A microfluidic channel with deformable sidewalls offers flow control, particle handling, channel dimension customization and other reconfigurations while in use. We describe a method for fabricating a microfluidic channel with sidewalls made of an array of pins that allows their shape to change.

Reconfigurable canal microfluídico con flancos discretizar Pin

Microfluidic components need to have various shapes to realize different key microfluidic functions such as mixing, separation, particle trapping, or ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

En Vesiculo Síntesis de Precursores de Membrana De péptido para crecimiento de la vesícula Autónoma

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Design of an Open-Source, Low-Cost Bioink and Food Melt Extrusion 3D Printer

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling costs. This increasing popularity is partly driven by falling barriers to entry such as system set-up costs and ease of operation. The following protocol presents the design and construction of an Additive Manufacturing Melt Extrusion (ADDME) 3D printer for the fabrication of custom parts and components. ADDME has been designed with a combination of 3D-printed, laser-cut, and online-sourced components. The protocol is arranged into easy-to-follow sections, with detailed diagrams and parts lists under the headings of framing, y-axis and bed, x-axis, extrusion, electronics, and software. The performance of ADDME is evaluated through extrusion testing and 3D printing of complex objects using viscous cream, chocolate, and Pluronic F-127 (a model for bioinks). The results indicate that ADDME is a capable platform for the fabrication of materials and constructs for use in a wide range of industries. The combination of detailed diagrams and video content facilitates access to low-cost, easy-to-operate equipment for individuals interested in 3D printing of complex objects from a wide range of materials.

The aim of this work is to design and construct a reservoir-based melt extrusion three-dimensional printer made from open-source and low-cost components for applications in the biomedical and food printing industries.

Diseño de una impresora 3D de extrusión de biotinta y fusión de alimentos de código abierto y bajo costo

Three-dimensional (3D) printing is an increasingly popular manufacturing technique that allows highly complex objects to be fabricated with no retooling ...

Design of a Biocompatible Drug-Eluting Tracheal Stent in Mice with Laryngotracheal Stenosis

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of breath. LTS results from mucosal injury from a foreign body in the trachea, leading to tissue damage and a local inflammatory response that goes awry, leading to the deposition of pathologic scar tissue. Treatment for LTS is surgical due to the lack of effective medical therapies. The purpose of this method is to construct a biocompatible stent that can be miniaturized to place into mice with LTS. We demonstrated that a PLLA-PCL (70% poly-L-lactide and 30% polycaprolactone) construct had optimal biomechanical strength, was biocompatible, practicable for an in vivo placement stent, and capable of eluting drug. This method provides a drug delivery system for testing various immunomodulatory agents to locally inhibit inflammation and reduce airway fibrosis. Manufacturing the stents takes 28&#8722;30 h and can be reproduced easily, allowing for experiments with large cohorts. Here we incorporated the drug rapamycin within the stent to test its effectiveness in reducing fibrosis and collagen deposition. Results revealed that PLLA-PCL tents showed reliable rapamycin release, were mechanically stable in physiological conditions, and were biocompatible, inducing little inflammatory response in the trachea. Further, the rapamycin-eluting PLLA-PCL stents reduced scar formation in the trachea in vivo.

Laryngotracheal stenosis results from pathologic scar deposition that critically narrows the tracheal airway and lacks effective medical therapies. Using a PLLA-PCL (70% poly-L-lactide and 30% polycaprolactone) stent as a local drug delivery system, potential therapies aimed at decreasing scar proliferation in the trachea can be studied.

Diseño de un Stent Traqueal De la Droga-Eluting Biocompatible en Ratones con Estenosis Laringotraqueal

Laryngotracheal stenosis (LTS) is a pathologic narrowing of the subglottis and trachea leading to extrathoracic obstruction and significant shortness of ...