Los autores agradecen a los miembros anteriores y actuales del laboratorio para las contribuciones al desarrollo de la metodología descrita aquí y Alan Cochrane para el consejo. LA es un receptor de un Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) Becas de Doctorado y AJM con el apoyo de un premio a la Trayectoria Fraser, Monat y MacPherson. Este trabajo es apoyado por una beca de la CIHR (subvención # RP-56974).

1. Preparación de la sonda <ol><li> Compendio 1 ug del vector en la transcripción in vitro, pKS (+) pol 236nt 9 con Kpn1 enzima a 37 ° C durante 1 hora y ejecutar el producto de ADN linealizado en un gel de agarosa. El fragmento debe ser de aproximadamente 2500 pb. </li><li> Cortar el fragmento del gel y se purifica mediante la Roche Micro Eluir kit de extracción de gel (todos los reactivos utilizados se enumeran en la Tabla 1). Lleve a cabo la elución final en 30 l de tampón de elución. Ejecutar 5 l del producto en un gel de agarosa para comprobar la purificación. </li><li> Mezcle una reacción de transcripción in vitro (ver receta a continuación) utilizando la Roche DIG RNA kit de etiquetado y se incuba a 37 ° C durante 2 horas. </li></ol> En la reacción de transcripción in vitro: <table border="1"><tbody><tr><td> Linealizado ADN </td><td> 23 l </td></tr><tr><td> 1X DIG RNA etiquetado mezcla (Roche) </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> 1X Transcription tampón </td><td> 8 l </td></tr><tr><td> 20U RNasa OUT </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> 80U T7 ARN polimerasa </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> Total </td><td> 40 l </td></tr></tbody></table><ol start="4"><li> Añadir 228 U de DNasa I y se incuba a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Se detiene la reacción por adición de EDTA pH 8,0 a una concentración final de 20 mM. </li><li> Purificar la reacción mediante el uso de las columnas vuelta rápida de Roche como se especifica por el fabricante. </li><li> Purificar la sonda por precipitación con tratada con DEPC 1/10 volúmenes de pH 3M de NaOAc 5,2 y 2,5 volúmenes de etanol helado 95%. Mezclar e incubar a -80 ° C durante 30 min a una noche. </li><li> Centrifugar la sonda durante 15 min a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado en etanol helado al 70%. Se centrifuga de nuevo durante 5 min a 4 ° C a 15.000 x g. </li><li> Eliminar el sobrenadante y secar el precipitado. Resuspender el precipitado en 50 ul water (DNasa / RNasa libre) que contiene 10 U RNasa Invitrogen OUT. </li><li> Calcular la concentración de la sonda por espectrofotometría (ARN miden a 260 nm), y se diluye hasta una concentración de ng / l 5. Almacenar en alícuotas a -20 ° C para uso a corto plazo, o de -80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Se recomienda llevar a cabo las comparaciones inter-ensayo para la conservación de una parte alícuota de este. </li></ol> 2. La fijación de la célula <ol><li> Es importante inicialmente a las células adherentes de semillas sin tratar, sobre cubreobjetos de vidrio estériles para la confluencia final sobre la cosecha es de aproximadamente 70-80%. Para las células no adherentes, crecen de forma normal y cuando esté listo para recoger, los incuban con cubreobjetos que han sido tratados con w / v 0,01% de poli-L-lisina (Sigma-Aldrich, Inc.) durante 1 hora. Para un típico 12-así placa de poliestireno de cultivo de tejidos (3,8 cm 2), 150.000 células HeLa (por ejemplo) se sembraron en placas a 24 horas antes de la transfección. Las células no adherentes pueden ser infectadas o transfectadas como es habitual y se dejó anuncioaquí para cubreobjetos de vidrio antes de la fijación 3. </li><li> Desechar los medios de comunicación y lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1X preparada en agua doblemente destilada (DPBS) durante 1 min. Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc.)-tratado 1X PBS también se pueden utilizar, sin embargo no tratada PBS no puede ya que puede contener enzimas RNasa. </li><li> Descartar el PBS y añadir un 4% de paraformaldehído, suficiente para cubrir completamente las células. Incubar durante 15-20 min. </li><li> Deseche el paraformaldeyhyde y lavar las células con 1X DPBS durante 1 min. </li><li> Desechar los DPBS y añadir 0,1 M glicina (disuelto en 1X DPBS). Incubar durante 10 min. </li><li> Deseche la glicina y lavar las células con 1X DPBS durante 1 min. </li><li> Deseche los DPBS y añadir 0,2% de Triton-X (disuelto en 1X DPBS). Incubar durante 5-10 minutos. Si la tinción de proteínas de la envoltura nucleolares o nuclear, permeabilizar con Triton X-100 por no más de 5 min o la localización de la proteína se convertirá difusa. </li><li> Desechar Triton X-100 y se lava una vez en1X DPBS durante 1 min. </li><li> Para almacenamiento a largo plazo, sustituir PBS con 70% de etanol y se almacena a 4 ° C durante un máximo de cuatro meses. Por otra parte, se lava una vez más con 1X DPBS y proceder a pescar. </li></ol> 3. Hibridación in situ fluorescente (FISH) <ol><li> Si los cubreobjetos fueron almacenadas en etanol, sustituir el etanol con 1X DPBS y permitir que las células para rehidratar durante 30 min. La rehidratación se puede hacer durante la noche si los cubreobjetos se almacenan a 4 ° C. </li><li> Lavar los cubres con 1x DPBS durante 1 min. </li><li> Prepare las diapositivas para la incubación de los cubreobjetos, teniendo cuidado de limpiar y marcar bien. </li><li> Para un cubreobjetos de 18 mm, se añaden 50 l de solución de DNasa (25 unidades cubreobjetos, comercialmente disponibles) a la diapositiva. Añadir el cubreobjetos, asegurándose de poner de lado las células hacia abajo, y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar los cubres con 1x DPBS durante 1 min. </li><li> Añadir 50 l de mezcla de hibridación (ver receta a continuación) por cubreobjetos enun portaobjetos y se incuba el lado de células cubreobjetos fuera de servicio por 16-18 horas a 42 ° C. La incubación se debe realizar en una bandeja que contiene un 50% formamida, 2X SSPE mezcla (12,5 ml de formamida desionizada, 2,5 ml de 20X SSPE, 10 ml de agua). </li></ol> Mezcla de hibridación (para un cubreobjetos, 50 l): <table border="1"><tbody><tr><td> Cantidad de material </td><td> El material (a una concentración final) </td></tr><tr><td> 25 l </td><td> Formamida,% 50 (desionizada; cualquier fuente) </td></tr><tr><td> 5 l (de 10 mg / ml) </td><td> ARNt, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc.) </td></tr><tr><td> 5 l (de 20X) </td><td> SSPE, 2X </td></tr><tr><td> 5 l (de 50X) </td><td> Denharts, 5X </td></tr><tr><td> 0,125 l (de 5 unidades) </td><td> RNasa OUT </td></tr><tr><td> 5 l (25 ng de 5 ng / l) </td><td> Sonda </td></tr><tr><td> 5 l </td><td> H 2 O DEPC, a la finalvolumen de 50 l </td></tr></tbody></table><ol start="7"><li> Incubar cubreobjetos lado de células en 50 l de formamida al 50% (diluida en 1X DPBS) durante 15 min a 42 ° C. </li><li> Lavar dos veces los cubreobjetos en 2X SSPE, mediante su incubación lado celda hacia abajo en 50 l SSPE 2X (20X SSPE diluida en 1X DPBS) durante 5 minutos cada uno a 42 ° C. </li><li> Lavar los cubreobjetos en 1X DPBS durante 1 min. </li></ol> 4. La tinción de inmunofluorescencia <ol><li> Bloque los cubreobjetos colocándolos lado de células en 50 l solución 1X Roche bloqueo (10X solución Roche bloqueo diluida en 1X DPBS) durante 30 min. </li><li> Incubar el lado de células cubreobjetos en 50 l solución anticuerpo primario durante 1 hora a 37 ° C. Anti-DIG anticuerpos debe diluirse de acuerdo a la dirección del fabricante en 1X solución de bloqueo. Si otros anticuerpos se utilizan para teñir las proteínas, se pueden añadir a la concentración correcta siempre que todos los anticuerpos utilizados se derivan de especificación host diferenteIES. </li><li> Lavar los cubreobjetos durante 10 minutos en 1X DPBS. </li><li> Incubar el lado de células cubreobjetos en 50 l solución anticuerpo secundario durante 1 hora a 37 ° C. Alexa Fluor-anticuerpos conjugados (Invitrogen) se puede utilizar para generar una gama de colores y se utilizan en 1:500 en 1X solución de bloqueo, DPBS 1X. </li><li> Lavar los cubreobjetos dos veces durante 10 minutos cada uno en DPBS 1X. </li><li> Seque el lado de la célula cubreobjetos en papel Whatman. Asegúrese de cubrir los cubreobjetos para evitar la exposición a la luz y la decoloración. </li><li> Una vez que todo el líquido se evapora, montar los cubreobjetos sobre portaobjetos utilizando frescos 8 ImmunoMount l (Thermo Scientific, Inc.). Golpee suavemente el cubreobjetos abajo para eliminar cualquier burbuja de aire. </li><li> Aplicar esmalte de uñas a los bordes del cubreobjetos para asegurarla en su lugar. </li><li> La visualización de ARN y proteínas por técnicas de microscopía es también crítica para el éxito de esta técnica. Ajustes en el microscopio usado pueden ayudar o dificultar la visualización por lo que es clave que elajustes en el microscopio se establece correctamente y ser coherente con una muestra a otra en un experimento dado. Para los ajustes detallados de microscopía, la óptica y las combinaciones de anticuerpos por favor, vea las referencias 1,10. </li></ol> 5. Los resultados representativos Un ejemplo de virus ARN de tinción se puede ver en la Figura 2. El ARN viral del VIH-1 se ve en todo el citoplasma muestra difusamente en su mayor parte, aunque punctae citoplasmática pequeña no son infrecuentes. La especificidad puede verse comparando las células positivas a las células circundantes que muestran ninguna fluorescencia. Como se mencionó en la introducción, el VIH-1 que carece de la proteína reguladora Rev produce ARN que se mantengan en el núcleo: esto puede ser visualizado como una señal luminosa en el núcleo, y una falta de ARN señal de fluorescencia en el citoplasma. La sobreexpresión de proteínas celulares también es capaz de cambiar la distribución de los ARN virales de VIH-1. En la Figura 2 </strong&gt;, la sobreexpresión de las proteínas implicadas en el tráfico de vesículas endosomal (por ejemplo, la interacción Rab7-lisosomal de proteínas (RILP) 11 o N-terminal suprimido RILP (RILPN) 11, y las proteínas que interfieren con la función motora dineína [por ejemplo, p50/dynamitin 1, 12], interferir con la normal de estado estacionario localización del RNA genómico viral como se determina por análisis de FISH expresión RILP conduce a re-localización del RNA genómico viral a los microtúbulos organización central (COMT) 13;. RILPN dispersa tarde endosomas dentro del citoplasma debido a la incapacidad para unirse a p150 encolada del complejo dineína motor 14 y los bloques p50/dynamitin la subunidad grande de dineína motor y comunicados finales endosomas sino también el RNA genómico viral del VIH-1 y proteínas estructurales de la periferia de la célula 1 (Figura 2). La manipulación de la localización de estado estable del RNA genómico viral, un elemento clave para la capacidad de infección departículas del virus, sería la clave para el futuro desarrollo de la terapéutica. En nuestras manos, el ARN viral aparece en la celda tan pronto como 3 horas después de la transfección y la infección 10 y se convierte fácilmente observable por esta técnica de FISH por 12 horas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo del protocolo de FISH / si los compañeros de análisis. Las células se cultivaron en cubreobjetos y se fijaron con paraformaldehído. Los tratamientos de glicina y Triton X-se realizan antes de que las células son o bien utilizarse para FISH / SI o almacenado en etanol al 70% para el almacenamiento. Las células deshidratadas para el almacenamiento se rehidratan en 1X DPBS (tratada con DEPC PBS) antes de continuar con FISH / SI. Las células son tratadas con DNasa I y dejó durante la noche para hibridar con la sonda. Una vez que la hibridación es completa, las células se lavan con formamida, así como con SSPE, y un enjuague final de 1X DPBS. Solución de bloqueo se aplica a las células, seguido de incubación conlos anticuerpos primarios. Después del lavado, los anticuerpos secundarios se aplican. Dos lavados finales en 1X DPBS completar el procedimiento de tinción, donde a los cubreobjetos se secan y se montaron en portaobjetos para la imagen. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4002/4002fig2.jpg" /> Figura 2. Los resultados representativos mediante FISH / SI co-análisis. A) del VIH-1 se transfectaron en células HeLa y en algunos casos con construcciones que causan la sobreexpresión de proteínas celulares (RILP, p50/Dynamitin y RILPΔN (una supresión amino-terminal mutante)) . PESCADO / si los compañeros de análisis se llevó a cabo: el ARN se identifica en verde, ya sea con o G3BP LÁMPARA1 (rojo) para diferenciar. B) El VIH-1 se expresa en células HeLa y se recoge en diferentes puntos temporales. La expresión del ARN viral se sigue en verde, mientras que la proteína celular, hnRNP A1, se tiñe de rojo. Barras de tamaño son 10 micras. Imágenes modificadas de las referencias 1 (figuras selectas de grupo A; RILP, p50/Dynamitin y deltana RILP)y 17 (panel B).

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+mimics+of+green+fluorescent+protein.">RNA mimics of green fluorescent protein.</a> Science. 333, 642-646 (2011).</li><li>Eckhardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SNAP-tagged+derivative+of+HIV-1--a+versatile+tool+to+study+virus-cell+interactions.">A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions.</a> PLoS One. 6, e22007 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

PESCADO / si los compañeros de análisis es un método confiable para visualizar el ARN viral en las células que ahora se ha ido perfeccionando 9,15,16. En el transcurso de varios años, hemos desarrollado un método perfeccionado de la tinción de ARN. Esta técnica se puede utilizar en una amplia gama de tipos de células siempre que la sonda es específica para la diana de ARN 17. En el etiquetado de la sonda con DIG, somos capaces de visualizar el ARN mediante tinción simple. Cuando la tinción de ARN y las proteínas se combinan otras, FISH / si los compañeros de los análisis de convertirse en una poderosa herramienta para observar las estructuras celulares y localización de la proteína / RNA. La especificidad de la detección de RNA es bastante alta. Esto se ilustra en la Figura 2. En algunas de la obra original que se centró en la localización del ARN genómico viral, FISH estableció que la falta de Rev atrapado ARN viral en el núcleo 18. Dado esto, la información abundante nuevo en genómica localización del ARN viral se ha obtenido mediante el Technique indica aquí. Por sobreexpresan proteínas celulares, las poblaciones de específicas y no todo-del ARN viral puede ser obligado a localizar a las diferentes regiones de la célula. Sobreexpresión RILP, que se asemeja al fenotipo obtenido cuando hnRNP A2 se agote por siRNA en VIH-1-células que expresan 13, hace que el ARN para acumular visiblemente en el COMT. El RNA genómico viral puede ser empujada a la periferia de la célula mediante la desactivación de la proteína motora menos extremo, dineína: la sobreexpresión p50/Dynamitin o una caída de las cadenas pesadas de dineína 1 da como resultado la liberación de ARN genómico del virus de dominios intracelulares a la periferia celular ( Figura 2). Un mutante de RILP, RILPΔN, que ya no se une el motor dineína, se dispersa endosomas (marcados por LÁMPARA1) en el citoplasma, ya que ya no se activa localizada en dominios juxtanuclear. Estos resultados apuntan a la noción de una población de plástico de VIH-1 RNA genómico y, en particular, de que grupos diferentes de VIH-1 genómicoARN existen con roles a veces identificables en el ciclo de replicación viral. Estas mismas ideas ya han sido identificados para la proteína codificada por este ARNm, Gag 19. Existen limitaciones en los usos de FISH / si los compañeros de los análisis que están relacionados con la elección de anticuerpos y disponibilidad. La optimización de la mejor combinación de anticuerpos primarios y secundarios, y sus concentraciones, se necesitará tiempo para optimizar (ver Tabla 1 y 2). Anticuerpos producidos a partir de hibridomas o producidos por las grandes empresas pueden tener concentraciones que varían según el lugar de 1:2 a 1:2000, pero asegúrese de seguir las directrices proporcionadas por el fabricante para obtener mejores resultados. El huésped en la que se produce el anticuerpo también debe tomarse en consideración. Ovejas de mezcla con anticuerpos de cabra también se debe evitar en anticuerpos primarios y secundarios en esta combinación resulta en un fondo elevado debido a la cruzada de especies de reconocimiento (datos no mostrados). Para Alexa-Fluor secondary anticuerpos, la concentración puede ser utilizado en 1:500 para casi cualquier anticuerpo en el conjunto. El otro inconveniente con FISH / si los compañeros de análisis como se describe en este informe es que captura el ARN en su ubicación en el estado estacionario, después que las células han sido fijados con paraformaldehído y permeabilized y detergente (figura 1). Sin embargo, el ARN de imágenes en células vivas que se ha logrado a través de una variedad de medios de 20 a 22, en su mayoría utilizando variaciones de genomas virales de ARN que son marcadas por las proteínas fluorescentes, tales como las buenas prácticas agrarias. Sin embargo, medios adicionales para identificar la localización del ARN en células vivas siguen a la superficie. Estos nuevos métodos implican el ARN marcado por medio de la espinaca 23, 24, o SNAP mTrip 2. Estas técnicas también sufren de algunos inconvenientes, incluyendo el requisito para permeabilizar las células antes de la adición de sustratos o un resto que debe ser diseñado para etiquetar el ARNm con el fin de detectar el ARNm por microscopía. De hecho, la mayor Advantage de análisis FISH descritas en este informe reside en el hecho de que el ARN es inalterado nativo que conduce a los resultados más fisiológicamente relevantes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de 18 mm </td><td> VWR </td><td> 48380 046 </td><td></td></tr><tr><td> 16% de paraformaldehído </td><td> JT Baker </td><td> S898-07 </td><td> Para hacer 4%: disolver 20 g en 500 ml 1XDPBS a 60 ° C con 5 gotas de NaOH. el pH a 7,2 el calor y almacenar a -20 ° C. No exceder los 70 ° C! </td></tr><tr><td> Triton X- </td><td> OmniPur </td><td> 9400 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Eluir Gel Extraction Kit </td><td> Roche </td><td> D6294-02 </td><td></td></tr><tr><td> DIG RNA Etiquetado Mix </td><td> Roche </td><td> 11277073910 </td><td></td></tr><tr><td> Transcripción T7 ARN polimerasa </td><td> Invitrogen </td><td> 18033-019 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Columnas Un paseo rápido </td><td> Roche </td><td> 11814427001 </td><td></td></tr><tr><td> DNasa I </td><td> Invitrogen </td><td> 18047-019 </td><td></td></tr><tr><td> 1X DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Formamida </td><td> EMD </td><td> FX0420-8 </td><td></td></tr><tr><td> tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-021 </td><td></td></tr><tr><td> RNasa OUT </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos fluorescentes Enhancer Set para la detección DIG # 4 (solución de bloqueo) </td><td> Roche </td><td> 1768506 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor secundaria de anticuerpos </td><td> Invitrogen </td><td> Ver Tabla 2 </td><td></td></tr><tr><td> Horno de hibridación </td><td> Boekel Cienciacientífica </td><td> Modelo 24100 </td><td></td></tr><tr><td> Portaobjetos </td><td> VWR </td><td> 48300-047 </td><td></td></tr><tr><td> Immunomount </td><td> Thermoscientific </td><td> 9990402 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Identificación de los reactivos específicos y equipos <table border="1"><tbody><tr><td> Las especies de anticuerpos anti-DIG (dilución, empresa, número de catálogo) </td><td> Colores </td><td> Alexa Fluor usada (1:500) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ratón (1:500; Sigma, B7405) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 burro anti-ratón (Invitrogen, A21202) </td></tr><tr><td> rojo </td><td> Alexa Fluor 594 burro anti-ratón (Invitrogen, A21203) </td></tr><tr><td> azul </td><td> Alexa Fluor 647 burro anti-ratón (Invitrogen, A31571) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Ovejas (1:200; Roche, 11376623) </td><td> verde </td><td> Alexa Fluor 488 burro anti-oveja (Invitrogen, A11015) </td></tr><tr><td> rojo </td><td> Alexa Fluor 594 burro anti-oveja (Invitrogen, A11016) </td></tr><tr><td> azul </td><td> Alexa Fluor 647 burro anti-oveja (Invitrogen, A21448) </td></tr></tbody></table> Combinaciones Tabla 2. De secundaria de anticuerpos y anti-DIG lista con números de catálogo y de las concentraciones.

detection of viral rna by fluorescence in situ hybridization (fish)

Los virus que infectan a las células provocan cambios específicos en las funciones celulares normales que sirven para desviar la energía y los recursos para la replicación viral. Muchos aspectos de la función de la célula huésped se comandado por virus, por lo general por la expresión de productos génicos virales que reclutan proteínas de la célula huésped y maquinarias. Por otra parte, los virus orgánulos de membrana específicos de ingeniería o una etiqueta en que las vesículas celulares y las proteínas motoras para apuntar las regiones de la célula (durante la infección de novo, virus cooptar las proteínas motoras moleculares para atacar el núcleo, más tarde, durante el ensamblaje del virus, se secuestran celulares mecanismos que ayuden en el montaje de los virus). Menos aún se entiende sobre cómo los virus, en particular los que tienen genomas de ARN, coordinar el tráfico intracelular de proteínas y componentes de ARN y cómo lograr el montaje de partículas infecciosas en loci específicos en la célula. El estudio de la localización del ARN se inició en el trabajo anterior. El desarrollo de bajos em eucariotasbryos y las células neuronales proporcionan información biológica importante, y también subrayó la importancia de la localización del ARN en la programación de las cascadas de expresión génica. El estudio en otros organismos y sistemas celulares ha generado información importante similar. Los virus son parásitos obligados y deben utilizar sus células huésped para replicarse. Así, es crítico para comprender cómo los virus de ARN dirigir sus genomas de ARN a partir del núcleo, a través del poro nuclear, a través del citoplasma y en uno de sus destinos finales, en partículas de virus progenie 1. FISH sirve como una herramienta útil para identificar los cambios en el estado de equilibrio de localización del ARN viral. Cuando se combina con inmunofluorescencia (IF) el análisis de 22 de FISH / si los compañeros de análisis proporcionará información sobre la co-localización de las proteínas con el ARN viral 3. Este análisis proporciona por tanto un buen punto de partida para poner a prueba para las interacciones proteína-ARN por bioquímicos o biofísicos4,5, ya que las pruebas de co-localización por sí sola no es suficiente evidencia para estar seguro de una interacción. En el estudio de localización del ARN viral utilizando un método como este, abundante información ha sido obtenida en los dos eventos de tráfico de ARN virales y celulares 6. Por ejemplo, el VIH-1 produce ARN en el núcleo de las células infectadas pero el ARN se traduce sólo en el citoplasma. Cuando una proteína viral clave falta (Ap) 7, FISH del ARN viral, ha revelado que el bloque de la replicación viral se debe a la retención de los VIH-1 RNA genómico en el núcleo 8. A continuación, presentamos el método para el análisis visual de ARN genómico del virus in situ. El método hace uso de una sonda marcada con ARN. Esta sonda está diseñado para ser complementario al ARN genómico viral. Durante la síntesis in vitro de la sonda de ARN antisentido, la ribonucleótido que se modifica con digoxigenina (DIG) está incluido en un in vitro transcription reacción. Una vez que la sonda ha hibridado con el objetivo de ARNm en las células, las etapas subsiguientes de etiquetado de anticuerpos (Figura 1) revelará la localización del mRNA, así como proteínas de interés cuando se realiza PESCADO / SI.

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Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Un fluorescencia<em&gt; In situ</emLa hibridación&gt; (FISH) método fue desarrollado para detectar visualmente ARN genómico del virus utilizando microscopía de fluorescencia. Una sonda se hace con especificidad para el ARN viral que luego pueden ser identificados utilizando una combinación de hibridación y técnicas de inmunofluorescencia. Esta técnica ofrece la ventaja de identificar la localización del ARN viral o ADN en estado estacionario, el suministro de información sobre el control de eventos intracelulares de virus trata de personas.

La detección de ARN viral por fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fish

Research

JoVE Journal

Biology

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

38.4K vistas.  Sir Mortimer B. Davis Jewish General Hospital. Un fluorescencia In situ (FISH) método fue desarrollado para detectar visualmente ARN genómico del virus utilizando microscopía de fluorescencia. Una sonda se hace con especificidad para el ARN viral que luego pueden ser identificados utilizando una combinación de hibridación y técnicas de inmunofluorescencia. Esta técnica ofrece la ventaja de identificar la localización del ARN viral o ADN en estado estacionario, el suministro de inf...

Video: Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescencia In situ</emHibridación> (FISH) Protocolo en el esperma humano

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Investigación

Biología

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence (T7, T3, SP6) and the gene to be transcribed (Figure 1A). A typical transcription reaction consists of the template DNA, RNA polymerase, ribonucleotide triphosphates, RNase inhibitor and buffer containing Mg2+ ions.
Large amounts of high quality RNA are often required for a variety of applications. Use of in vitro transcription has been reported for RNA structure and function studies such as splicing1, RNAi experiments in mammalian cells2, antisense RNA amplification by the "Eberwine method"3, microarray analysis4 and for RNA vaccine studies5. The technique can also be used for producing radiolabeled and dye labeled probes6. Warren, et al. recently reported reprogramming of human cells by transfection with in vitro transcribed capped RNA7. The T7 High Yield RNA Synthesis Kit from New England Biolabs has been designed to synthesize up to 180 &mu;g RNA per 20 &mu;l reaction. RNA of length up to 10kb has been successfully transcribed using this kit. Linearized plasmid DNA, PCR products and synthetic DNA oligonucleotides can be used as templates for transcription as long as they have the T7 promoter sequence upstream of the gene to be transcribed.
Addition of a 5' end cap structure to the RNA is an important process in eukaryotes. It is essential for RNA stability8, efficient translation9, nuclear transport10 and splicing11. The process involves addition of a 7-methylguanosine cap at the 5' triphosphate end of the RNA. RNA capping can be carried out post-transcriptionally using capping enzymes or co-transcriptionally using cap analogs. In the enzymatic method, the mRNA is capped using the Vaccinia virus capping enzyme12,13. The enzyme adds on a 7-methylguanosine cap at the 5' end of the RNA using GTP and S-adenosyl methionine as donors (cap 0 structure). Both methods yield functionally active capped RNA suitable for transfection or other applications14 such as generating viral genomic RNA for reverse-genetic systems15 and crystallographic studies of cap binding proteins such as eIF4E16.
In the method described below, the T7 High Yield RNA Synthesis Kit from NEB is used to synthesize capped and uncapped RNA transcripts of Gaussia luciferase (GLuc) and Cypridina luciferase (CLuc). A portion of the uncapped GLuc RNA is capped using the Vaccinia Capping System (NEB). A linearized plasmid containing the GLuc or CLuc gene and T7 promoter is used as the template DNA. The transcribed RNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity. Capped CLuc RNA is used as the internal control to normalize GLuc expression.

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

This method describes high yield in vitro synthesis of both capped and uncapped mRNA from a linearized plasmid containing the Gaussia luciferase (GLuc) gene. The RNA is purified and a fraction of the uncapped RNA is enzymatically capped using the Vaccinia virus capping enzyme. In the final step, the mRNA is transfected into HeLa cells and cell culture supernatants are assayed for luciferase activity.

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

Todo el monte ARN fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

Marine elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity and have unique mechanisms for osmoregulation 1-3. As the most primitive living jawed-vertebrates with paired appendages, elasmobranchs are an evolutionarily important model, especially for studies in evolution and development. Marine elasmobranchs have also been used to study aquatic toxicology and stress physiology in relationship to climate change 4. Thus, development and adaptation of methodologies is needed to facilitate and expand the use of these primitive vertebrates to multiple biological disciplines. Here I present the successful adaptation of RNA whole mount in situ hybridization and histological techniques to study gene expression and cell histology in elasmobranchs.
Monitoring gene expression is a hallmark tool of developmental biologists, and is widely used to investigate developmental processes 5. RNA whole mount in situ hybridization allows for the visualization and localization of specific gene transcripts in tissues of the developing embryo. The expression pattern of a gene's message can provide insight into what developmental processes and cell fate decisions a gene may control. By comparing the expression pattern of a gene at different developmental stages, insight can be gained into how the role of a gene changes during development.
While whole mount in situ's provides a means to localize gene expression to tissue, histological techniques allow for the identification of differentiated cell types and tissues. Histological stains have varied functions. General stains are used to highlight cell morphology, for example hematoxylin and eosin for general staining of nuclei and cytoplasm, respectively. Other stains can highlight specific cell types. For example, the alcian blue stain reported in this paper is a widely used cationic stain to identify mucosaccharides. Staining of the digestive tract with alcian blue can identify the distribution of goblet cells that produce mucosaccharides. Variations in mucosaccharide constituents on short peptides distinguish goblet cells by function within the digestive tract 6. By using RNA whole mount in situ's and histochemical methods concurrently, cell fate decisions can be linked to gene-specific expression.
Although RNA in situ's and histochemistry are widely used by researchers, their adaptation and use in marine elasmobranchs have met limited and varied success. Here I present protocols developed for elasmobranchs and used on a regular basis in my laboratory. Although further modification of the RNA in situ's hybridization method may be needed to adapt to different species, the protocols described here provide a strong starting point for researchers wanting to adapt the use of marine elasmobranchs to their scientific inquiries.

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

By combining methods for RNA whole mount in situ hybridization and histology, gene expression can be linked with cell fate decisions in the developing embryo. These methods have been adapted to marine elasmobranchs and facilitate the use of these animals as model organisms for biomedical, toxicology and comparative studies.

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

ADN-ARN combinado fluorescente<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación (FISH) para el Estudio de inactivación del cromosoma X en las células madre embrionarias de ratón Diferenciada Mujer

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell level to detect the spatial dynamics of RNA localization with simultaneous insight into the localization of proteins, epigenetic modifications and other details which can be highlighted by immunofluorescence. X-chromosome inactivation is a paradigm for long non-coding RNA (lncRNA)-mediated gene silencing. X-inactive specific transcript (Xist) lncRNA accumulation (called an Xist cloud) on one of the two X-chromosomes in mammalian females is a critical step to initiate X-chromosome inactivation. Xist RNA directly or indirectly interacts with various chromatin-modifying enzymes and introduces distinct epigenetic landscapes to the inactive X-chromosome (Xi). One known epigenetic hallmark of the Xi is the Histone H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) modification. Here, we describe a simple and quick immuno-FISH protocol for detecting Xist RNA using RNA FISH with multiple oligonucleotide probes coupled with immunofluorescence of H3K27me3 to examine the localization of Xist RNA and associated epigenetic modifications. Using oligonucleotide probes results in a shorter incubation time and more sensitive detection of Xist RNA compared to in vitro transcribed RNA probes (riboprobes). This protocol provides a powerful tool for understanding the dynamics of lncRNAs and its associated epigenetic modification, chromatin structure, nuclear organization and transcriptional regulation.

Quick Fluorescent In Situ Hybridization Protocol for Xist RNA Combined with Immunofluorescence of Histone Modification in X-chromosome Inactivation

We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.

Fluorescente Rápida<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación para Xist ARN combinado con inmunofluorescencia de histona Modificación de inactivación del cromosoma X.

Combining RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) with immunofluorescence (immuno-FISH) creates a technique that can be employed at the single cell ...

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly effective at mapping highly repetitive sequences to heterochromatic regions, where computational approaches face prohibitive challenges. Here we describe a streamlined protocol for DNA ISH that circumvents formamide washes that are standard steps in other DNA ISH protocols. Our protocol is optimized for hybridization with short single strand DNA probes that carry fluorescent dyes, which effectively mark repetitive DNA sequences within heterochromatic chromosomal regions across a number of different insect tissue types. However, applications may be extended to use with larger probes and visualization of single copy (non-repetitive) DNA sequences. We demonstrate this method by mapping several different repetitive sequences to squashed chromosomes from Drosophila melanogaster neural cells and Nasonia vitripennis spermatocytes. We show hybridization patterns for both small, commercially synthesized probes and for a larger probe for comparison. This procedure uses simple laboratory supplies and reagents, and is ideal for investigators who have little experience with performing DNA ISH.

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Método simple de ADN de fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación a los cromosomas aplastado

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

La detección de las proteínas de unión a ARN por<em&gt; In Vitro</em&gt; ARN desplegable de adipocitos Cultura

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...