Este trabajo fue financiado por la Universidad de Basilea, del Departamento de Biomedicina, y la Swiss National Science Foundation (31003A-116624).

1. Configuración de organotípicos cultivos de cortes cerebelosos Cultivos cerebelares rebanada se preparan a partir día postnatal 8 P (8) crías de ratón utilizando el método de incubación estática 10. En nuestro laboratorio utilizamos B6CF1 ratones. En algunos experimentos los ratones transgénicos también se utilizaron que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje. La preparación de cultivos de corte es de unos 30 minutos por cada ratón cachorro, es decir, 3 horas para una camada de seis crías de ratón. Todos los pasos se llevan a cabo en condiciones estériles en un banco de trabajo de flujo laminar con instrumentos quirúrgicos esterilizados. <ol><li> El cerebelo de crías de ratón P8 se disecciona el cerebro en un medio de preparación enfriado con hielo (MEM (Gibco N º de catálogo 11012) con glutamax 1:100, pH 7,3) utilizando un estereomicroscopio. </li><li> El cerebelo se corta en rodajas de 350 m de espesor en la orientación sagital utilizando un cortador de tejidos McIlwain. </li><li> Las rodajas se colocan en Millipore insertos de cultivo de células (approx.6 rebanadas por inserción, Millipore PICM03050) y se incuban a 6-y las placas con 0,75 ml por pocillo de medio de incubación (48,35 ml de MEM, 25 ml de Medio Eagle, 25 ml de suero de caballo, 1 ml glutamax I, 0,65 ml de una glucosa estéril al 10% solución, pH 7,3) en un ambiente humidificado con 5% de CO 2 a 37 ° C. Todos los reactivos de cultivo de tejidos fueron de Gibco, Invitrogen. </li><li> Los tratamientos farmacológicos normalmente se inician a los 3 días in vitro (DIV3) mediante la adición de la droga en la concentración deseada para el medio de cultivo. Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) y (RS) -3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) eran de Tocris, UK. Dado que muchos fármacos requieren el uso de DMSO o etanol para preparar una solución madre (por ejemplo, PMA) se debe tener cuidado de que la cantidad total de disolvente añadido al medio de cultivo no debe exceder del 1% (7,5 ml por pocillo). Los fármacos se renuevan junto con el cambio del medio de cultivo cada 2 ª o 3 º día. </li></ol> 2. La fijación y Immunoscontengan organotípicos de cultivos de cortes cerebelosos Una ventaja importante de que el cerebelo es que los anticuerpos que específicamente están disponibles y brillantemente teñir las neuronas principales del cerebelo, es decir, células de Purkinje y células granulares. La morfología dendrítica de las células de Purkinje puede ser revelado por inmunotinción con anti-calbindin D28K. <ol><li> Para la fijación de los cultivos, el medio de cultivo se elimina y 3 ml de paraformaldehído al 4% frío en tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) se añadió cuidadosamente por pocillo que contenía el inserto Millicell con los cerebelar rebanadas fijadas a la membrana. Los cultivos se fijaron durante la noche, a continuación, el fijador se retira y se lavan los cultivos con tampón de fosfato. </li><li> Para la inmunotinción de los anticuerpos se utilizan los siguientes: conejo anti-calbindin D-28K (Swant, Bellinzona, Suiza) a 1:1000 para visualizar selectivamente células de Purkinje y monoclonal anti-NeuN (Chemicon, Millipore) a 1:500 para visualizar selectivamente Granule células 12. De conejo anti-GFP fue de Abcam, UK. Secundaria de anticuerpos fluorescentes Alexa eran de Molecular Probes, Invitrogen. </li><li> Los cultivos se permeabilizaron y se bloquearon mediante la adición de 3% de suero normal de cabra + 0,3% TritonX100 en tampón fosfato 0,1 M (solución de bloqueo). Anti-calbindin D28K y anti-NeuN se diluyen en solución de bloqueo y los cultivos se incuban con la solución de bloqueo que contiene los anticuerpos durante la noche a 4 ° C bajo ligera agitación. Todas las diluciones se indican como% (v / v), Triton X100 se toma de una solución madre de 10% con el fin de facilitar el pipeteado. </li><li> Los cultivos se enjuagan 3 veces con tampón de fosfato 0,1 M y se incuban con anticuerpos adecuados segundos, por ejemplo de cabra anti-conejo Alexa 568 y de cabra anti-ratón Alexa 488 diluido 1:500 en tampón fosfato 0,1 M + 0,1% de TritonX100 durante 2 horas a temperatura ambiente. Los cultivos se enjuagan 3 veces con tampón de fosfato 0,1 M. </li><li> Las rodajas teñidas son eliminados de la culturabien con un pincel y se montan en portaobjetos de vidrio Superfrost Plus y cubreobjetos con un medio de montaje adecuado, por ejemplo Mowiol. Las culturas pueden ahora ser visto en un microscopio de epifluorescencia regular con el equipo o con un microscopio confocal. </li></ol> 3. Visualización de las células de Purkinje individuales en cultivos de corte organotípicos <ol><li> Después de la inmunotinción con Calbindin D28k el citoplasma completa de las células de Purkinje se brillantemente teñidas incluyendo las dendritas y el axón. Debido a la alineación denso de células de Purkinje en la capa de células de Purkinje, los cenadores dendríticas de la mayoría de las células de Purkinje se superponen por lo que es difícil de estudiar el árbol completo de una célula individual. Sin embargo, debido a la muerte celular de algunas células de Purkinje durante el proceso de preparación, en muchas culturas algunas áreas están presentes con una densidad reducida de las células de Purkinje. En estas zonas, es posible encontrar células de Purkinje con un cenador dendrítico completo que no se solapa con otra cells. En estas células, el árbol dendrítico pueden ser vistos y analizados en una calidad comparable a una tinción de Golgi. Debido a que en el cerebelo las células de Purkinje son el único tipo de células que expresan Calbindin D28K las células también se identifican como células de Purkinje. </li><li> Un método alternativo es el uso de cultivos derivados de B6; FVB-Tg (PCP2-EGFP) 146.244Yuza / J ratones (aquí llamado PCP2-EGFP ratones, disponible de Jackson Laboratories) que expresan EGFP bajo la célula de Purkinje específico L7 promotor 11. En cultivos de corte tales que viven las células de Purkinje se puede visualizar mediante la expresión de EGFP. También es posible seguir la morfología dendrítica de una sola celda con el tiempo. Alternativamente, después de la fijación, las células que expresan EGFP-Purkinje puede inmunotiñeron con un anticuerpo anti-GFP. Ambos métodos son adecuados para la tinción de dendritas, cuerpos celulares y axones de las células de Purkinje en cultivos organotípicos. Debido a que el promotor L7 en los ratones PCP2-EGFP no se expresa en todas las células de Purkinje y hay variations en la frecuencia de expresión de células de Purkinje entre ratones (Kapfhammer, datos no mostrados) rebanada cultivos derivados de estos ratones que sea más fácil de visualizar y medir las células de Purkinje que tienen árboles dendríticos que se solapan con otros árboles de Purkinje de células dendríticas. Tales árboles dendríticos se pueden ver individualmente cuando las células de Purkinje vecinos con la superposición de los árboles dendríticos no expresan GFP (Figura 1A, B). </li></ol> 4. Medición del tamaño de células de Purkinje árbol dendríticas y puntos de ramificación <ol><li> Tamaño del árbol dendrítico. Con el marcaje fluorescente de las células de Purkinje del tamaño del árbol dendrítico de una célula dada puede medirse fácilmente si el árbol no se solapa con otras células. Dado que las etiquetas de inmunotinción calbindina todas las células de Purkinje, puede ser difícil identificar las células que no se solapan con árboles dendríticos. En este caso el uso de la PCP2-EGFP se recomienda para simplificar la identificación de la célula de Purkinje suficientes que no se solapan con los árboles dendríticos. Una vez que una célula de Purkinje con un árbol que no se superponen dendríticas se identifica, se vieron con la lente de 20x y la imagen se registra con una cámara digital. Esta imagen puede ser analizada con un programa de análisis de imagen. Utilizamos Image Pro Plus, que permite esbozar el árbol dendrítico de la célula con un solo clic del ratón con la herramienta varita mágica en el modo de medición (Figura 2A). Entonces, el programa calcula el área cubierta por el árbol dendrítico y la exporta a MS Excel. El análisis estadístico de los datos se realiza con software GraphPad Prism (ver más abajo). </li><li> Número de puntos de ramificación. Debido a la morfología altamente ramificado y fina de los puntos de células de Purkinje dendríticas rama de árbol tienen que ser contados manualmente. El archivo de imagen de 20x de las células de Purkinje se amplía de tal manera que cubre la mayor parte de la pantalla usando Adobe Photoshop. Entonces cada punto de ramificación se cuenta y se marca con un punto brillante (Figura 2B). </li></ol> Seguimiento del desarrollo del árbol dendrítico de células de Purkinje durante el período de cultivo Los cultivos organotípicos rebanada derivados de PCP2-EGFP ratones que expresan EGFP específicamente en las células de Purkinje permiten estudiar la morfología de las células individuales durante varios días en cultivo. De esta manera el crecimiento y el desarrollo del árbol dendrítico durante el período de cultivo bien puede ser documentada. Living identificadas las células de Purkinje se fotografiaron todos los días ª 2 ª o 3 durante el período de cultivo, con el objetivo de 10x. Este objetivo de baja potencia se eligió para evitar y minimizar el daño fototóxico a las células debido a la iluminación con luz fluorescente. Figura 3 muestra dos ejemplos de células de Purkinje fotografiadas en cultivos vivos. La célula primera fue seguido de 2 días in vitro hasta 7 días in vitro (Figura 3, AC). Es evidente que la dendritic árbol de esta célula durante este período de tiempo crece varias nuevas sucursales y se expande en tamaño. En el segundo ejemplo, una célula de Purkinje fue seguido de 4 a 11 días in vitro (Figura 3, DF). El árbol dendrítico pequeño presente en DIV4 expande considerablemente durante este período de tiempo. Ambos ejemplos muestran que la mayor parte del árbol dendrítico de las células de Purkinje presentes al final del periodo de cultivo, efectivamente, se desarrollan en el cultivo. Desarrollo del árbol de células dendríticas Purkinje es inhibida por PKC o estimulación mGluR1 Cultivos de cortes organotípicos cerebelosas se cultivaron durante 11 días. Comenzando en el día 2 nd in vitro, algunos de los cultivos se trataron con PMA (50 nM), un éster de forbol estimulación de la PKC o DHPG (10 mM), un agonista de mGluR1, hasta que los cultivos se fijaron. Ambos compuestos se ha demostrado previamente para inhibir y limitar el crecimiento de células de Purkinje dendríticas 7, 8, 9, 5.En el control no tratado rebanadas de células de Purkinje desarrollado un típico árbol dendrítico grande y altamente ramificado que se visualizó ya sea por anti-Calbindin inmunotinción (Figura 4A) o en cultivos con EGFP-expresión de células de Purkinje, por inmunotinción con anti-GFP (Figura 4D). En los cultivos tratados con PMA la morfología del árbol dendrítico fue profundamente alterada. Las dendritas aparecía engrosado y tenían ramas cortas sólo unos pocos secundarios. Muchas células de Purkinje, a diferencia de los cultivos de control, ya no eran unipolar, con una dendrita primaria que emana del cuerpo de la célula, pero desarrollado dos o incluso más dendritas primarias (Figura 4B, E). El territorio cubierto por el árbol dendrítico se redujo notablemente (ver más abajo). Una situación similar se presentó en DHPG los cultivos tratados. El árbol dendrítico de las células de Purkinje se redujo mucho en tamaño y que la ramificación se redujo notablemente (Figura 4C, F). Sin embargo, también hubo alguna qualitative diferencias en comparación con los cultivos tratados con PMA. No hubo engrosamiento de las ramas dendríticas, y las dendritas primarias realizadas muchas dendritas secundarias muy cortas (Figura 4C, F) lo que sugiere que los eventos de señalización pasa en PMA y DHPG tratados con células de Purkinje pueden ser similares, pero no idénticos. La evaluación cuantitativa de tamaño de células de Purkinje árbol dendríticas y puntos de ramificación para la evaluación cuantitativa, el tamaño del árbol dendrítico de células de Purkinje y el número de puntos de ramificación por célula Purkinje se mide como se ha descrito anteriormente. Los resultados de al menos tres experimentos independientes se agruparon, y un mínimo de 20 células necesitan ser analizados. La media de la zona cubierta por los árboles dendríticos para los experimentos de control se determina y se establece como 100%, y los valores de los otros experimentos se expresan como valores de porcentaje en consecuencia. El análisis estadístico de los datos se realiza con software GraphPad Prism. Debido a que nosuponer que todos los valores determinados son parte de una distribución de Gauss, es usar pruebas estadísticas que no suponen una distribución de los valores medidos. Para comparar varias condiciones y las pruebas de significación estadística, utilizamos Kruskal-Wallis seguida de un procedimiento adecuado para las pruebas post hoc para la clasificación basada en las estadísticas, como, por ejemplo, aplicado en post test de Dunn en GraphPad Prism. Los resultados se presentan típicamente en forma de gráficos de barras. Un ejemplo de tal una evaluación estadística se da en la Figura 5. Tanto el análisis del tamaño del árbol dendrítico (Figura 5A) y el número de puntos de ramificación por célula de Purkinje (Figura 5B) muestran claras diferencias entre la condición de control y tratamiento DHPG o PMA. Ambos parámetros fueron diferentes con una significación estadística de p &lt;0,001 según la prueba de Kruskal-Wallis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> Figure 1. EGFP marcado con células de Purkinje. En PCP2-EGFP ratones no todas las células de Purkinje expresa EGFP. Por lo tanto, los árboles dendríticos de algunas células de Purkinje se pueden ver individualmente cuando se expresa EGFP (EGFP canal en A) y las células de Purkinje vecinos con la superposición de árboles dendríticos no (negativa en el canal de EGFP se muestra en A, positivo en la tinción anti-Calbindin mostrado en el canal rojo en B). Barra de escala = 50 micras. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> Figura 2. Medición de parámetros dendríticas de las células de Purkinje. (A). El tamaño del árbol dendrítico se puede medir fácilmente trazando el contorno de la célula de Purkinje con un solo clic del ratón en el análisis Pro Imagen de software más con la herramienta varita mágica. La herramienta Varita mágica se utiliza de modo que el árbol dendrítico completo, incluyendo el soma celular y todas las ramas dendríticas son completamente rodeada por la línea. (B). El número de puntos de ramificación es counted manualmente en imágenes de las células de Purkinje. Cada punto de ramificación está marcado con un punto amarillo. Barra de escala = 50 micras. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Figura 3. Seguimiento del desarrollo del árbol de células dendríticas Purkinje. Identificado células de Purkinje se fotografiaron varias veces para controlar el crecimiento del árbol dendrítico. (AC): árbol dendrítico de una célula de Purkinje en crecimiento y desarrollo de días in vitro (DIV) 2 hasta DIV7. Hay un continuo crecimiento y la ramificación de las dendritas durante este periodo de cultivo. (DF): árbol dendrítico de la célula de Purkinje crece y se desarrolla a partir de DIV4 hasta DIV11. El árbol dendrítico se expande considerablemente durante este período de cultivo. Barra de escala = 50 micras. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Figura 4. Desarrollo del árbol de células dendríticas Purkinje es inhibida por PKC o stimulati mGluR1en (A), (D):. células de control sin tratar con un árbol dendrítico bien desarrollado. (B), (E): Tras 9 días de tratamiento con PMA dendritas aparecer engrosada y el árbol dendrítico está fuertemente reducido en tamaño. Las células a menudo pierden su polarización y convertirse bipolar (E). (C), (F): Después de 9 días de tratamiento DHPG el árbol dendrítico es muy reducido en tamaño. Al contrario que en el tratamiento con PMA, muchas ramas laterales muy finas y cortas están presentes en las dendritas primarias y secundarias. Las células a menudo pierden su polarización y convertirse bipolar (F). Las células de Purkinje se visualizaron por anti-Calbindin inmunotinción en (A - C) y por EGFP-expresión en cultivos derivados de PCP2-EGFP ratones en (D - F). Barra de escala = 50 micras. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Figura 5. La evaluación cuantitativa del tamaño de células de Purkinje árbol dendrítico y la ramificación. Las mediciones cuantitativas muestran que tanto el tamaño del árbol dendrítico (gráfico de barras superior) y el Number de puntos de ramificación (inferior gráfico de barras) se reducen considerablemente después del tratamiento PMA o DHPG. Las diferencias entre los árboles dendríticos de control y los árboles dendríticos de las células de Purkinje de cultivos tratados fueron significativas con p &lt;0,001.

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+size+of+the+dendritic+tree+does+not+protect+Purkinje+cells+from+excitotoxic+death.">Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death.</a> J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).</li><li>Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mediates+Purkinje+cell+dendritic+development+via+lysyl+oxidase+propeptide+and+NF-&#954;B+signaling.">mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-&#954;B signaling.</a> Neuron. 68, 45-60 (2010).</li><li>Metzger, F., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva Europea Comunidades Consejo, de 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y fueron revisados ​​y autorizados por las autoridades suizas. Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos aquí presentados permiten estudiar el desarrollo de células de Purkinje dendríticas en cultivos de cortes organotípicos cerebelares y para evaluar cuantitativamente la expansión Purkinje de células dendríticas mediante la medición de tamaño de árbol dendrítico y el número de puntos de ramificación dendríticas. Por supuesto, un análisis cuantitativo más amplio y sofisticado de las dendritas de células de Purkinje es posible, por ejemplo, determinando la longitud dendrítica total, realizando...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Insertos de cultivo de tejidos </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> Los PICMORG50 insertos tienen un borde bajo y permitir la visualización de las culturas vivas en un microscopio </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basal de Eagle Meidum </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> El suero de caballo </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Forbol 12-myristaTE-13-acetato (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-dihidroxi-fenilglicina (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-calbindin D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Lucha contra NeuN, clon A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> De conejo anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

Células de Purkinje son un sistema de modelo atractivo para el estudio de desarrollo dendrítico, porque tienen un árbol dendrítico impresionante que es estrictamente orientada en el plano sagital y se desarrolla principalmente en el periodo postnatal en roedores pequeños 3. Además, los anticuerpos se encuentran disponibles varios que selectivamente y de forma intensiva marcar células de Purkinje, incluyendo todos los procesos, con anti-Calbindin D28K siendo el más ampliamente utilizado. Para la visualización de las dendritas en las células vivas, los ratones que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje 11 están disponibles a través de los laboratorios Jackson. Organotípicos culturas cerebelosos rebanada células permiten una fácil manipulación experimental de desarrollo Purkinje células dendríticas porque la mayor parte de la expansión dendríticas del árbol dendrítico de células de Purkinje que de hecho ocurre durante el período de cultivo 4. Presentamos aquí un protocolo corto, fiable y fácil para la visualización y el análisis de la morfología dendrítica de las células de Purkinje crecido en organotypic cultivos de cortes cerebelosos. Para muchos fines, una evaluación cuantitativa del árbol dendrítico de células de Purkinje es deseable. Nos centramos aquí en dos parámetros, tamaño del árbol dendrítico y los números de punto de ramificación, que puede ser rápidamente y fácilmente determinadas a partir de anti-calbindina cultivos teñidos rebanada cerebelosos. Estos dos parámetros obtener una medida fiable y sensible de los cambios del árbol de células dendríticas Purkinje. Usando el ejemplo de los tratamientos con la proteína quinasa C PMA (PKC) y el activador del receptor de glutamato metabotrópico 1 (mGluR1) se demuestra cómo las diferencias en el desarrollo dendrítico se visualizan y evaluó cuantitativamente. La combinación de la presencia de un árbol dendrítico extensa, los métodos selectivos y de inmunotinción intensa, cultivos organotípicos rebanada que cubren el período de crecimiento dendrítico y un modelo de ratón con expresión de células de Purkinje EGFP específico hacer las células de Purkinje un sistema modelo de gran alcance para revelar los mecanismos de la dendríticas desarrollo.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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Neuroscience

18.4K vistas.  University of Basel. Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Automatizado de Análisis de la morfología neuronal Sholl digitalizados en múltiples escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Investigación

Neurociencias

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotípicos culturas rebanada hipocampo

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-Etiquetado Inmunoelectrónica incorporación de proteínas sinápticas en cultivos de cortes de hipocampo

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indirecta neurona-astrocito Coculture Ensayo: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Puesta en marcha de la investigación detallada de las interacciones neurona-glía