We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.

Todos los animales fueron manejados en plena conformidad con los reglamentos daneses y europeos. Número de Permiso: 2012-15-2934. 1. Preparación de la jeringuilla por extrusión hidráulica de la Médula Espinal <ol><li> Para una rata adulta, utilice una jeringa de 10 ml. Para un ratón adulto, utilizar una jeringa de 5 ml. Para los cachorros, utilice una jeringa de 2,5 ml. </li><li> Ajuste una punta de pipeta no universalmente filtro adecuado para 2-200 pipetas mu L por el recorte de la gran final de la punta de la pipeta hasta que se ajuste firmemente a la jeringa. Coloque la punta de la pipeta ajustada en la jeringa. Para los cachorros, utilizar una aguja de 23 G o similar en lugar de una punta de pipeta ajustada. </li><li> Aspirar PBS estéril y dejar la jeringa en hielo hasta su uso posterior en frío de hielo. </li></ol> 2. La eutanasia <ol><li> No realice dislocación cervical, ya que esto perturbe la columna vertebral representación de extrusión imposible. </li><li> Para el adulto de rata / ratón, la eutanasia usando gas tal como CO2 o isofluRane. Estas sustancias son dañinas. Realizar la eutanasia en una campana de humos y manejar las sustancias de acuerdo con directrices de la institución. (PRECAUCIÓN: CO 2: H280, P410, P403; isoflurano: H361d, P260, P281, P280) <ol><li> Para asegurarse de que el roedor está muerto, garantizar la ausencia de reflejo pellizcando una pata con pinzas. Decapitar al roedor usando tijeras grandes. Para los cachorros, la eutanasia por decapitación. </li></ol></li></ol> 3. Aislamiento de la columna vertebral <ol><li> Espolvorear agua sobre la piel para controlar el cabello. </li><li> El uso de un par de tijeras, corte abierto la piel a lo largo de la columna vertebral en una dirección distal y aislar la columna vertebral mediante el corte en ambos lados a lo largo de la columna vertebral más allá del hueso de la pelvis. Cortar la médula espinal distal al hueso pélvico con un par de tijeras. NOTA: El eje rostral-caudal se denota como el eje proximal-distal durante todo el protocolo. <ol><li> Recorte de la columna vertebral con un par de tijeras para evitar la proximal-más y más distal áreas, ya que pueden hacer que la columna vertebral también en forma de S para el éxito de la extrusión de la médula espinal. Asegúrese de que la médula espinal es visible en ambos extremos. Si la médula espinal no es visible, el asiento de la columna vertebral con tijeras hasta la médula espinal se hace visible. </li></ol></li></ol> 4. hidráulica de extrusión de la Médula Espinal <ol><li> Colocar una placa de Petri (100 mm de diámetro) lleno de PBS estéril en hielo. </li><li> Enderezar la columna vertebral mediante la aplicación de un dedo índice en la parte doblada (extremo más proximal) de la columna vertebral, enderezando de ese modo la columna vertebral lo más posible. <ol><li> Para cachorros, evitar doblar la columna vertebral, como las vértebras se interrumpirá la prestación de extrusión de la médula espinal imposible. </li></ol></li><li> Insertar la punta de la pipeta (23 G aguja para cachorros, de forma alternativa 18 de la aguja G para ratones adultos) en el extremo más distal de la columna vertebral. Si se inserta correctamente, la punta se estabiliza en la cavidad de la médula. </li><li> Asegúrese de que la columna vertebral se endereza tanto como sea posible. Aplique una presión constante, y la extrusión de la médula espinal en la placa de Petri en el hielo. Asegúrese de que la médula espinal se mantiene húmedo en hielo por mantenerla en PBS hasta su posterior manipulación. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" /> Figura 1: médulas espinales representativos. Hidráulicamente extruido médula espinal. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón. ampliaciones lumbares marcados por caja. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. Identificación de los ganglios de la raíz dorsal (GRD) <ol><li> Dividir la columna vertebral en dos partes longitudinales iguales utilizando tijeras y colocar la columna vertebral de división bajo el microscopio. </li><li> Identificar el segmento T13 vértebra a<html> localizar el sitio de unión de la más distal costillas sobre la columna vertebral prestar atención para no confundir la costae con los nervios intercostales cercanas. Los más distal costae están unidos a la parte proximal del segmento vértebra T13 y el T13 DRG está situado distalmente a T13 vértebra y proximalmente a la vértebra L1. </li><li> Identificar los GRD concomitantes en la dirección distal. Para una rata adulta, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para un ratón adulto, GRD concomitantes aparecen de color blanco con dorsal claramente visible y las raíces ventrales. Para los cachorros, los GRD concomitantes aparecen como esferas claras. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" /> Figura 2: Identificación de los GRD en la columna vertebral después de la extrusión de la médula espinal. La columna vertebral se ha dividido que permite la visualización de los GRD, como se indica por las flechas. Ejemplificado por rata adulta y la cría de ratón.<html> ref = objetivo &quot;http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. Aislamiento de los GRD <ol><li> Platos Número de Petri (30 mm de diámetro) de acuerdo con los GRD específicos a ser aislados, por ejemplo, L3, L4, L5. Llenar las cajas de Petri con helado de PBS estéril y colocarlos en hielo. </li><li> Con unas tijeras micro, dorsal y cortar las raíces ventrales tan cerca de los GRD como sea posible para liberarlos, evitando dañar los GRD. </li><li> Con la punta de las pinzas cerradas, suavemente sáquele GRD y transferirlos a las placas de Petri numeradas correspondientes. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" /> Figura 3: Representante aislado GRD. De izquierda a derecha: rata adulta, ratón adulto, cría de ratón.&quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 7. Tratamiento de tejidos para su posterior análisis <ol><li> Western Blot <ol><li> Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación. Si es necesario, separar la médula espinal en ipsilateral y contralateral partes y más en la dorsal y ventral cuernos. </li><li> Coloque el tejido en tampón de lisis tal como tampón TNE de lisis (10 mM Tris-base, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP40 en bidestilada H 2 O) que contiene inhibidores de la enzima apropiados sobre hielo. </li><li> Homogeneizar el tejido durante aproximadamente 30 s en hielo usando una mano de mortero de molienda mecánica. </li><li> Centrifugar durante 15 min a 16.000 xg a 4 ° C y utilizar el sobrenadante para su posterior procesamiento de acuerdo con protocolos estándar 5, 6 o mantener el sobrenadante a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li><li> RNA-análisis <ol><li> Aislar el tejido de interés. </li><li> Colocar inmediatamente el tejido en una solución de estabilización de ARN para estabilizar el ARN para el almacenamiento. </li><li> Aislar ARN de acuerdo con protocolos estándar 7. </li><li> Convertir RNA a cDNA y realizar qPCR acuerdo con protocolos estándar 7. </li></ol></li><li> La inmunohistoquímica <ol><li> Para tejido fresco congelado (aplicable a la médula espinal): <ol><li> Preparar polvo de hielo seco pulverizando los cubos de hielo seco a una cantidad correspondiente a dos cucharadas de polvo. Cubra cubos de hielo seco en un paño y pulverizar los cubos con un martillo. Coloque la hoja de plata (aproximadamente 5 cm x 5 cm) sobre una capa de cubos de hielo seco y cubrir la hoja de plata con el polvo de hielo seco. </li><li> Coloque el área de la médula espinal seleccionado para profundizar el análisis sobre el polvo de hielo seco con unas pinzas, se deja complemento de congelación, y la transferencia de la médula espinal a un tubo criogénico. Mantener en hielo seco en todo momento o almacenarla a -80 ° C hasta auxílianosmi. </li><li> La transferencia de la médula espinal para un criostato (-20 ° C). Si es necesario, cortar la médula espinal dentro del criostato. Coloque la médula espinal en el interior del material aglomerante criostato con el fin de adjuntarlo a la platina. </li><li> Cortar la médula espinal en el espesor deseado, por ejemplo, 5 m, y recoger sobre placas de vidrio. Calentar las placas de vidrio con un dedo inmediatamente antes de la recogida de tejidos para un mejor agarre. Mantenga cualquier tejido sobrante en tubos criogénicos a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Deje las secciones sobre placas de vidrio en el interior del criostato hasta que esté listo para la post-fijación. </li><li> Post-fijar las secciones por inmersión en 4% PFA durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8. </li></ol></li><li> tejido fijado para la sección crio (aplicable a la médula espinal y los GRD) <ol><li> Fijar la médula espinal y los GRD en PFA al 4% (2 h de la médula espinal, 1,5 h para GRD ratón y 4 h de GRD de rata) a4 ° C (lugar de la médula espinal en posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada). </li><li> Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior. Si es necesario, recortar la médula espinal para compensar la ampliación lumbar solamente en un tablero de silicona o similar. </li><li> Con la punta de una toalla de papel, aspirar el exceso de solución de sacarosa a partir del tejido. </li><li> Llenar hasta la mitad un molde crio con material aglomerante. Empuje las burbujas a los lados del molde crio con herramientas tales como pinzas cerradas. </li><li> Coloque el tejido en el material de incrustación con unas pinzas y garantizar la orientación tejido deseado. </li><li> Llenar el molde crio completamente con el material de incrustación y empujar las burbujas tan lejos de los tejidos como sea posible (por ejemplo, usando pinzas cerradas). </li><li> Llene una placa de Petri (100 mmde diámetro) con 2-metilbutano. Esta sustancia es perjudicial. Realice este paso en una campana de humos y manejar la sustancia de acuerdo con directrices de la institución (PRECAUCIÓN: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304 / P340, P309 / P310). </li><li> Coloque la placa de Petri sobre una capa de hielo seco y añadir dos cubos de hielo seco a la placa de Petri. Coloque el molde crio en la placa de Petri y permitir que el material de incrustación para congelar completamente. </li><li> Mantener el tejido embebido en hielo seco en todo momento o a -80 ° C envueltos en Parafilm hasta su posterior procesamiento. </li><li> Cortar el tejido en un criostato (-20 ° C) en el espesor deseado, por ejemplo 5 m. </li><li> Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8. </li></ol></li><li> tejido fijado para la inclusión en parafina (aplicable a la médula espinal y los GRD) <ol><li> Fijar la médula espinal y los GRD en 4% PFA (2 h para la médula espinal, 1,5 h para GRD de ratón y de 4 h de GRD de rata) a 4 ° C (lugar de la médula espinalen posición horizontal para evitar que se fijan en una posición doblada). </li><li> Transferir el tejido a 25% w / v de sacarosa durante la noche a 4 ° C. El tejido puede almacenarse en 25% w / v de sacarosa complementado con algunas gotas de azida de sodio al 10% para evitar la contaminación microbiana a 4 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Aislar el área de tejido de interés, por ejemplo, la médula espinal lumbar de la ampliación. </li><li> Llenar hasta la mitad un molde de inclusión con parafina. </li><li> Enfriar el molde brevemente la incrustación colocándolo en la zona de refrigeración de la máquina de incrustación para endurecer la parafina ligeramente. Esto permite un mejor posicionamiento de los tejidos. </li><li> Coloque el tejido en la orientación deseada en el molde de inclusión. Llenar el molde de inclusión con parafina y enfriar inmediatamente. </li><li> Coloque el molde de inclusión en parafina que contiene a 4 ° C durante la noche para dejar que se endurezca por completo y retire el bloque de parafina que contiene el tejido del molde de inclusión. </li><li> secciones de corte omicrotomo na en el espesor deseado, por ejemplo 5 m. </li><li> Realizar la tinción de acuerdo con protocolos estándar de 8. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity.">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82 (2016).</li><li>Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice.">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li><li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord.">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li><li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblot+analysis.">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay.">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014)</li><li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Nervous System. , 424-426 (2012).</li><li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy:+implications+for+studies+of+neuropathic+pain.">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li><li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice.">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li><li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+electrophysiology.">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li><li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy.">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Si se altera la columna vertebral, por ejemplo, por dislocación cervical, la médula espinal se dividirá durante la extrusión. Si la médula espinal no se puede extruir, la columna vertebral puede ser recortado ligeramente en ambos extremos y el intento de extrusión se puede repetir. En caso de que se necesita toda la médula espinal para su posterior análisis, es decir, que consiste en la ampliación de cuello uterino, así como la ampliación lumbar, la columna vertebral sólo debe ser recortado ligeramente. Si sólo se necesita la ampliación lumbar para su posterior análisis, la médula espinal se debe ajustar de acuerdo con el presente protocolo. La columna vertebral debe enderezarse usando las yemas de los dedos para facilitar la extrusión. El protocolo es aplicable a los roedores de todas las edades y es aquí ejemplificado por un ratón adulto (8 semanas), una cría de ratón (5 días) y una rata adulta (10 semanas). Dependiendo del tipo de animal y la tensión, el número de secciones torácica y lumbar puede variar 9, </sup&gt; 10, 11. Dependiendo de las proteínas a analizar, roedores adultos pueden ser perfundidos con soluciones de inhibidores de enzimas antes de la eutanasia. Si se realiza un experimento con lesión del nervio unilateral, la médula espinal se puede dividir en los lados ipsilaterales y contralaterales utilizando pinzas ultra-finas inmediatamente después de la extrusión. Además, cada lado se puede dividir en lados dorsal y ventral. El tejido puede ser procesada para análisis adicionales, por ejemplo, transferencia Western. Transcardial perfusión-fijación con PFA antes de la extrusión de la médula espinal debe evitarse, ya que esto hace que la médula espinal no flexible y evita cable de extrusión hidráulica espinal. Hidráulica de extrusión de la médula espinal será arrancar las raíces dorsales. Para los experimentos en los adjuntos raíces dorsales son necesarias, se recomienda laminectomía. Además, meninges espinales se pierden por extrusión hidráulica, que se puede evitar mediante laminectomía estándar extrusión hidráulica de la médula espinal y el aislamiento DRG también podría llevarse a cabo utilizando oxigenado líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) en lugar de PBS enfriado en hielo. El uso de ACSF permite la conservación del tejido aislado en un mejor entorno fisiológico, que es particularmente importante en el caso de registros electrofisiológicos posteriores 12, 13. Una alternativa a ACSF podría ser PBS que contiene 1 g / l de glucosa para la generación de cultivos de DRG primaria 14. extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, lo que reduce el tiempo de manipulación de tejido y por lo tanto reducir el riesgo de daño a las proteínas. La perfusión con un fijador antes de aislar de la médula espinal por laminectomía puede reducir el riesgo de daños en los tejidos durante la disección y durante la extracción final de lade la médula espinal de la columna vertebral. Sin embargo, la fijación del tejido se opone a su aplicabilidad a los análisis, tales como transferencia Western. Los rendimientos de extrusión hidráulicas estructuralmente tejido intacto 3 adecuado para una gama más amplia de análisis. la definición constante de los GRD puede ser difícil. Sin embargo, esto es esencial para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente. La tinción de tejido de la médula espinal, así como de los GRD se puede optimizar mediante la realización de las variaciones de tratamiento de tejido ilustradas descritas en el paso 7 de protocolo.

El objetivo general de este método consiste en aislar la médula espinal, así como para identificar y aislar los GRD 1, 2. Extrusión hidráulica de la médula espinal es un método significativamente más rápido que la forma tradicional de aislamiento de la médula espinal por laminectomía, es decir, romper la columna vertebral de una en una, y este método reduce el riesgo de daño tisular causado por el proceso de disección de 3, 4 . GRD puede ser difícil de identificar. La identificación correcta es muy importante para el análisis de tejido, por ejemplo después de una lesión del nervio ciático. Al numerar los GRD de acuerdo con su localización con respecto a la costillas, los GRD se pueden identificar de forma coherente. Tejido aislado por las técnicas demostradas aquí se puede aplicar a una amplia gama de análisis, incluyendo transferencia de Western 5,6, 7 y qPCR tinción inmunohistoquímica 8. Cuando la identificación de los GRD, es importante tener en cuenta que el número de segmentos de la médula espinal se sabe que varían con el tipo de animal y tensión 9, 10, 11. Las ventajas en la realización de este método en los ratones son el elevado número de variantes modificadas genéticamente disponibles y los gastos relativamente bajos de vivienda. Las ventajas de usar las ratas son el rendimiento tejido relativamente alta y si la participación de las lesiones nerviosas, el procedimiento se aliviaron con el tamaño.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 14084-08</td>
			<td>For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td># 5427 R</td>
			<td>For centrifugation of homogenized tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># CM 3050 S</td>
			<td>For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 3</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11231-30</td>
			<td>For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont, # 5</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 11252-20</td>
			<td>For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 %</td>
			<td>Abbott</td>
			<td># 002185</td>
			<td>For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane GPR rectapur</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 24872.298</td>
			<td>For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># RM 2155</td>
			<td>For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax pellets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 76243</td>
			<td>For paraffin embedding; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin tissue embedding station</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td># EG1160</td>
			<td>For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestel, motor cordless</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># Z359971-1EA</td>
			<td>For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 35 mm</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td># 121V</td>
			<td>For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 100 mm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># P7741</td>
			<td>For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor, Phosstop</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 04906845001</td>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, 1-200 &#956;l, no filter</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td># 70.1189.105</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor, Complete</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># 05892791001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td># R0901</td>
			<td>For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rneasy Protect Mini KiT</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td># 74124</td>
			<td>For RNA isolation; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td># REF0203</td>
			<td>For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge</td>
			<td>Bochem</td>
			<td># 4070</td>
			<td>For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors, 130 mm cutting edge</td>
			<td>Hounisen</td>
			<td># 1902.0130</td>
			<td>For isolation of spinal cord (adult rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge</td>
			<td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td>
			<td># 15009-08</td>
			<td>For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml</td>
			<td>Terumo</td>
			<td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x</td>
			<td>Leica</td>
			<td># 10446370</td>
			<td>Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile PBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td># 10010-015</td>
			<td>For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 23 G x 1&#34;, 0.6 x 25 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-2325R</td>
			<td>For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm</td>
			<td>Terumo Neolus</td>
			<td># NN-1838S</td>
			<td>Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>Sakura</td>
			<td># 4583</td>
			<td>Tssue embedding material for later cryosectionning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNE-lysis buffer</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td># 10128-582</td>
			<td>For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hydraulic extrusion of the spinal cord and isolation of dorsal root ganglia in rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Médulas espinales hidráulicamente extruidos presentan una superficie lisa sin daños muestra en la Figura 1. La ampliación lumbar puede ser fácilmente identificado como el área engrosada de la médula espinal, encajonado en la Figura 1. Los lados dorsal y ventral de la médula espinal pueden ser identificados por los ojos de acuerdo con la morfología. En la Figura 1, el lado ventral se enfrenta al espectador, identificable por una línea media clara a lo largo de toda la médula espinal. Dos líneas más generales a lo largo de la médula espinal permiten la identificación de la cara dorsal. En el extremo más distal, la cola de caballo a veces puede permanecer unido en ratas adultas y ratones adultos. GRD individuales sólo pueden ser identificados mientras se encuentra en la columna vertebral, la Figura 2. Después del aislamiento, la Figura 3, los GRD individuales no pueden ser identificados por la apariencia. Si es necesario, es por lo tantoimportante mantenerlos claramente separados tras el aislamiento. Después del aislamiento, la médula espinal y los GRD pueden ser procesados y se tiñeron como se indica en el paso 7.3 y representado en la Figura 4. La figura 4a muestra una tinción inmunohistoquímica de una sección donde los DRG neuronas y células gliales sus alrededores satélite son claramente visibles. Por la correcta identificación del DRG es posible analizar el efecto de las lesiones del nervio ciático en el soma de la neurona lesionada, así como en sus células gliales satélite circundante. La figura 4b muestra una tinción de Nissl de una médula espinal hidráulicamente extruido en el que el tejido está intacto como se refleja por los bordes lisos de la sección. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" /> Figura 4: secciones de tejido representativas. A. La tinción inmunohistoquímica de la sección DRG. B. Nissl manchadas sección de la médula espinal hidráulicamente extruido. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

47.7K vistas.  Aarhus University. Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage. 

Video: Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Inmunoprecipitación de la cromatina de los tejidos ganglios de la raíz dorsal después de una lesión axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Medición de la columna vertebral presináptica inhibición en ratones mediante la raíz dorsal de grabación Potencial<em&gt; En Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Aislamiento y Cultura de Neuronas de la Médula Espinal de Ratones Neonatales

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imágenes de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial primaria usando Thy1-ratones transgénicos GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Aislamiento de los ganglios de raíz dorsal y en cultivo primario para el estudio de liberación de neurotransmisor

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Aislamiento rápido de macrófagos de ganando de raíz dorsal

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Extrusión hidráulica de la médula espinal y aislamiento de los ganglios de la raíz dorsal en roedores

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