Estamos muy agradecidos con el Wellcome Trust y el Coordinador de apoyo financiero. IMGG es un compañero de EMBO. KLH es un estudiante de doctorado BBSRC financiado. Damos las gracias a Philip Rubin y Tidball Patrick para el apoyo técnico y la cultura de células, y el Dr. Andrew Doherty para el mantenimiento y la asistencia con los microscopios.

1. Cultivo celular, la transducción viral, y expresión de proteínas <ol><li> Neuronas del hipocampo Cultura de alta densidad de crías de rata embrionarias día 18 (E18) sobre cubreobjetos de vidrio poli-l-lisina para 14-25 días in vitro (DIV). </li><li> 6-24 horas antes de los experimentos en vivo, las células transducen con virus atenuado Sindbis que contienen la proteína de la membrana de interés, marcada con el pHluorin súper eclíptica (SEP). </li><li> Añadir el medio pseudovirión que contiene directamente al cubreobjetos que contiene 1 ml de medio condicionado y devuelto a la incubadora cultivo. El título y el tiempo de expresión de la proteína después de la transducción viral variará dependiendo del lote de virus y debe determinarse para cada lote antes de comenzar los experimentos de células vivas. </li></ol> 2. FRAP, FLIP imágenes de células vivas <ol><li> Equipo de puesta a punto <ol><li> Transferir el portaobjetos a la cámara de imágenes de un microscopio Zeiss Axiovert META confocal LSM 510.Para minimizar las fluctuaciones de potencia durante la exploración, asegurar el microscopio se ha encendido, con salida de láser 100%, por lo menos 20 minutos antes de la imagen. </li><li> Inmediatamente, sustituir el medio de cultivo con pre-calentado (37 ° C) solución de grabación extracelular que contiene 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucosa, 1,5 mM de CaCl 2, 1,5 mM de MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH ajustado a 7,4 con NaOH) y colocar la cámara en la etapa de pre-calentado (37 ° C) de la Zeiss Axiovert. Asegurarse de la osmolaridad de la solución de grabación extracelular se ajusta dentro de 10 mOsM de su medio de cultivo. Siempre que no hay evaporación significativa se produce durante el curso de tiempo de la experiencia, la solución independiente de CO 2 es adecuado para experimentos cortos (&lt;10 horas). La suplementación con 1.2 mM de bicarbonato de sodio es recomendable. </li></ol></li><li> Definición de los parámetros de captura de imágenes <ol><li> En primer lugar, identificar una neurona que expresa la pro recombinanteproteína de interés y ponerla en el foco. </li><li> Con un aceite de 63X se opuso, adquirir una imagen de toda la célula de excitación 488 nm utilizando la luz láser en el láser de baja potencia. Para reducir al mínimo photobleaching, utilice una velocidad nominal rápida (7-9) y píxeles de resolución baja (512-512) el mantenimiento de la velocidad de escaneo total de &lt;1 segundo. </li><li> Seleccione una parte de la dendrita de la imagen y el zoom para capturar un marco que contiene el retorno de la inversión (~ 1.5-2.5 x zoom óptico). Donde sea posible, asegurar el campo de visión contiene varios procesos de manera que las mediciones de dendritas de referencia se puede obtener, para determinar si no específica photobleaching debido a la adquisición se está produciendo. </li><li> Ajuste de los filtros, estenopeica, velocidad de análisis y ganancia del detector de fluorescencia para permitir máxima de excitación láser mínima, pero con la saturación limitada. El diámetro del agujero de alfiler grande, se recomienda, para maximizar la recolección de fotones (2μm es adecuado para las espinas y las dendritas ternarios). La ganancia del detector debe ser lo suficientemente fuerte como para detectar pequeños incrementos de fluorescencia,de tal manera que las imágenes muy en primer lugar, antes de la fotoblanqueo no superar el 10% de pixeles saturados. </li><li> Guarde esta configuración que se utilizará para la pre-/ post-cloro y fases de recuperación del experimento. </li><li> A continuación, defina las regiones fotoblanquear; la selección de un retorno de la inversión para la fotoblanquear inicial y regiones de acompañamiento para la fase de photobleaching repetitivo posterior. Asegúrese de que las regiones que flanquean son lo suficientemente amplia como para impedir la recuperación por la difusión entre las exploraciones (típicamente de 5 m, ver fig. 2). </li><li> Ajustar los parámetros de blanqueador para ROI fotoblanquear ambos. El fotoblanquear inicial debe ser rápida (0,1 a 0,5 seg) que requiere entre 1-5 iteraciones, dependiendo del zoom óptico y el volumen de la RDI. Para las regiones flanqueantes, la excitación láser debe ser ajustado para asegurar fotoblanqueo continua de las regiones de flanqueo, pero sin daño fototóxico. </li><li> Como guía, se utiliza el 100% de excitación láser para el fotoblanquear inicial, y el 10% para el ph repetitivo photobleachingASE. </li></ol></li><li> Adquisición de imágenes <ol><li> Una vez que todos los parámetros se han establecido, realizar el experimento FRAP-FLIP como una secuencia variable de la imagen de lapso de tiempo, se indica en los 4 bloques siguientes: BLOQUE 1: 3-10 de pre-blanqueo imágenes de referencia, en el láser de baja potencia, sin tiempo de retardo BLOQUE 2: fotoblanquear el ROI central a plena potencia del láser, 1-5 iteraciones BLOQUE 3: 3-10 lejía después de la recuperación de imágenes BLOQUE 4: fotoblanquear repetitiva de las regiones flanqueantes en la potencia del láser con medio de captura de imágenes en un intervalo de tiempo típico de 1 - 5 segundos, dependiendo de la tasa de recuperación de la proteína bajo investigación. </li><li> Finalmente, reemplazar la solución de grabación extracelular con una solución tamponada a pH 6 de grabación que contiene 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucosa, 1,5 mM de CaCl 2, 1,5 mM de MgCl 2, 20-25 mM MES (para saciar fluorescencia) o complementado con 50 mM NH4Cl que contiene 90 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucosa, 1,8 mM de CaCl 2, 0,8 mMMgCl 2, 20-25 mM HEPES, pH 7,4 (para revelar las proteínas en las tiendas de pH intracelular bajo), (ver fig. 2). </li><li> Recoger al menos 10 a 20 conjuntos de datos para cada proteína recombinante, para permitir el análisis estadístico. Para evitar sesgar los resultados, garantizar las condiciones de formación de imágenes se mantienen consistentes entre repeticiones. Deseche cualquier conjuntos de datos incompletos en el blanqueado, la desviación significativa del plano focal o daño de las células fototóxica se observan. </li></ol></li></ol> 3. Análisis de Datos <ol><li> Abra las imágenes con el software ImageJ. </li><li> Alinear las pilas para dar cuenta de las pequeñas fluctuaciones en el plano xy que se hayan producido a lo largo de la serie de tiempo usando el plugin de Stackreg (plugins → → stackreg transformación: cuerpo rígido → <ok> ). </ok></li><li> Para las imágenes tomadas en Zeiss confocal, utilice el complemento Herramientas LSM para informar de los valores de tiempo como un archivo de texto (plugins → Herramientas → LSM Mostrar LSM Herramientas → <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ),e importar estos valores en una hoja de análisis. </apply></apply></li><li> Para medir las fluctuaciones de fluorescencia durante el experimento FRAP-FLIP, dividir el segmento photobleached en las regiones de píxeles individuales (aproximadamente 20pixels) y medir la fluorescencia media de estas regiones de interés en cada momento (F). Para obtener rápidamente estos valores, seleccionar varias regiones de interés utilizando la herramienta de ImageJ &quot;retorno de la inversión del Administrador de análisis (Analizar → Herramientas → Administrador de retorno de la inversión) e informar de la media de fluorescencia por píxel a través del&quot; Argumento del eje Z el perfil de comando (Imagen → → Pilas Parcela Z ejes perfil). </li><li> Repetir este paso para medir la intensidad de fluorescencia de un fondo, en la región no fluorescente. </li><li> Normalizar la intensidad de fluorescencia en cada punto de tiempo restando los valores de fondo para eliminar el ruido experimental, y dividir todos los valores de la medida basal media antes de la blanqueada. </li><li> Medir la intensidad de la fluorescencia de las adyacentes no photobleached dendritas para evaluar el nivel de no-específicaphotobleaching durante la adquisición. Corrección de la no específica photobleaching se recomienda para la interpretación de &#39;FRAP-FLIP &quot;los datos y se debe evitar siempre que sea posible. </li><li> Para calcular si la recuperación significativa ha tenido lugar en un retorno de la inversión, se resta la media de las últimas medidas de 5-10 de la secuencia de la media de las primeras medidas de 5-10 (Df) y determinar la significación estadística. Clasificar el rendimiento de la inversión y no la recuperación de la recuperación-para evaluar el patrón de la exocitosis (es decir, puntos de acceso o de recuperación de la columna vertebral exocitosis vs eje). </li></ol> 4. Los resultados representativos El resultado de típico FRAP-FLIP experimento se muestra en la fig. 2. Aquí, una neurona que expresa la subunidad del receptor de AMPA GluA2 de glutamato de tipo, etiquetados con la SEP ha sido selectivamente photobleached lo largo de una región de la dendrita. Fig. 2.A ilustra la región de dendrita que se ha fotografiado e indica la ROIs que han sido seleccionados para photobleaching (regiones de caja blanca). The gran área de caja blanca se blanqueó una vez, seguido por repetitivo blanqueo de las regiones de acompañamiento en caja, con la destacada dobles encabezados flechas azules. La flecha roja indica el retorno de la inversión medido, que se muestra en el gran aumento en los paneles inferiores. Fig. 2.B, muestra la intensidad de fluorescencia en el retorno de la inversión medido durante el curso del tiempo del experimento. En este ejemplo, un período de recuperación un minuto se registró después de la fotoblanquear inicial para permitir que los receptores de crudos para entrar en el retorno de la inversión por difusión lateral. Cuando las regiones flanqueantes se photobleached, la señal de fluorescencia a partir de esta fracción muy móviles de los receptores está ocluida de la región central, y los de la región se diluyen a cabo. El aumento de la fluorescencia (Df) observada durante el &quot;FLIP&quot; secuencia por lo tanto se puede atribuir a la inserción de septiembre-GluA2 en el eje dendrítica. El lavado de bajo pH y el pH 7,4 + adición de NH4Cl respectivamente confirmar que la fluorescencia medida se deriva de la superficieproteínas y revelar la proporción de proteínas intracelulares, secuestrados en el ROI medido. En contraste con FRAP, esta metodología aísla recuperación debido a exocitosis, resultando en un nivel muy reducido de recuperación de fluorescencia en la región photobleached. Hasta la fecha ningún modelo matemático fiable ha sido desarrollado para encajar y analizar la recuperación trazas grabado utilizando esta técnica selectiva de blanqueo. Sin embargo, es posible ajustar la traza de la recuperación con una recuperación mono exponencial: F (t) = A s - A e 0 (-t / τ) Donde f (t) es la fluorescencia en el tiempo t, s es un valor de estado estacionario, A 0 es el desplazamiento en el tiempo 0, τ es la constante de tiempo. El crecimiento de recuperación se fija con una tasa dada de llegar a un equilibrio, correspondiente a un estado estacionario entre la inserción y difusión. Es importante destacar que la constante de tiempo extraída de este unNÁLISIS no refleja la constante de tiempo de exocitosis y sólo se puede utilizar para tratamientos comparativos para una proteína individual. Además, el patrón esperado de recuperación de fluorescencia es probable que se observa en sub-dominios a lo largo de la región photobleached. El análisis de retorno de la inversión pequeña dentro de un segmento photobleached puede ser esencial para revelar exocitosis &quot;puntos calientes&quot;, y es conveniente analizar las regiones de longitudes comparables a los de la variabilidad de la densidad de estos puntos entre la dendrita afectará a la tasa calculada. La figura 3 muestra una extensión de este protocolo, la aplicación de la fotoblanquear al retorno de la inversión la sección grande con múltiples dendritas en el campo de visión, seguido por repetitiva selectiva de blanqueo de una sola dendrita. Este enfoque permite a los tradicionales &quot;FRAP&quot; y &quot;FRAP-FLIP&quot; los datos que se deben adquirir en paralelo. En este ejemplo, las neuronas del hipocampo se han infectado con una subunidad del receptor glutamato de la clase de kainato, septiembre de etiquetado GluK2. Príor para formación de imágenes, estas neuronas de fueron tratados con cylcohexamide (2 horas a 200μg/ml), para bloquear la síntesis de proteínas. Como tal recuperación, la fluorescencia en el rendimiento de la inversión respectivo medida (figura 3.B) revela que la proporción de recuperación debido a la difusión lateral y el reciclaje en la dendrita FRAP estándar versus el reciclaje solo en la dendrita sometido a la &#39;FRAP-FLIP-protocolo. Al comparar los valores Df a partir de curvas de la FRAP frente a la recuperación &quot;FRAP-FLIP-, las contribuciones relativas de reciclaje (Df rec = 11,05%) frente a la difusión laterales (Df diff = 9,35%) se puede deducir. A diferencia de la Figura 2, la recuperación no mantiene un nivel de estado estacionario, sino más bien, debido a la inhibición de la síntesis de proteínas, muestra un aumento transitorio y posterior bajada de la señal, correspondiente a la depleción de la piscina del receptor disponible (aproximadamente 20% disminución observada durante el período de grabación). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></p&gt; Figura 1. Esquema de los principios de la FRAP FRAP, FLIP vs protocolos Este esquema ilustra los resultados de un FRAP regular versus un protocolo &#39;FRAP-FLIP &quot;, utilizando Sep-etiquetados receptores. La recuperación de la fluorescencia en el FRAP tradicional se muestra en el lado izquierdo. La recuperación de medición de fluorescencia en el centro de retorno de la inversión se atribuye a una combinación de laterales de difusión f no photobleached receptores de septiembre de etiquetado de fuera de la ROI photobleached y la inserción de los receptores a través del reciclaje y / o de la exocitosis novo en el eje dendríticas. Por el contrario, la photobleached repetitivo de la ROIs flanqueante se ilustra en el lado derecho, se muestra cómo &#39;FRAP-FLIP&#39; esta modificación silencios protocolo debido a la difusión lateral de recuperación. Como tal, cualquier recuperación fluorescencia medida se puede atribuir a la inserción directa en el retorno de la inversión. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> Figura 2.La inserción de septiembre-GluA2 en la membrana plasmática en el eje dendrítica A) Una neurona del hipocampo expresan SEP-GluA2, selectivamente photobleached lo largo de una región de la dendrita. El esquema ilustra la región de dendrita que se ha fotografiado, mientras que el panel superior izquierda destaca la ROIs que han sido seleccionados para photobleaching. La gran área de caja blanca se blanqueó una vez, seguido por repetitivo blanqueo de las regiones de acompañamiento en caja, con la destacada dobles encabezados flechas azules. Este panel muestra la dendrita antes de photobleaching. La flecha roja indica el retorno de la inversión medido, que se muestra en el gran aumento en los paneles inferiores. B) muestra la intensidad de fluorescencia en el retorno de la inversión medido durante el curso del tiempo del experimento, trazada como nivel de gris en el ROI (no normalizado). La flecha negro resaltar el punto de tiempo de la fotoblanquear inicial y flecha verde indica el inicio de la photobleaching repetitivo. Df indica ªe incremento en la fluorescencia observada durante el período de recuperación, debido a la inserción de septiembre-GluA2 en el eje dendrítica. Tras pH bajo y un pH de 7,4 + NH 4 lavados Cl confirmar que la fluorescencia recuperado se refiere a la superficie receptores expresados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> Figura 3. Reciclaje y reciclaje de lateral frente a la difusión de la SEP-GluK2 en el eje dendríticas después del tratamiento con cicloheximida A) Una neurona del hipocampo expresan SEP-GluK2, de forma selectiva con el FRAP photobleached paralelo y &#39;Flip-FRAP &quot;protocolos de recuperación realizados a lo largo de regiones de interés dendríticas por separado. Esta neurona fue sujeto a un tratamiento previo con ciclohexamida, para bloquear la síntesis de proteínas (2 horas a 200 g / ml). El esquema ilustra la región de dendrita que se ha fotografiado, mientras que el panel de la izquierda destacando la ROIs que han sido seleccionados para photobleaching. The gran área de caja blanca se blanqueó una vez, seguido por repetitivo blanqueo de las regiones de acompañamiento en caja, de la dendrita inferior solamente, con la destacada dobles encabezados flechas azules. Este panel muestra las dendritas antes de photobleaching. Las flechas rojas resaltar el rendimiento de la inversión se muestra en una gran ampliación en B) que ilustra la recuperación de la fluorescencia en el FRAP tradicional versus el protocolo del &#39;FRAP-FLIP. Las comparaciones de los niveles de intensidad de fluorescencia en la última etapa de recuperación (paneles de terceros) muestran la contribución de la difusión lateral y el reciclaje en comparación con el reciclaje solo. C) muestra la intensidad de fluorescencia en el rendimiento de la inversión medido en el transcurso del experimento, trazados como intensidad normalizada valores. La flecha negro resaltar el punto de tiempo de la fotoblanquear inicial y flecha verde indica el inicio de la photobleaching repetitivo. Df rec indica que la recuperación transitoria debido al reciclaje del receptor, determina a partir de la dendrita FRAP / FLIP, mientras que Dfesta mide la contribución de la difusión lateral de septiembre-GluK2 en el eje dendríticas en el &#39;FRAP sólo &quot;retorno de la inversión. El aumento transitorio es seguido por disminución gradual de la señal, correspondiente a la carrera hacia abajo de los receptores disponibles como resultado de un tratamiento ciclohexamida. El pH posterior baja y pH 7,4 + NH 4 lavados Cl confirmar que la fluorescencia recuperado se refiere a la superficie receptores expresados.

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No hay conflictos de interés declarado.

Se describe una estrategia innovadora para visualizar los componentes de la trata de plasma proteína de la membrana. El enfoque combinatorio de photobleaching técnicas con la proteína de septiembre de etiquetado permite selectivamente la membrana de plasma los eventos de inserción que deben evaluarse. Gracias a la continua photobleaching las proteínas de la membrana en las regiones flanqueantes durante la recuperación, el método de &quot;FRAP-FLIP &#39;evalúa la contribución del tráfico vesicular a la recuperación de la fluorescencia. Este enfoque novedoso permite la grabación directa de inserción proteína de la membrana, lo que permite tanto el número de sub-compartimientos donde se observa la recuperación y la amplitud de la recuperación (Df) en el estado estacionario que se determine. Además, la comparación de FRAP con y sin FLIP permite la proporción de recuperación atribuible a la difusión lateral para ser calculado. Además, en el mismo experimento, las regiones de no-photobleached dendrita adyacente a las regiones que flanquean photobleached puede serevaluación cualitativa durante la recuperación, la pérdida de fluorescencia observado en estas regiones se debe a la difusión lateral de los receptores de photobleached en estos segmentos no photobleached de la dendrita. Este protocolo selectivo photobleaching puede ser utilizado para investigar una variedad de procesos celulares tales como el tráfico que caracteriza excocytosis en la membrana plasmática en subáreas definidas (por ejemplo, las dendritas o espinas) FRAP o evaluar la contribución de la inserción lateral de frente de difusión mediante la realización de FRAP paralelo y los -FLIP &#39;protocolos a lo largo de dendritas adyacentes (Fig. 3). Es evidente que, mientras que las directrices específicas se han presentado, cada laboratorio deberá optimizar los parámetros de imagen de acuerdo a las muestras y equipos específicos. Es importante destacar que todos los receptores de la superficie en el ROI necesitan ser photobleached, independiente del plano focal del eje z, pero sin daño significativo fototóxico o fotoblanqueo no específica. Nosotrosres deben tener precaución cuando se trata de este protocolo en el soma celular, como el alto porcentaje de los compartimentos intracelulares de pH relativamente bajos por lo general resulta en la fluorescencia de fondo de alta en estas regiones. Además, aunque se ha demostrado que esta técnica se puede aplicar de varias formas, antes de comenzar los experimentos selectivos photobleaching en un nuevo septiembre de etiquetado construir, se aconseja que una caracterización inicial de los receptores marcados se llevó a cabo primero, como se ha descrito por Ashby et al 2. En general, este método es una adaptación potente y versátil del protocolo estándar de FRAP, lo que permite los eventos de inserción en la membrana plasmática que se evalúan en tiempo casi real.

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nombre del reactivo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentarios (opcional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cubreobjetos de vidrio de 24 mm</td&gt;<td&gt; VWR International</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-l-lisina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<td&gt; 1mg/ml en tampón de borato a cubreobjetos capa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medio Neurobasal</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td&gt; 2% en el enchapado neuronal y la alimentación de medio</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; La penicilina estreptomicina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<td&gt; 1% en medio de placas neuronal y la alimentación</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-glutamina</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td&gt; 2 mM / 0,8 mM en el platinado / alimentación del medio</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; El suero de caballo</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td&gt; 10% en los medios de galvanoplastia neuronales sólo</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PSIN ReP5 vector de clonación</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt; Para la producción de virus de Sindbis</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META confocal sistema de</td&gt;<td&gt; Zeiss</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Imagen de J Software</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Software de libre acceso. Todos los plugins que se describen en este documento están disponibles en<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; Http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching

<p class="jove_content"&gt; Las proteínas de membrana como receptores y canales iónicos someterse a la trata de activos en las neuronas, que son altamente polarizada y compleja morfología. Este tráfico dirigido es de fundamental importancia para proporcionar, mantener o eliminar las proteínas sinápticas.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Super-eclíptica pHluorin (SEP) es un derivado sensible al pH de eGFP que ha sido ampliamente utilizado para imágenes de células vivas de las proteínas de la membrana plasmática<sup&gt; 1-2</sup&gt;. A pH bajo, la protonación de septiembre disminuye la absorción de fotones y elimina emisión de fluorescencia. Como el tráfico de eventos intracelulares más ocurren en los compartimientos con un pH bajo, donde septiembre de fluorescencia se eclipsa, la señal de fluorescencia de SEP-etiquetados proteínas es predominantemente de la membrana plasmática donde el septiembre se expone a un ambiente de pH neutro extracelular. Cuando se ilumina en septiembre de alta intensidad, como cualquier tinte fluorescente, es irreversible fotodañada (photobleached)<sup&gt; 3-5</sup&gt;. Es importante destacar que, debido a un pH bajo apaga la absorción de fotones, que en la superficie expresada septiembre puede photobleached mientras que septiembre intracelular no se ve afectada por la iluminación de alta intensidad<sup&gt; 06.10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; FRAP (recuperación después de fluorescencia photobleaching) de la SEP de etiquetado proteínas es una técnica conveniente y eficaz para evaluar la dinámica de proteínas en la membrana plasmática. Cuando las proteínas marcadas con fluorescencia se photobleached en una región de interés (ROI) la recuperación de la fluorescencia se produce debido al movimiento de crudos proteínas septiembre-etiquetados en la región blanqueada. Esto puede ocurrir a través de la difusión lateral y / o de exocitosis de no photobleached receptores suministrado ya sea por<em&gt; Novo</em&gt; Síntesis o reciclaje (ver fig. 1). La fracción de proteína inmóvil y móvil puede ser determinada y la movilidad y la cinética de la fracción difusible puede ser interrogado en condiciones basales y estimuladas tales como la aplicación agonista o estímulos neuronales de activación tales como NMDA o aplicación de KCl<sup&gt; 8,10</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Se describen las técnicas de photobleaching diseñados para visualizar selectivamente la recuperación de la fluorescencia atribuible a la exocitosis. En pocas palabras, un retorno de la inversión se photobleached una vez como con los protocolos estándar del FRAP, seguido, tras una breve recuperación, por repetitivo blanqueo de las regiones de flanqueo. Este protocolo de &quot;FRAP-FLIP&quot;, desarrollado en nuestro laboratorio, se ha utilizado para caracterizar el tráfico del receptor de AMPA en las espinas dendríticas<sup&gt; 10</sup&gt;, Y es aplicable a una amplia gama de estudios de tráfico para evaluar el tráfico intracelular y la exocitosis.</p

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Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Este informe describe el uso de imágenes de células vivas y técnicas fotoblanquear para determinar la expresión en la superficie, las vías de transporte y la cinética de la trata de exógena expresó, sensible al pH las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en la membrana plasmática de las neuronas.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

lateral-diffusion-exocytosis-membrane-proteins-cultured-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

82.9K vistas.  University of Bristol. Este informe describe el uso de imágenes de células vivas y técnicas fotoblanquear para determinar la expresión en la superficie, las vías de transporte y la cinética de la trata de exógena expresó, sensible al pH las buenas prácticas agrarias de etiquetado proteínas en la membrana plasmática de las neuronas.

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Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Investigación

Neurociencias

Determination of Mitochondrial Membrane Potential and Reactive Oxygen Species in Live Rat Cortical Neurons

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP. A significant loss of &Delta;&Psi;m renders cells depleted of energy with subsequent death. Reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, but their accumulation in pathological conditions leads to oxidative stress. The two major sources of ROS in cells are environmental toxins and the process of oxidative phosphorylation. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress have been implicated in the pathophysiology of many diseases; therefore, the ability to determine &Delta;&Psi;m and ROS can provide important clues about the physiological status of the cell and the function of the mitochondria. 
Several fluorescent probes (Rhodamine 123, TMRM, TMRE, JC-1) can be used to determine &Delta;&psi;m in a variety of cell types, and many fluorescence indicators (Dihydroethidium, Dihydrorhodamine 123, H2DCF-DA) can be used to determine ROS. Nearly all of the available fluorescence probes used to assess &Delta;&Psi;m or ROS are single-wavelength indicators, which increase or decrease their fluorescence intensity proportional to a stimulus that increases or decreases the levels of &Delta;&Psi;m or ROS. Thus, it is imperative to measure the fluorescence intensity of these probes at the baseline level and after the application of a specific stimulus. This allows one to determine the percentage of change in fluorescence intensity between the baseline level and a stimulus. This change in fluorescence intensity reflects the change in relative levels of &Delta;&Psi;m or ROS. In this video, we demonstrate how to apply the fluorescence indicator, TMRM, in rat cortical neurons to determine the percentage change in TMRM fluorescence intensity between the baseline level and after applying FCCP, a mitochondrial uncoupler. The lower levels of TMRM fluorescence resulting from FCCP treatment reflect the depolarization of mitochondrial membrane potential. We also show how to apply the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the level of ROS in cortical neurons, first at baseline and then after application of H2O2. This protocol (with minor modifications) can be also used to determine changes in &#x2206;&#x03A8;m and ROS in different cell types and in neurons isolated from other brain regions.

We demonstrate application of the fluorescence indicator, TMRM, in cortical neurons to determine the relative changes in TMRM fluorescence intensity before and after application of a specific stimulus. We also show application of the fluorescence probe H2DCF-DA to assess the relative level of reactive oxygen species in cortical neurons.

Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

Mitochondrial membrane potential (&Delta;&Psi;m) is critical for maintaining the physiological function of the respiratory chain to generate ATP.  A ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs 4-6. Altered patterns of dendritic growth and plasticity are associated with impaired neurobehavioral function in experimental models 7, and are thought to contribute to clinical symptoms observed in both neurodevelopmental disorders 8-10 and neurodegenerative diseases 11-13. Such observations underscore the functional importance of precisely regulating dendritic morphology, and suggest that identifying mechanisms that control dendritic growth will not only advance understanding of how neuronal connectivity is regulated during normal development, but may also provide insight on novel therapeutic strategies for diverse neurological diseases.
Mechanistic studies of dendritic growth would be greatly facilitated by the availability of a model system that allows neurons to be experimentally switched from a state in which they do not extend dendrites to one in which they elaborate a dendritic arbor comparable to that of their in vivo counterparts. Primary cultures of sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rodents provide such a model. When cultured in defined medium in the absence of serum and ganglionic glial cells, sympathetic neurons extend a single process which is axonal, and this unipolar state persists for weeks to months in culture 14,15. However, the addition of either bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) 16,17 or Matrigel 18 to the culture medium triggers these neurons to extend multiple processes that meet the morphologic, biochemical and functional criteria for dendrites. Sympathetic neurons dissociated from the SCG of perinatal rodents and grown under defined conditions are a homogenous population of neurons 19 that respond uniformly to the dendrite-promoting activity of Matrigel, BMP-7 and other BMPs of the decapentaplegic (dpp) and 60A subfamilies 17,18,20,21. Importantly, Matrigel- and BMP-induced dendrite formation occurs in the absence of changes in cell survival or axonal growth 17,18.
Here, we describe how to set up dissociated cultures of sympathetic neurons derived from the SCG of perinatal rats so that they are responsive to the selective dendrite-promoting activity of Matrigel or BMPs.

We describe a protocol for using bone morphogenetic protein-7 (BMP-7) or Matrigel to selectively induce dendritic growth in primary sympathetic neurons dissociated from the superior cervical ganglia (SCG) of perinatal rats.

Inducir el crecimiento dendríticas en las neuronas simpáticas cultivadas

The shape of the dendritic arbor determines the total synaptic input a neuron can receive 1-3, and influences the types and distribution of these inputs ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an experimental approach with excellent spatial and temporal resolutions. Moreover, such an approach must also have the ability to distinguish receptors localized on the PM from those in intracellular compartments. Most importantly, detecting receptors in a single vesicle requires outstanding detection sensitivity, since each vesicle carries only a small number of receptors. Standard approaches for examining receptor trafficking include surface biotinylation followed by biochemical detection, which lacks both the necessary spatial and temporal resolutions; and fluorescence microscopy examination of immunolabeled surface receptors, which requires chemical fixation of cells and therefore lacks sufficient temporal resolution1-6 . To overcome these limitations, we and others have developed and employed a new strategy that enables visualization of the dynamic insertion of receptors into the PM with excellent spatial and temporal resolutions 7-17 . The approach includes tagging of a pH-sensitive GFP, the superecliptic pHluorin 18, to the N-terminal extracellular domain of the receptors. Superecliptic pHluorin has the unique property of being fluorescent at neutral pH and non-fluorescent at acidic pH (pH &lt; 6.0). Therefore, the tagged receptors are non-fluorescent when within the acidic lumen of intracellular trafficking vesicles or endosomal compartments, and they become readily visualized only when exposed to the extracellular neutral pH environment, on the outer surface of the PM. Our strategy consequently allows us to distinguish PM surface receptors from those within intracellular trafficking vesicles. To attain sufficient spatial and temporal resolutions, as well as the sensitivity required to study dynamic trafficking of receptors, we employed total internal reflection fluorescent microscopy (TIRFM), which enabled us to achieve the optimal spatial resolution of optical imaging (~170 nm), the temporal resolution of video-rate microscopy (30 frames/sec), and the sensitivity to detect fluorescence of a single GFP molecule. By imaging pHluorin-tagged receptors under TIRFM, we were able to directly visualize individual receptor insertion events into the PM in cultured neurons. This imaging approach can potentially be applied to any membrane protein with an extracellular domain that could be labeled with superecliptic pHluorin, and will allow dissection of the key detailed mechanisms governing insertion of different membrane proteins (receptors, ion channels, transporters, etc.) to the PM.

By tagging the extracellular domains of membrane receptors with superecliptic pHluorin, and by imaging these fusion receptors in cultured mouse neurons, we can directly visualize individual vesicular insertion events of the receptors to the plasma membrane. This technique will be instrumental in elucidating the molecular mechanisms governing receptor insertion to the plasma membrane.

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of live neurons with a specific primary antibody raised against an extracellular portion of the protein. Given that receptors are trafficked to and from the surface, if cells are permeabilized after fixation then both cell-surface and internal protein will be detected by the same labeled secondary antibody. Here, we adapted a method used to study protein trafficking (&#8220;antibody feeding&#8221;) to differentially label protein that had been internalized by endocytosis during the antibody incubation step and protein that either remained on the cell surface or was trafficked to the surface during this period. The ability to distinguish these two pools of protein was made possible through the incorporation of an overnight blocking step with highly-concentrated unlabeled secondary antibody after an initial incubation of unpermeabilized neurons with a fluorescently-labeled secondary antibody. After the blocking step, permeabilization of the neurons allowed detection of the internalized pool with a fluorescent secondary antibody labeled with a different fluorophore. Using this technique we were able to obtain important information about the subcellular location of this putative receptor, revealing that it was, indeed, trafficked to the cell-surface in neurons. This technique is broadly applicable to a range of cell types and cell-surface proteins, providing a suitable antibody to an extracellular epitope is available.

We describe a method to label protein on the surface of living neurons using a specific polyclonal antibody to extracellular epitopes. Protein bound by the antibody on the cell surface and subsequently internalized via endocytosis can be distinguished from protein remaining on, or trafficked to, the surface during the incubation.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

Cuantificación de endosomas y de las motilidades de los lisosomas en neuronas cultivadas utilizando sondas fluorescentes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...