Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Heart and Stroke Foundation de BC &amp; Yukon (JCC).

Todos los protocolos en este estudio fueron revisados ​​y aprobados por el comité de ética del cuidado de animales de la Universidad Simon Fraser. Uso Balb / CYJ (H2 d) los ratones donantes y / 6 ratones (H2 b) receptores C57Bl para examinar las reacciones alogénicos. Los ratones se utilizan para los experimentos entre las edades de 8 a 12 semanas. Utilice los ratones, ya sea hombre o mujer. Controles singénicos consisten en segmentos aórticos de ratones C57BL / 6 donantes en ratones C57BL / 6 destinatarios. 1. donante y el receptor Preparación Nota: Tanto el donante y el receptor son anestesiados y preparados antes de la cirugía para minimizar la isquemia del injerto. Anestésicos inyectables se utilizan en el protocolo para evitar la obstrucción del animal por el equipo necesario para la entrega de los anestésicos inhalados. Sin embargo, si se desea, anestésico inhalado es una alternativa apropiada. A partir de la inyección inicial de los anestésicos, todo el procedimiento dura aproximadamente 90 min para completar. Tiempo de isquemia del injerto es menos than 30 min. <ol><li> Anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) y xilazina (10 mg / kg; 1 mg / ml). El ratón será sedado dentro de 10 a 15 min. Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la parte grasa de la almohadilla de la pata animal. Administrar un tercio de la dosis original del cóctel anestésico, según sea necesario, hasta que el animal no presenta reflejo de retirada. Monitorear la frecuencia respiratoria de cerca después se administra cada cóctel. Durante la cirugía, evaluar el nivel de anestesia cada 15 min pellizcando la pared abdominal anterior con un par de fórceps. Los ratones debe permanecer profundamente anestesiado durante 60 a 90 min. </li><li> Lubrique los ojos del ratón con una pomada oftálmica para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> Afeitarse el pelo tan cerca de la piel como sea posible en la región ventral del abdomen de la mitad del tórax hasta el pubis. Tenga especial cuidado de no nick cualquier piel. No utilice crema depilatoria, ya que puede ser absorbida inPara la piel y puede ser inflamatoria. </li><li> Colocar el animal en posición supina sobre una toalla encima de la mesa de la calefacción o almohadilla. </li><li> Limpie el sitio de la cirugía con un exfoliante preliminar con 2% de clorhexidina. Prepare un área de trabajo grande para maximizar el campo quirúrgico. Iniciar fregar en el centro de la zona quirúrgica y mover hacia el exterior de una manera lineal o circular. Deseche la gasa. Repita este procedimiento al menos 5 veces más. Aplique una almohadilla con alcohol a la misma área. Una vez que el alcohol es seco, preparar el área limpia con una solución de Betadine y la caída con una gasa estéril. </li></ol> 2. Procedimiento de extremo a extremo anastomosis <ol><li> Donantes de Operación <ol><li> Mantener una técnica aséptica durante toda la operación. Limpie todas las superficies de la encimera y mesa quirúrgica con solución de peróxido de hidrógeno acelerado 0,5% antes de su uso. Envuelva y autoclave todos los instrumentos quirúrgicos, gasas, cortinas y vestidos antes de su uso. Verifique la esterilidad de los instrumentos con un vaportira indicadora esterilizador colocado en cada paquete. Guantes quirúrgicos estériles se utilizan y eliminarse entre cirugías. Para múltiples cirugías, esterilizar los instrumentos quirúrgicos entre los usos con el esterilizador de cuentas de vidrio caliente. </li><li> Coloque el ratón donante en una posición supina sobre una tabla limpia, delgada Plexiglas envuelto con paño estéril bajo el microscopio de operación con una ampliación de 8-30X. </li><li> Después de asegurarse de anestesia quirúrgica adecuadas tal como se indica en la sección 1.1, proceder con la cirugía. </li><li> Con unas tijeras estériles, hacer una sola línea media inferior incisión abdominal longitudinal, desde el pubis hasta el proceso xifoides. </li><li> Usando un pequeño retractor, abra las paredes abdominales para exponer la cavidad. </li><li> El uso de algodón estéril con punta aplicadores, retraer con suavidad los intestinos superiormente al animal de izquierda y cubrir con una gasa humedecida con solución salina. Mueva los órganos reproductivos inferior y localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior (VCI). Moisdiez los tejidos expuestos periódicamente con solución salina. </li><li> Usando los fórceps No. médica 5, separar la aorta de la IVC, desde el nivel de la arteria renal izquierda a la bifurcación. Utilice 10-0 suturas de monofilamento de poliamida para ligar las ramas pequeñas cerca de la aorta. </li><li> Una vez aorta del donante se ha separado de la IVC, saturar el recipiente con solución salina, cubrir la cavidad expuesta con una gasa humedecida y establecer el donante a un lado en un área estéril. Compruebe el estado del donante (respiratoria y la función cardiovascular, y la profundidad de la anestesia) cada 15 minutos. Comenzará a operar en el destinatario, aislar la aorta, como se describe a continuación (Pasos 2.2.1 a 2.2.7). </li><li> Una vez que la aorta destinatario se ha separado de la VCI y dejar de lado, devuelva el donante en el microscopio. Cross abrazadera (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta de donantes, aproximadamente 5 mm aparte, con dos pinzas microvasculares 4 mm. </li><li> Utilizando los microtijeras Vannas-Tübingen,seccionar un segmento de injerto pequeña (3 a 4 mm de longitud) de la aorta abdominal. </li><li> El uso de un 25 G 5/8 aguja unida a una jeringa, lave la aorta extirpada con heparinizada (100 U / ml) solución salina. Asegúrese de que la punta de la aguja no entra en contacto con el buque. </li><li> Coloque aorta en heparinizada (100 U / ml) de solución salina en el hielo y dejar de lado. Si bien todavía bajo anestesia profunda, suelta las pinzas microvasculares. La eutanasia del donante por desangramiento. </li><li> Implante el buque cedente dentro de los 30 min de la escisión. Aunque es posible usar un recipiente de donante para varios destinatarios mediante la escisión de una longitud mayor de aorta, mantener el tiempo de isquemia a menos de 30 min. </li></ol></li><li> Operación Receptor <ol><li> Mantener una técnica aséptica durante toda la operación, como en la operación de los donantes. </li><li> Coloque el ratón receptor en una posición supina sobre una tabla delgada Plexiglas envuelto con paño estéril bajo el microscopio de operación con una ampliación de 8-30X. </li><li> After asegurar una anestesia adecuada, proceder con la cirugía cuando el animal no presenta reflejo de retirada. </li><li> Con unas tijeras estériles, hacer una sola línea media inferior incisión abdominal longitudinal, desde el pubis hasta el proceso xifoides. </li><li> Usando un pequeño retractor, abra las paredes abdominales para exponer la cavidad. </li><li> El uso de algodón estéril con punta aplicadores, retraer con suavidad los intestinos superiormente al animal de izquierda y cubrir con una gasa humedecida con solución salina. Mueva los órganos reproductivos inferior y localizar la aorta infrarrenal y la vena cava inferior. Humedezca los tejidos expuestos periódicamente con una solución salina. </li><li> Separar la aorta de la IVC, desde el nivel de la arteria renal izquierda a la bifurcación. Si es necesario, utilice 10-0 suturas de monofilamento de poliamida para ligar las ramas pequeñas cerca de la aorta. </li><li> Cross abrazadera (proximal y distal al segmento de interés) de la aorta, de aproximadamente 5 mm aparte, con dos pinzas microvasculares 4 mm. </li><li> Usando las microtijeras Vannas-Tübingen, hacer una sola aortotomía horizontal y resecar un segmento pequeño (no más de 0,5 mm) de la aorta abdominal para acomodar el injerto aórtico donante. </li><li> Enjuague la aorta extirpada con heparinizada (100 U / ml) solución salina. El injerto aórtico donante debe tener una longitud adecuada para conectar los extremos seccionados aorta del receptor. </li><li> Coloque el injerto aórtico donante en la posición ortotópica y anastomosis extremo del injerto del donante al final del destinatario, igualando el respectivo injerto orientación anatómica con la del receptor. </li><li> Agarrar suavemente la túnica externa del buque y eversión ligeramente utilizando los fórceps No.5 médicos. Usando los fórceps, conducir la aguja unida a la sutura con monofilamento de poliamida 10-0 a través de todo el espesor de la pared del vaso con el fin de asegurar el injerto aórtico donante al recipiente de resecado del destinatario. Tenga cuidado para asegurarse de que la abertura del vaso no está cerrada debido to costura inadvertida de la pared posterior de la embarcación. </li><li> En las puntadas continuas, coloque suturas estancia en nueve tanto en los extremos superior e inferior del injerto. Comenzando en el extremo superior del injerto de tres, se anastomosan los extremos resecados con 2 suturas de funcionamiento y asegurar la sutura a la sutura estancia. <ol><li> Da la vuelta al injerto una y continuar con la sutura continua de dorsal parte de la embarcación, el cumplimiento de la sutura estancia origen. Asegure sin aplicar mucha presión en el recipiente. Repetir la sutura de la anastomosis baja. Nota: Las suturas interrumpidas comienzan la misma manera que la sutura continua con la excepción de que el recipiente se anastomosa con tres puntos de sutura separadas entre las suturas. Anastomosis tiempo es generalmente de 20 min. </li></ol></li><li> Una vez que la anastomosis se completa, suelte la pinza microvascular distal para permitir que la sangre fluya retrógrada y compruebe si hay fugas de los sitios anastomosados. Si hay una fuga, immediately coloque una puntada para cerrar el sitio defectuoso. Si no hay sangrado en los sitios, a continuación, suelte la pinza proximal. </li><li> Examine el trasplante y compruebe que no hay obstrucción arterial en el injerto, y los extremos proximal y porción distal del vaso del destinatario. Modelo de pulso vigoroso en el recipiente, tanto el destinatario de los donantes y de una indicación primaria que la sangre fluya libremente. Usando el par de pinzas, agarre suavemente un extremo de las suturas y eversión ligeramente el recipiente para inspeccionar la pared posterior de la embarcación. Nota: No debe haber fruncido de la pared vascular en ambos extremos de los sitios anastomosados. La mala circulación sanguínea después de la eliminación de las pinzas es un signo de trombosis. </li><li> El uso de aplicadores con punta de algodón, devolver los intestinos en la cavidad abdominal. </li><li> Con el soporte de la aguja Castroviejo y fórceps Graefe, cierre de la pared abdominal con 5-0 suturas de polipropileno utilizando costura continua. Cierre la capa de piel con el mismosuturas utilizando el cierre subcuticular. </li><li> Administrar Torbugesic (1 mg / kg) im inmediatamente después de concluir el trasplante. </li><li> Dé de inmediato, en el orden, atipamezol (1 mg / kg), ketoprofeno (5 mg / kg) y se calentó la solución por vía subcutánea de Ringer lactato. </li><li> Inmediatamente después de la cirugía, coloque los ratones en una jaula con calefacción bajo una manta de agua durante la noche (12 h). Durante el período de recuperación anestésica, colocar a los animales solos en una zona despejada limpio y seco. Línea de la jaula (autoclave) con toallas de papel limpias y ajustar la temperatura de la manta de agua a aproximadamente 20 a 22 ° C. Proporcionar croquetas secas y húmedas ad libitum en el suelo de la jaula. Nota: Un componente importante de la atención post-quirúrgica es la observación de la intervención de los animales y apropiado, según sea necesario, durante la recuperación de la anestesia y la cirugía. La intensidad necesaria de monitoreo variará con el animal y podría ser mayor durante el período de recuperación anestésica inmediata como compared para más adelante en la recuperación postoperatoria. </li><li> Continuamente monitorear animales que la anestesia sufridas monitoreados hasta que se recuperen por completo. El animal debe ser capaz de mantener decúbito esternal sin ayuda y debe parecer tranquilo y libre de dolor antes de que pueda ser dejado sin atención. </li><li> Dé buprenorfina (0,1 mg / kg BID) y ketoprofeno (5 mg / kg SID) para un período de tres días, ambos por vía subcutánea. </li><li> Monitor cardiovascular y la función respiratoria, temperatura corporal, y el dolor postoperatorio o molestias durante la recuperación de la anestesia durante un mínimo de tres días. Cuidado adicional puede ser necesaria, tales como la administración de analgésicos y otros fármacos y fluidos parenterales para reducir al mínimo la pérdida de la deshidratación y electrolitos. </li><li> Evaluar el éxito de la cirugía de trasplante mediante la observación de la función motora de las extremidades traseras. El éxito completo del trasplante implica el flujo de sangre sin obstáculos a la extremidad y la cola trasera, que debe ser inmediata tras la recuperación de la animal, y la recuperación completa sin parálisis de las extremidades traseras en el segundo día </li></ol></li></ol> 3. Tissue Collection Nota: Los puntos finales predeterminados estándar 3-60 días dependiendo del tipo de análisis deseado y la naturaleza de la falta de coincidencia antígeno. En general, el engrosamiento de la íntima es robusto en el día 30 después del trasplante a través de cepas completas ratón coincidentes MHC. <ol><li> Anestesiar al ratón con inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) y xilazina (10 mg / kg; 1 mg / ml). Evaluar la profundidad de la anestesia pellizcando la parte grasa de la almohadilla de la pata animal. Proceda con la cirugía cuando el animal no presenta reflejo de retirada. </li><li> Limpiar el sitio quirúrgico con agua y terminando con 70% de alcohol. </li><li> Colocar el animal en posición supina sobre una bandeja forrada con almohadilla absorbente. </li><li> Abra la cavidad abdominal con una incisión longitudinal gran línea media. Coloque un retractor auto-retención para exponer la cavidad, la una IVCd la aorta abdominal. </li><li> Separar suavemente el segmento aórtico donante trasplantado de la vecina IVC usando un par de pinzas 5 No. médica. Tenga especial cuidado de no despojar a la adventicia del vaso trasplantado. </li><li> Exponer la cavidad torácica por el corte a través de las costillas a lo largo de ambos lados de la columna torácica todo el camino a la entrada torácica. Reflejar la pared anterior del tórax superiormente para exponer el pericardio y asegurar la caja torácica con un par de pinzas hemostáticas. </li><li> Una vez que el corazón está expuesto, inserte un 25 G 5/8 aguja (unida a una jeringa) en el ventrículo izquierdo y al ras con 0,1 ml de solución salina heparinizada (100 U / ml). </li><li> El uso de un par de tijeras, quite la aurícula derecha para permitir que la sangre, solución salina heparinizada y fijador para salir del cuerpo durante la perfusión. Perfundir el animal con 5 ml de paraformaldehído al 4% o hasta que se ejecuta el líquido claro. Quite el corazón para asegurar la eutanasia. </li><li> Impuestos Especiales trasplantado segmento de vaso y sumergirse en el 4% párrformaldehído por no más de una hora. Ajuste el recipiente trasplantado en octubre (temperatura óptima de corte) de la matriz y la congelación de flash. Sección del buque en un criostato fijado en 8 um de espesor. Secciones se tiñen con hematoxilina y eosina y / o Verhoeff-van Gieson (van Gieson) tinción elástica. </li></ol> 4. Análisis morfológico de los injertos Nota: TA se caracteriza por el engrosamiento de la íntima 13. En este modelo, engrosamiento de la íntima y una reducción resultante en el tamaño del lumen son un reflejo de la gravedad de la lesión vascular inmunomediada. Syngraft controles se utilizan para determinar las características basales de los vasos en ausencia de respuestas inmunes alogénicas. Estos controles permiten también la evaluación de daño arterial que se produce como resultado de la intervención quirúrgica. No debe haber engrosamiento de la íntima en syngrafts. <ol><li> Para examinar el engrosamiento de la íntima y la oclusión luminal, medir el área dentro de la célula endotelialcapa, lámina elástica interna (IEL) y la lámina elástica externa (EEL) en los segmentos de las arterias elásticas manchado van Gieson con un software de análisis de imágenes. Los parámetros siguientes se pueden utilizar para determinar los cambios arteriales reflectantes de TA. <ol><li> Mida el área de la íntima absoluta: área dentro de la lámina elástica interna - el área dentro de la capa de células endoteliales. Esto proporciona una medida absoluta de la expansión de la íntima, que es el sello de TA. </li><li> Mida la absoluta zona medial: área dentro de la lámina elástica externa - área dentro de la lámina elástica interna. Esto proporciona una medida absoluta de la degradación medial o el crecimiento, que en ocasiones puede ocurrir como resultado de los cambios inmunes a esta región de la pared del vaso. </li><li> Medir el área total recipiente como el área dentro de la lámina elástica externa. Esto proporciona una medida de remodelado vascular que implica la expansión o la constricción de las arterias como resultado de un daño inmunológico. </li><li> Medidala íntima / media: (área dentro de la lámina elástica interna - área dentro de la capa de células endoteliales) / (área dentro de la lámina elástica externa - área dentro de la lámina elástica interna). Esto proporciona una medida relativa de expansión de la íntima y normaliza las diferencias en el tamaño de los buques. </li><li> Mida el estrechamiento luminal%: [(área dentro de la lámina elástica interna - área dentro de la capa de células endoteliales) / área con la lámina elástica interna)] * 100. Esto proporciona una medida de la extensión de la oclusión luminal, que resulta de una combinación de expansión de la íntima y la remodelación (hacia dentro o hacia fuera) de la pared del vaso. </li></ol></li></ol>

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C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+mediates+endothelial+cell+death+and+resultant+transplant+vascular+disease+in+cardiac+allografts.">Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts.</a> Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).</li><li>Choy, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+induces+endothelial+cell+apoptosis+and+contributes+to+the+development+of+transplant+vascular+disease.">Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease.</a> Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).</li><li>Reis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+remodeling+of+advanced+atherosclerotic+plaques+of+the+apolipoprotein+E-deficient+mouse+in+a+novel+transplantation+model.">Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model.</a> Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).</li><li>Potteaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+monocyte+recruitment+drives+macrophage+removal+from+atherosclerotic+plaques+of+Apoe-/-+mice+during+disease+regression.">Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression.</a> J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).</li></ol>

Hemos descrito un protocolo para la interposición de injerto aórtico en ratones que es útil para estudiar el rechazo vascular inmunomediada y TA. Este modelo puede ser utilizado para investigar las causas de la TA, así como el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Se ha utilizado en el pasado para establecer un papel esencial de la inmunidad adaptativa, las respuestas de células T citotóxicas, las respuestas efectoras CD4 de células T mediada por citoquinas, y el daño del injerto mediado por anticuerpo...

Durante los últimos 30 años, los avances en los fármacos inmunosupresores han disminuido el rechazo del injerto por rechazo agudo, pero el rechazo crónico sigue siendo un desafío principal. La principal manifestación de rechazo al trasplante cardíaco crónico es la arteriosclerosis del trasplante (TA) 1,2. Esta condición se caracteriza por hiperplasia de la íntima y la disfunción vasomotor de las arterias de aloinjertos y se desarrolla como resultado de la focalización inmunológica de las células musculares lisas y endoteliales por el sistema inmune del destinatario. La orientación específica de la vasculatura del injerto debido al reconocimiento de complejo de histocompatibilidad principal de péptido extranjera (MHC) se pone de relieve por el desarrollo de TA exclusivamente en las arterias de injerto sin afectar los vasos anfitrionas 3. En consonancia con esto es la observación de que la TA no se produce experimentalmente cuando el destinatario es genéticamente idéntico al donante o cuando el receptor carece de células T y B 4. Lesión vascular mediada inmunológicamente y dysfunction hace que el desarrollo de engrosamiento de la íntima y fibrosis, así como la acumulación aberrante de los lípidos y las proteínas ECM, en TA 5. Engrosamiento de la íntima tiende a ser concéntrico a lo largo de todo el árbol arterial 4-6. Pérdida del injerto y la muerte por lo general se producen como consecuencia de la isquemia progresiva como consecuencia de la oclusión luminal de las arterias de aloinjertos 4. En 1991, Mennander et al. 7 fue pionera en un modelo de interposición aórtica en ratas para modelar TA. Varios grupos han adaptado posteriormente este procedimiento para su uso en ratones. En este modelo, los segmentos aórticos de aloinjertos desarrollan lesiones que tienen características comparables a TA observaron en los trasplantes clínicos. Esto incluye engrosamiento de la íntima que se caracteriza por la acumulación de células de músculo liso como receptores 7 y leucocitos. Durante los últimos 2 décadas este modelo ha sido utilizado para generar importante información sobre los mecanismos de lesión vascular, el rechazo y TA. Puede ser nosotrosed para examinar cuestiones relacionadas con la respuesta inmune y vasculares durante la patología arterial. La elección de los impactos desajuste antígeno la capacidad para hacer frente adecuadamente a estas preguntas. Trasplante a través de barreras completas MHC permite una evaluación completa de las respuestas inmunes que se sabe que están implicados en el rechazo del trasplante de órganos. Esto incluye el reconocimiento de células CD4 y CD8 T directo y la focalización de extranjera péptido-MHC presentado por células del injerto derivado, CD4 indirecto (y posiblemente CD8) el reconocimiento de células T y la orientación de los aloantígenos de injerto derivado presentados por células presentadoras de antígeno receptor, y anticuerpo reconocimiento mediado de aloantígenos en las superficies celulares vasculares 8. Sin embargo, la respuesta a la lesión vascular en los experimentos completos coincidentes-MHC puede ser diferente que el observado clínicamente. Johnson et al. 9 mostró que, en los injertos de interposición aórticos trasplantados a través de una barrera completa MHC falta de coincidencia, la mayoría delas células de la neoíntima son de origen destinatario y no de origen donante. Esto es diferente que la observada en los trasplantes humanos donde la mayoría de las células del músculo liso de la íntima son de origen donante 9,10. Para tener en cuenta esta limitación, los modelos experimentales alternativos que implican injerto a través de los descalces de antígeno de histocompatibilidad menor importancia se han desarrollado que desencadenan respuestas vasculares que se asemejan más a los observados en el trasplante clínico 11. Si bien estos modelos alternativos permiten conclusiones importantes que hacer con respecto a las respuestas vasculares que impulsan el desarrollo de la asistencia técnica, los procesos inmunológicos que causan rechazo vascular en antígeno de histocompatibilidad menor injertos no coincidentes no completamente re-capitular las que se producen en el ámbito clínico. Por ejemplo, los antígenos menores de histocompatibilidad se reconocen mal por injerto anticuerpos reactivos 12. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, es importante considerar el questi patológicaal ser examinado en la elección del tipo de desajuste antígeno utilizado en un modelo interposición aórtica. Aquí se describe un protocolo detallado para murino injerto de interposición aórtica. Se describe el injerto de interposición entre los ratones MHC-coincidentes completos pero el mismo protocolo se utiliza para injertar a través de otras cepas de ratón coincidentes antígeno.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name&#160;</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J (H-2b)</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td>
			<td>Strain# 000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balb/cBYJ</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td>
			<td>Strain# 001026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ mL</td>
			<td rowspan="2">Ketalean</td>
			<td rowspan="2">DIN 00612316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine Injection 20 mg/mL</td>
			<td>Rompum</td>
			<td>DIN 02169592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen Injection 100 mg/mL</td>
			<td>Anafen</td>
			<td>DIN 01938126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol Tartrate&#160;injection 10 mg/mL</td>
			<td>Torbugesic</td>
			<td>DIN 008450000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine Injection 0.3 mg/mL</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td>B.N. 5241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution</td>
			<td>Antisedan</td>
			<td>DIN 02237744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Injection, USP, 1000 units/mL</td>
			<td>McKesson Distribution</td>
			<td>DIN 02264315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tears naturale ophthalmic ointment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>DIN 02082519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride, sterile</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactated Ringer&#8217;s solution, sterile</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 mL</td>
			<td>Baxter Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol Prep Pads</td>
			<td>Loris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone Iodine</td>
			<td>Betadine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorohexidine Gluconate 4% w/v</td>
			<td>Germi-Stat</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Polyamide Monofilament</td>
			<td>AROSurgical Instruments</td>
			<td rowspan="2">T4A10Q07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture, 10-0 suture, 70 microns</td>
			<td>Corporation</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue monofilament suture 5-0, P3 needle</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>8698G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc TB insulin syringe with 28G 1/2</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 7/8, hypodermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G 1/2, hypodermic needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colibri Retractor- 1.5cm spread 4cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>17000-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S&#38;T CAF-4 Clip applying forceps, without lock</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00072-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supergrip forceps, S&#38;T</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00632-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical No.5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11253-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lexer Baby Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14078-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Adson forceps serrated</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas-Tubingen microscissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>00396-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11054-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castroviejo with lock and tungsten jaws</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot glass bead sterilizer</td>
			<td>Inotech 250</td>
			<td>IS-250 - Steri-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-woven gauzes</td>
			<td>Progene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Applicators</td>
			<td>Puritan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beard Trimmer</td>
			<td>Wahl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Sunbeam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

En este modelo, la aorta abdominal de un ratón Balb / CYJ se interpone en la aorta infrarrenal de un C57BL / 6 destinatario. Esto permite una evaluación completa de aloinmunes respuestas que se dirigen a las arterias de aloinjertos. Lesión vascular inmunomediada en este modelo inicia respuestas reparadoras vasculares que culminan en el engrosamiento de la íntima, el estrechamiento luminal y el reclutamiento de células inmunes (Figuras 1 y 2). Estos criterios sirven entonces como un...

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Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modelo de ratón de rechazo vascular inducida por aloinmune y Arteriosclerosis Trasplante

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

mouse-model-alloimmune-induced-vascular-rejection-transplant

Research

JoVE Journal

Medicine

8.4K vistas.  Simon Fraser University. We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure. 

Video: Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Mouse Complete Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombosis

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE). In the United States (U.S.), the high morbidity and mortality rates make VTE a serious health concern 1-2. After heart disease and stroke, VTE is the third most common vascular disease 3. In the U.S. alone, there is an estimated 900,000 people affected each year, with 300,000 deaths occurring annually 3. A reliable in vivo animal model to study the mechanisms of this disease is necessary.
The advantages of using the mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis are several. The mouse model allows for the administration of very small volumes of limited availability test agents, reducing costs dramatically. Most promising is the potential for mice with gene knockouts that allow specific inflammatory and coagulation factor functions to be delineated. Current molecular assays allow for the quantitation of vein wall, thrombus, whole blood, and plasma for assays. However, a major concern involving this model is the operative size constraints and the friability of the vessels. Also, due to the small IVC sample weight (mean 0.005 grams) it is necessary to increase animal numbers for accurate statistical analysis for tissue, thrombus, and blood assays such as real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), western blot, enzyme-linked immunosorbent (ELISA), zymography, vein wall and thrombus cellular analysis, and whole blood and plasma assays 4-8.
The major disadvantage with the stasis model is that the lack of blood flow inhibits the maximal effect of administered systemic therapeutic agents on the thrombus and vein wall.

The mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis yields quantifiable amounts of vein wall tissue and thrombus. It has proven useful for evaluating interactions between the vein wall and the occlusive thrombus and in assessing the progression from acute to chronic inflammation.

Ratón completo modelo de estasis Inferior Vena Cava trombosis

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE).  In the United States (U.S.), the high morbidity and ...

Investigación

Medicina

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

Modelos de ratón para Arteriosclerosis Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Aspectos técnicos de la aortocava Fístula Ratón

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Murine Heterotopic Heart Transplant Technique

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become proficient in and utilize this technique, it is now widely used by many laboratories around the world. A significant refinement to the original technique was developed and reported in 2001 by Niimi. Described here are the techniques that have evolved over more than a decade in the hands of three surgeons (Plenter, Grazia, Pietra) in our center. These techniques are now being passed on to a younger generation of surgeons and researchers.
Based largely on the Niimi experience, the procedures used have evolved in the fine details - details which we will endeavor to relate here in such a way that others may be able to use this very useful model. Like Niimi, we have found that a video aid to learning is a priceless resource for the beginner.

The manuscript describes the steps required to perform the heterotopic heart transplant in the mouse.

Murino heterotópico Corazón Trasplante Técnica

It is now over forty years since this technique was first reported by Corry, Wynn and Russell. Although it took some years for other labs to become ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Ratón Trasplante de Riñón: Modelos de rechazo del aloinjerto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Ferric Chloride-induced Thrombosis Mouse Model on Carotid Artery and Mesentery Vessel

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric chloride injury is now a well-established technique to rapidly and accurately induce the formation of thrombi in exposed veins or artery of small and large diameter. This model has played a key role in the study of the pathophysiology of thrombosis, in the discovery and validation of novel antithrombotic drugs and in the understanding of the mechanism of action of these new agents. Here, the implementation of this technique on a mesenteric vessel and carotid artery in mice is presented. The method describes how to label circulating leukocytes and platelets with a fluorescent dye and to observe, by intravital microscopy on the exposed mesentery, their accumulation at the injured vessel wall which leads to the formation of a thrombus. On the carotid artery, the occlusion caused by the clot formation is measured by monitoring the blood flow with a Doppler probe.

The FeCl3 induced thrombosis model in mice is described herein. A method to monitor thrombus growth by intravital microscopy observation on a mesenteric vessel and by blood flow measurement in the carotid artery is presented.

Trombosis modelo de ratón de la arteria carótida y Mesenterio Embarcaciones inducida por cloruro férrico-

Severe thrombosis and its ischemic consequences such as myocardial infarction, pulmonary embolism and stroke are major worldwide health issues. The ferric ...

Intraluminal Drug Delivery to the Mouse Arteriovenous Fistula Endothelium

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The simple murine AVF model was combined with intraluminal administration of drug solution to the venous endothelium at the same time as fistula creation. Technical aspects of this model are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The infra-renal aorta and IVC are dissected for clamping. After proximal and distal clamping, the puncture site is exposed and a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta and into the IVC. Immediately after the puncture, a reporter gene-expressing viral vector was infused in the IVC via the same needle, followed by 15 min of incubation. The intraluminal administration method enabled more robust viral gene delivery to the venous endothelium compared to administration by the external route. This novel method of delivery will facilitate studies that explore the role of the endothelium in AVF maturation and enable intraluminal drug delivery at the time of surgical operation.

After puncturing the aorta through the inferior vena cava (IVC) to create an aorto-caval fistula in the mouse, solution containing a drug is infused into the IVC via the same needle, followed by incubation. This method enables more robust drug delivery to the venous endothelium compared to the external route.

Intraluminal entrega de la droga a la fístula arteriovenosa ratón endotelio

Delivery of therapeutic agents to enhance arteriovenous fistula (AVF) maturation can be administered either via intraluminal or external routes. The ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

La interposición de la vena del modelo: un modelo adecuado para estudiar la permeabilidad del injerto de bypass

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Utilizando la técnica de la manga en un modelo murino de trasplante aórtico - un Video instructivo

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of aortic disease exist, in vivo imaging of the vasculature has been limited. In recent years, micro-computerized tomography (micro-CT) has emerged as a preferred modality for imaging both large and small vessels both in vivo and ex vivo. In conjunction with a method of vascular casting, we have successfully used micro-CT to characterize the frequency and distribution of aortic pathology in &#946;-aminopropionitrile-treated C57/Bl6 mice. Technical limitations of this method include variations in the quality of the perfusion introduced by poor animal preparation, the application of proper methodologies for vessel size quantification, and the non-survivability of this procedure. This article details a methodology for the intravascular perfusion of a lead-based radiopaque silicone rubber for the quantitative characterization of aortopathy in a mouse model of aneurysm and dissection. In addition to visualizing aortic pathology, this method may be used for examining other vascular beds in vivo or vascular beds removed post-mortem.

Quantitative Micro-CT Analysis of Aortopathy in a Mouse Model of &amp;#946;-aminopropionitrile-induced Aortic Aneurysm and Dissection

This article describes a detailed methodology of using a radiopaque lead-based silicone rubber to perfuse the murine vasculature for aortic diameter quantification in a mouse model of aortic aneurysm and dissection.

Análisis de Micro-CT cuantitativa de Aortopathy en un modelo murino de disección y aneurisma de la aorta inducida por β-oxidasa

Aortic aneurysm and dissection is associated with significant morbidity and mortality in the population and can be highly lethal. While animal models of ...