Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Investigación Naval Naval de los EE.UU. a través de los fondos básicos del Laboratorio de Investigación.

1. LNA sondas y diseño experimental <ol><li> Diseño de sondas LNA que son el complemento reverso de su sRNA transcripción / ARNm o hacer diseño personalizado en <a href="http://www.exiqon.com">www.exiqon.com</a> . Si se utiliza la opción de diseño personalizado, se conoce la secuencia, pero no el patrón de presión LNA. La adición de cada residuo LNA en un ADN o ARN resultados de oligonucleótidos en un aumento de la T m de entre dos y 10 ° C durante un dúplex de hibridación LNA-ARN 14. Lo ideal sería que las sondas LNA diseñado debe ser entre 20 a 25 nucleótidos de longitud (ya las sondas son más difíciles de sintetizar) y tiene un T m de entre 85-90 º C para el ARN de hibridación. </li><li> Después de diseñar la secuencia, el uso de BLAST <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> o comparar la secuencia de la sonda a su base de datos local para asegurarse de la sonda es específica sólo para su sRNA / ARNm de interés. </li><li>Al pedir la sonda de LNA, añade una modificación de biotina-TEG al extremo 5 &#39;de los oligonucleótidos de LNA. La biotinilación es necesario para la tinción de post-hibridación con un conjugado de estreptavidina-dye. Es posible añadir esta modificación para el extremo 3 &#39;si es necesario, pero la adición al extremo 5&#39; es menos costosa y debería resultar en mayores rendimientos. </li><li> Tres controles negativos deben ser incluidos en el método: (i) un &#39;no LNA &quot;control en el que una sonda LNA no se agrega durante el paso de hibridación, (ii) un control&quot; ningún tinte &quot;en el que la sonda se hibrida LNA a la sRNA objetivo, pero el caso de la hibridación no se detecta debido a la ausencia de la tinción fluorescente, y el control (iii) &#39;ARNm no expresado sRNA /&#39; a que utiliza una sonda de LNA que se dirige a un sRNA no existen o no expresado, con el fin de para vigilar el cumplimiento específico de la hibridación. </li><li> La sonda específica LNA aquí es complementaria a la CsrB sRNA y tiene la secuencia 5&#39;-biotina-TEG-gTccAttTccCgtCctTagCagC-3 &#39;(monómeros LNA enletras mayúsculas). </li><li> Tras la recepción de liofilizado LNA, resuspender con agua libre de nucleasa a 50 mg / ml y almacenar en el 10-20 alícuotas a -20 ° C. </li></ol> Soluciones <ul><li> 8% paraformaldehído (PFA), 10% de ácido acético en PBS: Mezclar 1 ml de 32% de PFA, 400 de ácido acético l, 400 l de 10X PBS, pH = 7,4, y 2,2 mL de agua libre de nucleasa. De alícuotas congeladas, congelar en alícuotas de un solo uso a -20 ° C sin ácido acético. </li><li> 60% de solución de sulfato de dextrano: añadir 6,0 g de sulfato de dextrano a un tubo de 50 ml y añadir agua hasta un volumen final de 10 ml. Llevar esta mezcla a 65 º C en un baño de agua hasta que el sulfato de dextrano se disuelve (puede tomar 1-2 horas). Agua adicional puede ser necesario añadir en todo el proceso de solubilización de mantener un volumen de 10 ml. Alícuota del 60% de solución de sulfato de dextrano y almacenar a -20 ° C hasta su uso. </li></ul> 2. Fijación <ol><li> Cosecha de 1x10 8 células de bioluminiscentes <em&gt; Vibrio campbellii o la bacteria de interés y transferirlos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta cantidad de células proporciona suficiente material de partida para cuatro peces de flujo de las muestras (una muestra específica de la sonda LNA y tres controles negativos). Adicional de 1,5 ml alícuotas de tubo de microcentrífuga se deben recoger si otros sRNA / ARNm especies necesitan ser probados. </li><li> Que sedimenten las células bacterianas por centrifugación a 2300 xg durante cinco minutos. Eliminar el sobrenadante con pipeta y resuspender las células en 400 l de PBS 1X. </li><li> A esta mezcla, añadir 400 l de un 8% paraformaldehído (PFA) y el 10% de ácido acético en solución salina tamponada con fosfato 1X (1X PBS), mezclar bien e incubar durante 10 minutos a 25 ° C la mezcla una vez después de cinco minutos. Todas las incubaciones, a menos que se indique lo contrario, se llevan a cabo en un soporte de tubo se calienta. La solución de PFA deben estar preparados frescos o usado de alícuotas congeladas después de la adición de ácido acético. Paraformaldehído es un fijador de reticulación que hELPS para preservar la morfología celular y conservar el ARN intracelular. </li><li> Que sedimenten las células de esta mezcla por centrifugación a 4500 xg durante dos minutos y retirar el sobrenadante con pipeta. Todos los pasos futuros que requieren centrifugación debe utilizar la misma configuración (7K, 2 min). Es importante señalar que después de la centrifugación los sobrenadantes se debe quitar con la pipeta y la decantación no. </li><li> Lavar las células dos veces con 400 l de PBS 1X y volver a suspender el final de pellet de células en 400 l de PBS 1X. Las células están fijas y se pueden almacenar a 4 ° C en 400 l de PBS 1X durante un máximo de siete días. </li></ol> 3. Dietil tratamiento pirocarbonato <ol><li> Prepare 400 l de una solución al 0,1% de dietil pirocarbonato (DEPC) en 1X PBS (400 l de esta solución es necesaria para cada muestra a analizar para la escala en consecuencia). La solución de DEPC debe estar recién a partir de un stock DEPC. Tratamiento con DEPC inactiva las RNasas por carbetoxilación y disminuye laseñal de fondo. </li><li> Añadir 400 l de la solución al 0,1% DEPC a cada muestra de células bacterianas fija y mezclar bien con la pipeta. Incubar la mezcla a 25 º C durante 12 minutos. Lavar las células dos veces con 400 l de PBS 1X, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. </li></ol> 4. Permeabilización <ol><li> Añadir 1,0 mg de lisozima a 1 ml de Tris-EDTA (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) para un 1,0 mg / ml solución. Esta solución debe prepararse fresca. Añadir 800 l de 1 mg / ml solución de lisozima a las células, mezclar bien con la pipeta e incubar a 25 ° C durante 30 minutos con mezcla ocasional. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. La lisozima actúa como un reactivo de permeabilización por hidrólisis de la presente peptidoglicano de la pared celular bacteriana. </li><li> Prepare un 3,0 mg / ml solución de proteinasa K en buffer TE. Esta solución debe prepararse fresca de un 20 acciones mg / ml de proteinasa K que se almacena a -20 ° C.Proteinasa K es una serina proteasa que digiere una variedad de proteínas y ayuda a la accesibilidad de las sondas y reactivos para el ARN. </li><li> Añadir 800 l de 3,0 mg / ml de proteinasa K solución para el pellet de células, y mezclar bien con la pipeta. Se incuba a 25 ° C durante 15 minutos con agitación la mitad de la incubación. </li><li> Que sedimenten las células (7K, 2 min), separar el sobrenadante y se lavan las células una vez con 400 l de PBS 1X. Después de retirar el sobrenadante de lavado, resuspender las células en 400 l de PBS 1X y añadir 100 ml de la resuspensión en cuatro nuevos tubos de 1,5 mL microcentrífuga. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. </li></ol> 5. Hibridación <ol><li> La preparación de 100 l de buffer de hibridación (HB) para cada muestra. La HB se compone de 50% de formamida en volumen, 10% de sulfato de dextrano en masa (añadir 16,7 l de la solución de sulfato de dextrano 60% por cada l 100), solución 1X de Denhardt, sodio 50 mM de fosfato de pH 7,0,Citrato de sodio 2X (SSC), 20 ug de ADN de esperma de salmón cortado (SSSD) y 20 g de levadura tRNA. </li><li> Cada uno de los componentes de la HB tiene un propósito diferente. Formamida baja la temperatura de fusión del ácido nucleico dúplex facilitando así la desnaturalización del ARN y minimizar el daño celular. Sulfato de dextrano se usa como un volumen, excluidos los polímeros para concentrar la investigación y aumentar la tasa de hibridación. Solución Denhardts, tRNA de levadura y SSSD servir como agentes bloqueantes para reducir la unión no específica. </li><li> En cada una de las células que contienen la resuspensión 1,5 tubos de microcentrífuga ml, agregar 95 l HB y 5,0 l de la sRNA / ARNm específicos LNA [20 pmol de concentración específicos LNA final] o el agua (para el control LNA no negativo). Por ejemplo: <ol class="lalpha"><li> Tubo de 1 a 95 l HB + 5.0 sRNA l / ARNm específicos de la sonda </li><li> Tubo de 2 a 95 l HB + 5.0 l sRNA / ARNm específicos de la sonda (control negativo &quot;ningún tinte&quot;) </li><li> Tubo de 3 a 95 l HB + sRNA 5,0 l/ ARNm de la sonda (&#39;no expresado sRNA / ARNm &quot;control negativo) </li><li> Tubo de 4 a 95 l HB + 5,0 l de agua (control negativo &quot;no LNA) </li></ol></li></ol><ol start="4"><li> Incubar las cuatro muestras a 60 ° C durante 60 minutos. La temperatura de hibridación depende de la LNA sonda m (s) T y debe ser, aproximadamente, a 30 ° C por debajo de la predicción de T m para el recocido de RNA. Tanto la temperatura de hibridación elevada y formamida en el HB asegura la desnaturalización de la estructura secundaria de la sRNA o ARNm de interés. </li></ol> 6. Hibridación posterior a la lava <ol><li> Tras la hibridación, agregar 1,0 ml 0.1X SSC con el 0,1% Tween-20 (SSCT) a la mezcla de hibridación. Esto es necesario para permitir que las células se retira de la solución de hibridación viscoso. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 200 l de formamida al 50%, 2X SSC, 0,1% de Tween-20 a los gránulos de las células, mezclar bien y incubcomió durante 30 minutos a 65 ° C en un calentador. </li><li> Añadir 1 mL 0.1X SSCT a la mezcla, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 500 SSCT 0.1X l para volver a suspender las células y se incuba durante 40 minutos a 65 ° C en un bloque de calor. Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. </li></ol> 7. El bloqueo y la tinción <ol><li> Preparar el tampón de bloqueo (BB) y la solución de tinción estreptavidina-dye. Prepare una solución 1X BB de una reserva de 5 veces (disponible en el mercado, ver los reactivos). Por cada juego de cuatro tubos, preparar 1,2 mL 1X BB. </li><li> Añadir 200 l 1X BB a los gránulos de las células, se resuspenden y se incuban durante 30 minutos a 25 ° C. </li><li> Un tinte con estreptavidina conjugada se utiliza para detectar las sondas LNA biotina. Si bien el bloqueo, prepare una solución de 2 mg / ml DyLight estreptavidina 488 o el tinte deseado-estreptavidina conjugada en 1X BB durante 30 minutos (para tres muestras, hacer 300 L). </li><li> Después de incubción con 1X BB, que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. Añadir 50 l de la solución de estreptavidina-colorante a la celda de pellets, mezclar bien e incubar durante 12 minutos a 25 ° C con la mezcla constante de un vórtice o en un termomezclador. Para el control &quot;ningún tinte&quot;, se añaden 50 l de búfer 1X bloqueo solamente. Para el resto del protocolo, proteger los tubos de la luz con papel de aluminio. </li><li> Lave las células una vez con 500 l de amortiguación SSCT 0.1X, y una vez con 400 l de PBS 1X con 0,1% Tween-20 (PBST). Que sedimenten las células (7K, 2 min) y eliminar el sobrenadante. </li><li> Después de la inicial de estreptavidina conjugada manchas, la señal se amplifica mediante la introducción de un anti-biotina estreptavidina anticuerpo al conjugado estreptavidina-dye y manchas por segunda vez con la estreptavidina-dye lo que aumenta la salida de la señal por hibridación LNA de la sonda (Figura 2) . </li><li> Añadir 100 ml de 1 mg / ml anti-biotina estreptavidina anticuerpos en PBS 1X, resuspend las células y se incuba a 25 ° C durante 30 minutos con mezcla ocasional. Que sedimenten las células (7K, 2 min), separar el sobrenadante y lavar dos veces con 400 l 1X PBST. </li><li> Añadir 50 l de los dos mg / ml de estreptavidina-dye solución a las células, mezclar bien e incubar durante 12 minutos a 25 ° C con la mezcla constante de un vórtice o en un termomezclador. Para el control &quot;ningún tinte&quot;, se añaden 50 l de búfer 1X bloqueo solamente. </li><li> Lave las células una vez con 500 l de amortiguación SSCT 0.1X, y una vez con 400 l 1X PBST. </li><li> Resuspender las células en 200 l 1X PBST y se almacenan a 4 ° C hasta que esté listo para el análisis de citometría de flujo. Para los más pequeños de células bacterianas establecer la velocidad de flujo para reducir para reducir el tamaño del núcleo. Además, para los citómetros de flujo hacia adelante con cortes de dispersión límite, el límite debe establecerse lo más bajo posible para asegurar que las células bacterianas se detectan pequeñas. </li><li> Para DyLight 488 de detección, el citómetro de flujo debe estar equipado con un láser de 488 nm y la norma de emisionesfiltros para FITC. Por lo menos 2x10 4 eventos se deben recoger. Por razones de compatibilidad con citómetros de flujo equipados con láseres diferentes, otros estreptavidina conjugada con fluoróforos se pueden utilizar para este protocolo. </li></ol> 8. Los resultados representativos Un ejemplo de las células que son fijos y permeabilized efectivamente se muestra en el diagrama de flujo de citometría de punto en la Figura 3. Al utilizar las condiciones descritas anteriormente para la permeabilización de la población celular es pequeño y homogéneo que indica algunos agregados de células. Cuando más alto (5 mg / ml), las concentraciones de lisozima se utilizan, las células son más propensas a agregar y mostrar un aumento de los valores de dispersión hacia adelante, indicativo de las partículas más grandes (Figura 3B). Un ejemplo de los datos de citometría de flujo de una exitosa LNA flujo PESCADO experimento se muestra en la Figura 4. El histograma muestra la detección específica de un sRNA objetivo, junto con tres controles negativos.El control negativo &quot;ningún tinte&quot; produce la menor fluorescencia, seguido por el &#39;no LNA &quot;y&quot; no expresado sRNA &quot;controles negativos. Finalmente, la muestra con la sonda específica de sRNA LNA produce la mayor fluorescencia. Una vez que el método y las sondas LNA son validados de esta manera, experimentos adicionales pueden ser diseñados para monitorear los cambios en la señal de sRNA lo largo del tiempo, en respuesta a las mutaciones o diversas condiciones culturales, etc <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig1.jpg" /> Figura 1. Representación de la estructura general de un LNA de flujo PESCADO experimento para la detección de sRNA bacteriana. <img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig2.jpg" /> Figura 2. Tinción y amplificación de la LNA flujo PESCADO señal. a) La hibridación de la sonda biotinilada LNA. b) La tinción fluorescente con la DyLight 488 conjugado de estreptavidina. c) La unión de la biotina anti-streptavidin anticuerpos contra la estreptavidina DyLight 488. El anticuerpo puede unirse estreptavidina través de su sitio de unión al antígeno o puede estar sujeto a través de sus residuos estreptavidina biotina. d) La amplificación de la señal mediante la tinción fluorescente con la más DyLight 488 conjugado de estreptavidina. <img alt="Figura 3." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig3.jpg" /> Figura 3. Flow que muestra gráficos de puntos de citometría de avance frente a los resultados de una dispersión lateral) 1 mg / ml de lisozima, g 3 / ml de proteinasa K permeabilización y b) 5 mg / ml de lisozima, 3 mg / ml de proteinasa K permeabilización. <img alt="Figura 4." src="/files/ftp_upload/3655/3655fig4.jpg" /> Figura 4. Histograma análisis de la LNA PESCADO flujo de los resultados. La señal fluorescente generada a partir de cada muestra se muestra en las cuatro trazas: negro - sRNA específicos LNA sonda, rojo - control negativo &quot;no expresa sRNA; azul - control negativo&quot; no LNA; púrpura -Control negativo &quot;ningún tinte.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El LNA flujo PESCADO método que aquí se presenta se utilizó para detectar la expresión de un sRNA de los Gram-negativos marinos bacteria Vibrio campbellii cuya expresión ha sido previamente confirmado a través de perfiles de expresión de microarrays basados ​​en la polimerasa con transcripción inversa y reacción en cadena de 16. Hasta la fecha, hemos utilizado este método para controlar la expresión de una variedad de ARN (por ejemplo, trans-codificados sRNA, sRNA que modulan la actividad de la proteína, riboswitches y ARNm). Como tal, estamos seguros de que el método es adaptable y puede ser utilizado para detectar cualquier objetivo o sRNA ARNm y pueden ser modificados para su uso en cualquier especie o tipo de célula bacteriana. Si la modificación de este protocolo es necesario para otros tipos de células, la variable más importante a considerar es la manipulación de la etapa de permeabilización. Por ejemplo, al modificar las condiciones de permeabilización se describe aquí, los cambios en las concentraciones de lisozima y proteinasa K debe ser probado. Hemos encontrado que la duplicación otriplicar la cantidad de lisozima y proteinasa K dio lugar a cambios importantes en la LNA PESCADO flujo de los resultados. Además, cuando las pruebas condiciones adicionales permeabilización, las células deben ser analizados por aglutinación, la pérdida de células, y obtener la mejor señal al cociente de la fluorescencia de fondo. El grado de aglutinación celular puede ser probada por microscopía y / o citometría de flujo. Por citometría de flujo, grupos de células están presentes en las colas en un avance frente a dispersión lateral gráfico de puntos y el método de permeabilización correcto minimizar este efecto de relaves. Este método también es susceptible de detección múltiple sRNA sin grandes modificaciones en el protocolo descrito como sondas LNA adicionales etiquetados con otros haptenos como digoxigenina podrían añadirse durante la etapa de hibridación y detecta con un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado y secundaria de anticuerpos fluoróforo. En la actualidad, la única limitación que nos hemos encontrado con este método es su incapacidad para generar suficiente señal débil de expresionado especies sRNA y se están realizando esfuerzos para determinar el umbral de detección (en número de copias por célula absoluta). En general, el flujo de LNA-PESCADO método ofrece la oportunidad de medir sRNA bacteriana o la expresión del ARNm de la célula única a nivel de un alto rendimiento para proporcionar información sobre la presencia y abundancia relativa de especies sRNA y el grado en que su expresión varía en una población.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Fosfato de 10 veces (PBS), pH 7,4 </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9625 </td><td></td></tr><tr><td> Agua libre de nucleasa </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9932 </td><td> (No tratada DEPC) </td></tr><tr><td> 32% de paraformaldehído </td><td> Microscopía electrónica de Ciencias </td><td> RT 15714 </td><td> Etanol libre </td></tr><tr><td> Ácido acético </td><td> Acros orgánicos </td><td> 327290010 </td><td></td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5758 </td><td&gt; Mantenga desecado </td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Sigma Aldrich </td><td> L2879 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasa K (20 mg / mL) </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM2546 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9342 </td><td> Alícuota desionizada, y la congelación de </td></tr><tr><td> Sulfato de dextrano MW&gt; 500 000 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D8906 </td><td> Alícuota del 60% y la congelación de la solución </td></tr><tr><td> Solución de Denhardt 50X concentrado </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D2532 </td><td> Alícuota y congelar </td></tr><tr><td> Tampón citrato sódico 20X </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9770 </td><td></td></tr><tr> &lt;Salmón td&gt; ADN del esperma (cortados) 10 mg / ml </td><td> Applied Biosystems / Ambion </td><td> AM9680 </td><td> Alícuota y congelar </td></tr><tr><td> TRNA de levadura (10 mg / mL) </td><td> Tecnologías de la Vida / Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td> Alícuota y congelar </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P9416 </td><td></td></tr><tr><td> 5 veces en una solución de hibridación in situ el bloqueo </td><td> Vector Laboratories </td><td> MB-1220 </td><td></td></tr><tr><td> DyLight 488 estreptavidina </td><td> Vector Laboratories </td><td> SA-5488-1 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-biotina estreptavidina </td><td> Vector Laboratories </td><td> BA-0500 </td><td> Alícuota y congelar </td></tr></tbody></table>

locked nucleic acid flow cytometry-fluorescence in situ hybridization (lna flow-fish): a method for bacterial small rna detection

Hibridación in situ fluorescente (FISH) es una poderosa técnica que se utiliza para detectar y localizar secuencias específicas de ácidos nucleicos en el entorno celular. Con el fin de aumentar el rendimiento, el pescado puede ser combinado con citometría de flujo (flow-FISH) para permitir la detección de secuencias de ácidos nucleicos específicos en miles de células individuales. Como resultado, el flujo de-pescado ofrece una clara ventaja sobre lisado / conjunto de métodos basados ​​en la detección de ácidos nucleicos, ya que cada célula es tratada como una observación independiente, lo que permite mayor análisis estadísticos y la varianza. Estos atributos han impulsado el uso de métodos FISH y el flujo de pescado en un número de diferentes aplicaciones y la utilidad de estos métodos se ha demostrado con éxito en la determinación de los telómeros de longitud 1,2, identificación celular y la expresión de genes 3,4, el seguimiento de multiplicación viral en 5 células infectadas, y el análisis de la comunidad bacteriana y la enumeración de6. Tradicionalmente, la especificidad de los métodos FISH y el flujo de FISH-ha sido impartida por las sondas de oligonucleótidos de ADN. Recientemente, sin embargo, la sustitución de las sondas de oligonucleótidos de ADN con análogos de ácidos nucleicos como sondas de FISH y el flujo de FISH-ha aumentado la sensibilidad y la especificidad de cada técnica debido a las temperaturas de fusión más alto (T m) de estos análogos de ácidos nucleicos naturales 7,8 . De ácido nucleico cerrado (LNA) sondas son un tipo de análogo de ácido nucleico que contienen nucleótidos LNA disparó a través de una secuencia de ADN o ARN 9,10. Cuando se combina con el flujo-FISH, sondas LNA han sido previamente demostrado para superar las sondas convencionales de ADN 7,11 y se han utilizado con éxito para detectar ARNm eucariotas 12 y el ARN viral en células de mamíferos 5. Aquí ampliar esta capacidad y describir un LNA de flujo PESCADO método que permite la detección específica del ARN en la célula bacterianas (Figura 1). En concreto, estamos interesados ​​en la detección de los pequeños no codificante ARN regulador (sRNA), que han cosechado un considerable interés en los últimos años, ya que se ha encontrado que sirven como elementos reguladores clave en muchos procesos celulares críticos 13. Sin embargo, hay pocas herramientas para estudiar sRNAs y los desafíos de la detección de sRNA en las células bacterianas se debe en parte al tamaño relativamente pequeño (normalmente 50-300 nucleótidos de longitud) y la baja abundancia de las moléculas de sRNA, así como la dificultad general en el trabajo con pequeñas células biológicas con diferentes membranas celulares. En este método, se describen las condiciones de fijación y permeabilzation que conservan la estructura de las células bacterianas y de permitir la penetración de las sondas LNA así como los pasos de amplificación de señal que permiten la detección específica de baja abundancia Srna (Figura 2).

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Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization LNA flow-FISH: a Method for Bacterial Small RNA Detection

Una novela de alto rendimiento se describe el método que permite la detección y cuantificación relativa de los pequeños ARN y la expresión del ARNm de las células bacterianas individuales usando sondas de ácido nucleico cerrado y citometría de flujo fluorescente<em&gt; In situ</emHibridación&gt;.

Flujo de ácido nucleico cerrado Citometría de fluorescencia In situ</emHibridación> (LNA flujo-FISH): un método para la detección de bacterias pequeñas de ARN

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a powerful technique that is used to detect and localize specific nucleic acid sequences in the cellular ...

locked-nucleic-acid-flow-cytometry-fluorescence-situ-hybridization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Locked Nucleic Acid Flow Cytometry-fluorescence in situ Hybridization (LNA flow-FISH): a Method for Bacterial Small RNA Detection

25.2K vistas.  Naval Research Laboratory. Una novela de alto rendimiento se describe el método que permite la detección y cuantificación relativa de los pequeños ARN y la expresión del ARNm de las células bacterianas individuales usando sondas de ácido nucleico cerrado y citometría de flujo fluorescente In situ.

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Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Transfection and Mutagenesis of Target Genes in Mosquito Cells by Locked Nucleic Acid-modified Oligonucleotides

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new infections each year. Despite decades of research, there is still no vaccine against malaria, highlighting the need for novel control strategies. One innovative approach is the use of genetically modified mosquitoes to effectively control malaria parasite transmission. Deliberate alterations of cell signaling pathways in the mosquito, via targeted mutagenesis, have been found to regulate parasite development 1. From these studies, we can begin to identify potential gene targets for transformation. Targeted mutagenesis has traditionally relied upon the homologous recombination between a target gene and a large DNA molecule. However, the construction and use of such complex DNA molecules for generation of stably transformed cell lines is costly, time consuming and often inefficient. Therefore, a strategy using locked nucleic acid-modified oligonucleotides (LNA-ONs) provides a useful alternative for introducing artificial single nucleotide substitutions into episomal and chromosomal DNA gene targets (reviewed in 2). LNA-ON-mediated targeted mutagenesis has been used to introduce point mutations into genes of interest in cultured cells of both yeast and mice 3,4. We show here that LNA-ONs can be used to introduce a single nucleotide change in a transfected episomal target that results in a switch from blue fluorescent protein (BFP) expression to green fluorescent protein (GFP) expression in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells. This conversion demonstrates for the first time that effective mutagenesis of target genes in mosquito cells can be mediated by LNA-ONs and suggests that this technique may be applicable to mutagenesis of chromosomal targets in vitro and in vivo.

Oligonucleotides can be used to site specifically substitute a single nucleotide of transfected target genes in both Anopheles gambiae and Anopheles stephensi cells.

Transfección y mutagénesis de los genes diana en células de mosquito por nucleico cerrado modificado ácido oligonucleótidos

Plasmodium parasites, the causative agent of malaria, are transmitted through the bites of infected Anopheles mosquitoes resulting in over 250 million new ...

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. Although the natural occurrence of both diseases&#39; is now relatively rare, the possibility of terrorist groups using these pathogens as a bioweapon is real. Because of the disease&#39;s inherent communicability, rapid clinical course, and high mortality rate, it is critical that an outbreak be detected quickly. Therefore methodologies that provide rapid detection and diagnosis are essential to ensure immediate implementation of public health measures and activation of crisis management.
Recombinant reporter phage may provide a rapid and specific approach for the detection of Y. pestis and B. anthracis. The Centers for Disease Control and Prevention currently use the classical phage lysis assays for the confirmed identification of these bacterial pathogens 2-4. These assays take advantage of naturally occurring phage which are specific and lytic for their bacterial hosts. After overnight growth of the cultivated bacterium in the presence of the specific phage, the formation of plaques (bacterial lysis) provides a positive identification of the bacterial target. Although these assays are robust, they suffer from three shortcomings: 1) they are laboratory based; 2) they require bacterial isolation and cultivation from the suspected sample, and 3) they take 24-36 h to complete. To address these issues, recombinant &#34;light-tagged&#34; reporter phage were genetically engineered by integrating the Vibrio harveyi luxAB genes into the genome of Y. pestis and B. anthracis specific phage 5-8. The resulting luxAB reporter phage were able to detect their specific target by rapidly (within minutes) and sensitively conferring a bioluminescent phenotype to recipient cells. Importantly, detection was obtained either with cultivated recipient cells or with mock-infected clinical specimens 7.
For demonstration purposes, here we describe the method for the phage-mediated detection of a known Y. pestis isolate using a luxAB reporter phage constructed from the CDC plague diagnostic phage &#934;A1122 6,7 (Figure 1). A similar method, with minor modifications (e.g. change in growth temperature and media), may be used for the detection of B. anthracis isolates using the B. anthracis reporter phage W&#946;::luxAB 8. The method describes the phage-mediated transduction of a biolumescent phenotype to cultivated Y. pestis cells which are subsequently measured using a microplate luminometer. The major advantages of this method over the traditional phage lysis assays is the ease of use, the rapid results, and the ability to test multiple samples simultaneously in a 96-well microtiter plate format.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/2740/2740fig1.jpg" /> 
Figure 1. Detection schematic. The phage are mixed with the sample, the phage infects the cell, luxAB are expressed, and the cell bioluminesces. Sample processing is not necessary; the phage and cells are mixed and subsequently measured for light.

&#039;Bioluminescent&#039; Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

A simple method for the identification of priority bacterial pathogens is to use genetically engineered reporter phage. These reporter phage, which are specific to their particular host species, are capable of rapidly transducing a bioluminescent signal response to host cells. Herein, we describe the use of reporter phage for the detection of Yersinia pestis.

&quot;Bioluminiscente &#39;reportero fagos para la detección de patógenos bacterianos de la categoría A

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hibridación<em&gt; In situ</em&gt; De las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

Fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación en los cromosomas mitóticos de mosquitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

Cromosomas artificiales bacterianos: una herramienta de Genómica Funcional para el Estudio de cadena positiva virus de ARN

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extracción rápido, seguro y sencillo Manual cabecera de ácido nucleico para la detección del Virus en muestras de sangre entera

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout the cell at specific times can be captured with fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence (IF). During lytic herpesvirus infection, the virus hijacks the host cell to preferentially express viral genes, causing changes in cell morphology and behavior of biomolecules. Lytic activities are centered in nuclear factories, termed viral replication compartments, which are discernable only with FISH and IF. Here we describe an adaptable protocol of RNA FISH and IF techniques for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV)-infected cells, both adherent and in suspension. The method includes steps for the development of specific anti-sense oligonucleotides, double RNA FISH, RNA FISH with IF, and quantitative calculations of fluorescence intensities. This protocol has been successfully applied to multiple cell types, uninfected cells, latent cells, lytic cells, time-courses, and cells treated with inhibitors to analyze the spatiotemporal activities of specific RNAs and proteins from both the human host and KSHV.

Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization FISH and Immunofluorescence IF of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells

We describe a protocol utilizing fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize multiple herpesviral RNAs within lytically infected human cells, either in suspension or adherent. This protocol includes quantification of fluorescence producing a nucleocytoplasmic ratio and can be extended for simultaneous visualization of host and viral proteins with immunofluorescence (IF).

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

Mechanistic insight arrives from careful study and quantification of specific RNAs and proteins. The relative locations of these biomolecules throughout ...

Modeling Hepatitis B Virus Infection in Non-Hepatic 293T-NE-3NRs Cells

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV models are limited to hepatoma cell lines (such as HepG2 and Huh7) overexpressing a functional HBV receptor, sodium taurocholate co-transporting polypeptide (NTCP). Here, we used 293T-NE-3NRs (293T&#160;overexpressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and HepG2-NE (HepG2 overexpressing NTCP) as model cell lines.&#160;HBV infection in these cell lines was performed either by using concentrated HBV virus particles from HepG2.2.15 or co-culturing HepG2.2.15 with the target cell lines. HBcAg immunofluorescence for HBcAg was performed to confirm HBV infection. The two methods presented here will help us study HBV infection in non-hepatic cell lines.&#160;&#160;

This manuscript describes a detailed protocol for Hepatitis B virus (HBV) infection in novel engineered 293T cells (293T-NE-3NRs, expressing human NTCP, HNF4&#945;, RXR&#945; and PPAR&#945;) and traditional hepatic cells (HepG2-NE, expressing human NTCP).

Modelado de la infección por el virus de la hepatitis B en células no hepáticas 293T-NE-3R

HBV mainly infects human hepatocytes, but it has also been found to infect extrahepatic tissues such as kidney and testis. Nonetheless, cell-based HBV ...

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, could repress the expression of outer membrane proteins. To further investigate the regulation function of micC in Salmonella Enteritidis, we cloned the micC gene in the Salmonella Enteritidis strain 50336, and then constructed the mutant 50336&#916;micC by the &#955; Red-based recombination system and the complemented mutant 50336&#916;micC/pmicC carrying recombinant plasmid pBR322 expressing micC. qRT-PCR results demonstrated that transcription of ompD in 50336&#916;micC was 1.3-fold higher than that in the wild type strain, while the transcription of ompA and ompC in 50336&#916;micC were 2.2-fold and 3-fold higher than those in the wild type strain. These indicated that micC represses the expression of ompA and ompC. In the following study, the pathogenicity of 50336&#916;micC was detected by both infecting 6-week-old Balb/c mice and 1-day-old chickens. The result showed that the LD50 of the wild type strain 50336, the mutants 50336&#916;micC and 50336&#916;micC/pmicC for 6-week-old Balb/c mice were 12.59 CFU, 5.01 CFU, and 19.95 CFU, respectively. The LD50 of the strains for 1-day-old chickens were 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, and 2.54 x 108 CFU, respectively. It indicated that deletion of micC enhanced virulence of S. Enteritidis in mice and chickens by regulating expression of outer membrane proteins.

A Non-Coding Small RNA MicC Contributes to Virulence in Outer Membrane Proteins in Salmonella Enteritidis

An &#955;-Red-mediated recombination system was used to create a deletion mutant of a small non-coding RNA micC.

Un pequeño ARN no codificante MicC contribuye a la virulencia en las proteínas de la membrana externa en Salmonella enteritidis

A non-coding small RNA (sRNA) is a new factor to regulate gene expression at the post-transcriptional level. A kind of sRNA MicC, known in Escherichia ...

Flujo de ácido nucleico cerrado Citometría de fluorescencia In situ (LNA flujo-FISH): un método para la detección de bacterias pequeñas de ARN