Name: preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient
Uploaded: 2014-09-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
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The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

El siguiente protocolo se ajusta a las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y ha sido aprobado por la Facultad de Medicina y del Comité de Cuidado de Animales de Farmacia de la Universidad de Toronto. 1. Preparar Obligatorio reactivos como se indica en la Tabla 1 <ol><li> Añadir proteasa y fosfatasa (si es necesario) inhibidores a todas las soluciones de sacarosa, tampones y ddH2O a concentraciones descritas en la Tabla 1. IMPORTANTE: Realice todos los pasos a 4 ° C y pre-cool todos los reactivos y equipos antes del inicio del experimento. Etiquetar todos los tubos, incluyendo tubos de ultracentrífuga, con marcador permanente. </li></ol> 2. Disección de la región cerebral adecuada <ol><li> Sacrificar el animal por dislocación cervical o decapitación. Casa y eutanasia de animales de acuerdo con las políticas institucionales y gubernamentales en el cuidado de animales. </li><li> Eliminar rápidamente ªe cerebro del cráneo y el lugar en un bloque de disección fría. </li><li> Diseccionar la región cerebral correspondiente de tejido fresco y vaya al paso 3. </li></ol> 3. homogeneización de tejido con accionado por motor de vidrio-teflón Homogeneizador <ol><li> Coloque 50-100 mg (por SPM), o 100-200 mg (por PSD) del tejido diseccionado en un tubo de polipropileno de 13 ml marcado que contiene 4 ml de solución de sacarosa 0,32 tamponada con HEPES M. Transferir la muestra a un 15 ml cónico tejido de vidrio-teflón grinder / homogeneizador, establezca la unidad de motor a 900 rpm (posición 7) y homogeneizar la muestra con 12 golpes en un período de 30 segundos. Utilice un homogeneizador de vidrio-teflón diferente entre las muestras, o enjuagar el homogeneizador con agua destilada fría entre las muestras y seque con un Kimwipe. NOTA: Hasta 4 g de tejido se puede homogeneizar en 4 ml de solución de sacarosa 0,32 tamponada con HEPES M, sin embargo, es aconsejable usar menos tejido para asegurar fraccionamiento adecuado. </li><li> Transferir la muestra homogeneizada espalda to el mismo tubo de polipropileno de 13 ml. Reserva 100 l de homogeneizado y almacenar a -80 ° C para la cuantificación de proteínas y posterior análisis de Western blot de la fracción de proteína total. </li></ol> 4. baja velocidad de centrifugación para eliminar la fracción nuclear (rendimientos sobrenadante S1) <ol><li> Centrifugar el homogeneizado en un rotor de ángulo fijo a 900 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante (S1) a una nueva, etiquetado tubo de 13 ml y resuspender el precipitado fracción nuclear (P1) en 500 l de sacarosa 0,32 M tamponada con HEPES. NOTA: El (P1) fracción puede ser almacenado a -80 ° C y se utiliza para el análisis de transferencia de Western de la fracción nuclear. </li></ol> 5. enriquecimiento de la fracción bruta sinaptosomal (rendimientos Pellet P2) <ol><li> Centrifugar el sobrenadante (S1) a 10.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante (S2) y de reserva 500 l en un tubo de microcentrífuga para almacenar a -80 ° C para su posterior quant proteínaficación y análisis de Western blot de la fracción de membrana citosólica / luz. Resuspender el restante sinaptosomal crudo fracción de sedimento (P2) en 1 ml de solución de sacarosa tamponada con HEPES 0,32 M y luego agregar otra solución de sacarosa tamponada con HEPES 3 ml de 0,32 M. </li><li> Se centrifuga a 10.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante (S2 &#39;) y de reserva 500 l en un tubo de microcentrífuga para almacenar a -80 ° C para la cuantificación de proteínas y posterior análisis de Western blot de la fracción de membrana citosólica / luz. Guarde el lavado de pellets sinaptosomal crudo (P2 &#39;) en el tubo de polipropileno. </li></ol> 6. lisis (Hipoosmótico Choque) de la Fracción crudo sinaptosomal <ol><li> Lyse el pellet sinaptosomal crudo (P2 &#39;) en el tubo de polipropileno mediante resuspensión en 1 ml de ddH 2 O. Añadir otro 3 ml de ddH2O, transfiera a un homogeneizador de tejidos de vidrio-teflón, y homogeneizar a mano con 3 golpes. NOTA: Es importantepara llevar a cabo este paso lo más rápidamente posible y rápidamente vaya al paso 6.2. </li><li> Muestras de traslado desde el homogeneizador de nuevo en el mismo tubo de polipropileno de 13 ml y ajustar rápidamente la muestra de nuevo a 4 mM HEPES con 16 l de una solución 1 M HEPES, invierten para mezclar. </li><li> Girar las muestras a 4 ° C durante 30 minutos para asegurar la lisis completa. </li></ol> 7. Enriquecimiento de la Fracción sinaptosomal Membrana (P3) <ol><li> Centrifugar a 25.000 x g durante 20 min a 4 ° C. Retire el crudo vesicular fracción sobrenadante (S3) y reservar en un tubo de 5 ml para almacenar a -80 ° C para la posterior cuantificación de proteínas y análisis de transferencia Western. Resuspender la fracción de membrana de sinaptosomas (P3) en 1 ml de solución de sacarosa 0,32 tamponada con HEPES M. </li></ol> 8 Preparación del gradiente de sacarosa discontinuo <ol><li> Pipetear exactamente 3,5 ml de solución de sacarosa tamponada con HEPES 1,2 M y exactamente 3,0 ml de cada uno de 1,0 M y 0,8 M HEPESolución de sacarosa S-guardado en separadas 6 ml complemento de tubos con cierre. NOTA: Esto se hace para medir la validez de los volúmenes de las memorias intermedias que se utilizan para hacer que el gradiente de sacarosa. La medición exacta de los volúmenes es importante asegurarse de que los gradientes resultantes serán equilibradas para ultracentrifugación. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio y el bulbo, transferir solución de sacarosa 1,2 M tamponada con HEPES a los 12 ml tubo ultracentrifugadora polialómero. Capa cuidadosamente la solución de sacarosa tamponada con HEPES 1,0 M en la parte superior de la solución de sacarosa tamponada con HEPES 1,2 M. Finalmente, la capa de la solución de sacarosa tamponada con HEPES 0,8 M en la parte superior de la solución de sacarosa tamponada con HEPES 1,0 M. Utilice una pipeta Pasteur nueva para cada solución de sacarosa y tener cuidado de no alterar el gradiente de sacarosa. Las vibraciones de un vórtice banco o microcentrífuga esperar perturbaciones de la integridad de la gradiente. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur, la capa de la fracción de membrana sinaptosomal se resuspendió (P3) en la parte superior del gradiente discontinuo de sacarosa preparada.Asegúrese de que los gradientes se equilibran con un peso en el interior del cubo de rotor basculante. Si los cubos no están equilibradas, utilizar una pipeta P200 para agregar cuidadosamente sacarosa 0,32 M tamponada con HEPES a la parte superior del gradiente y el equilibrio de los cubos del rotor. </li></ol> 9. El fraccionamiento de la membrana plasmática sináptica (SPM) <ol><li> Ultracentrífuga en un rotor basculante a 150.000 xg durante 2 horas a 4 ° C. Retire con cuidado los gradientes de sacarosa de los cubos de ultracentrífuga. Uso de un 18 G aguja y una jeringa de 1 ml, perforar el tubo en la parte inferior de la solución de sacarosa tamponada con HEPES interfase 1,0 M / 1,2 M y retirar la capa de membrana plasmática sináptica (SPM). </li><li> Anote el volumen que cada muestra de SPM ocupa en la jeringa de 1 ml. Coloque la capa de SPM recogido en 3,5 ml tubos de ultracentrífuga de pared gruesa, añadir exactamente 2,5 volúmenes de 4 mM HEPES para ajustar la concentración de sacarosa de 1,2 M a 0,32 M. Una vez cada muestra ha sido ajustared a 0,32 M de sacarosa, equilibrar los tubos con 0,32 solución de sacarosa tamponada con HEPES M. </li><li> Ultracentrífuga en un rotor de ángulo fijo a 200.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Retire y deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet sináptica membrana plasmática (SPM) en 300 l de 50 mM EDTA solución HEPES / 2 mM. Guardar las muestras a -80 ° C hasta su utilización para el Western Blot. </li></ol> 10 Preparación de la Fracción de densidad postsináptica (PSD) <ol><li> Descongele las muestras de SPM en hielo. </li><li> Hacer una solución de 0,54% de Triton X-100 en 50 mM de solución EDTA HEPES / 2 mM. </li><li> En un tubo de poliestireno de 5 ml, se combinan 2,7 ml de Triton X-100 / / solución de EDTA y 300 l fracción SPM HEPES y rotar la muestra durante 15 min a 4 ° C </li><li> Muestras de traslado hasta 3,5 ml tubos de ultracentrífuga de pared gruesa y Centrifugar las muestras a 32.000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Reservar el sobrenadante (Triton X-100 fracción soluble [TS]) y se almacena a -80; ° C. NOTA: En esta etapa, el sedimento representa el &quot;PSD-1T&quot; fracción. Un segundo tratamiento con detergente producirá una &quot;PSD-2T&quot; fracción. Si se desea una fracción PSD-1T, continúe en el paso 10.6. <ol><li> Para producir una fracción PSD-2T, resuspender el sedimento en 3 ml de 0,5% de Triton X-100 en 50 mM HEPES / EDTA 2 mM solución. Gire las muestras durante 15 minutos a 4 ° C. Centrifugar las muestras a 32.000 xg durante 20 min a 4 ° C y continuar con el paso 10.6. </li></ol></li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender el postsináptica (PSD) pellet en solución de 50 mM de HEPES / EDTA 2 mM. NOTA: El volumen de resuspensión puede depender del tamaño de la pastilla; Se recomienda un volumen de 50-75 l. Debido a que el PSD fracción es una fracción insoluble en detergente, a menudo es necesario añadir 1-2 l de 0,5% de SDS para permitir la resuspensión completa de proteínas. Guardar las muestras a -80 ° C hasta su utilización para el Western Blot. </li></ol>

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E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Hay varios pasos en el proceso que son críticos para un resultado exitoso. En el paso 3, es importante que un grado consistente de homogeneización se logra para cada muestra. Cuando la homogeneización de tejido con el homogeneizador accionado por motor, una velocidad constante se utiliza no sólo para la rotación de la mano del mortero, pero también con el número de golpes. El tiempo de incubación durante el choque osmótico debe ser preciso, ya que la homogeneización ampliada o de la incubación en la solución...

Las neuronas se comunican a través de las sinapsis, y la calidad de esta comunicación está regulada en gran medida por las alteraciones en la composición de las proteínas en la sinapsis. En particular, las proteínas localizadas en la densidad post-sináptica participan en la comunicación neuronal por receptores de neurotransmisores íntimamente andamiaje con sus sistemas de transducción de señales 1. Además, los cambios duraderos en la fuerza de la eficacia sináptica son controlados por la adición o eliminación de los receptores a la densidad post-sináptica 1-6. Por lo tanto, el aislamiento y la cuantificación de las proteínas sinápticas es una técnica necesaria y útil para comprender mejor la forma en que las neuronas responden a estímulos y alterar la eficacia sináptica 7. Este artículo describe una técnica común para aislar proteínas sinápticas de tejido cerebral de roedor por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa discontinuos. La fracción de membrana plasmática sináptica puede ser enriquecido y aislado basándose en elsu densidad en sacarosa, que ha sido determinado empíricamente para ser similar a 1.2 M de sacarosa. Dependiendo de la pregunta biológica, fracciones subcelulares se pueden separar por gradientes continuos o discontinuos de Percoll, ya sea sacarosa o. Gradientes continuos permiten la separación de las proteínas en fracciones múltiples; esto puede ser particularmente útil para demostrar la co-localización de las proteínas dentro de una fracción dada 8. Sin embargo, la preparación de gradientes continuos es más laborioso y no es necesaria para muchas aplicaciones. Gradientes discontinuos son comparativamente más fáciles de preparar y se pueden utilizar para separar proteínas en unas pocas fracciones, definidos en general-. Gradientes discontinuos que están compuestos de tres capas de sacarosa de molaridad creciente han sido ampliamente utilizados para aislar proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica (SPM). Esta fracción de membrana plasmática sináptica se puede procesar adicionalmente a la fractio densidad post-sináptican (PSD) por tratamiento con detergente y el aislamiento de la fracción insoluble en detergente. Cuando este proceso fue descrito por primera vez en el 1960 de 9,10, se utilizó microscopía electrónica para demostrar los orgánulos y membranas que definen aproximadamente la membrana plasmática sináptica y fracciones de densidad post-sináptica 9-14. Estos estudios demostraron la inclusión de membranas pre y post-sinápticas y vesículas sinápticas en la fracción SPM; después de tratamiento con detergente principalmente el electrón-densos, las densidades de post-sinápticas eran visibles. En el procedimiento, un choque hipotónico se utiliza para evitar el paso de los procesos sinápticos desde el cuerpo celular 10. Este paso se aprovecha del hecho de que las mitocondrias son más resistentes a choque osmótico y permanecen intactos, y por lo que se sedimentan en la parte inferior del gradiente de sacarosa (Figura 1). Utilizando esta misma técnica de enriquecimiento, las fracciones de SPM y PSD fueron primero bioquímicamentedefinido por electroforesis en gel de poliacrilamida y la secuenciación de los principales componentes de la proteína de 15-17. El análisis de transferencia Western Posteriormente se ha utilizado para detectar y cuantificar los niveles de proteínas sinápticas y definir estas fracciones (Figura 2). Hemos utilizado esta técnica en nuestros laboratorios para cuantificar los cambios en los niveles sinápticos de transportador de dopamina que se producen cuando el locus SLC6A3 se duplica en ratones 18. También hemos utilizado esta técnica en ratones deficientes del receptor NMDA para descubrir reducciones sinápticos específicos en las proteínas que forman parte de la interactome DISC1 19. Es evidente a partir de análisis de transferencia Western que las fracciones SPM contienen proteínas sinápticas membrana de la vesícula, marcadores endosoma, proteínas asociadas a la membrana mitocondrial, enzimas sintéticas y moléculas de transducción de señales, así como componentes integrales de la densidad post-sináptica y las membranas plasmáticas sinápticas 20-23. Efracciones PSD VEN pueden tener contaminación con abundantes proteínas mitocondriales y puede ser necesario realizar una segunda sedimentación gradiente o etapas de purificación adicionales para eliminarlos 13. Recientemente, la espectrometría de masas cuantitativa ha proporcionado una lista de más de 100 proteínas en la densidad post-sináptica solo, así como una indicación de la abundancia relativa de estos componentes 24,25.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

Técnicas de fraccionamiento subcelular neuronales permiten la cuantificación de proteínas que son objeto de trata hacia y desde la sinapsis. Como se describió originalmente en la década de 1960, las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica se pueden aislar mediante ultracentrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa. Una vez que se aislaron las membranas sinápticas, el complejo macromolecular conocido como la densidad post-sináptica puede ser posteriormente aislado debido a su insolubilidad detergente. Las técnicas usadas para aislar las membranas plasmáticas sinápticas y proteínas de densidad post-sinápticas siguen siendo esencialmente la misma después de 40 años, y se utilizan ampliamente en la investigación neurocientífica actual. Este artículo detalla el fraccionamiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica y post-sináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa. Preparaciones de proteínas resultantes son adecuadas para el Western Blot o análisis DIGE 2D.

La preparación del gradiente de densidad de sacarosa debe dar lugar a una clara separación de las tres soluciones molares de sacarosa (0,8, 1,0, y 1,2 M de sacarosa). Véase la Figura 3A para un ejemplo del gradiente antes de añadir la muestra de proteína. Si el gradiente se prepara con demasiada antelación, o si se prepara en una superficie de la mesa con la vibración de otro equipo, el gradiente se verá comprometida y no se logra una separación adecuada. Si una clara separación de las tres so...

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Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Este artículo detalla el enriquecimiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica por ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. También se describe la preparación posterior de las proteínas de densidad post-sináptica. Preparaciones de proteínas son adecuados para el Western Blot o análisis DIGE 2D.

Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K vistas.  University of Toronto.  Este artículo detalla el enriquecimiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica por ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. También se describe la preparación posterior de las proteínas de densidad post-sináptica. Preparaciones de proteínas son adecuados para el Western Blot o análisis DIGE 2D. 

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Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Investigación

Bioquímica

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neurociencias

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

Ultracentrifugación de gradiente de densidad para investigar el reciclaje endocítico en células de mamíferos

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

Perfilado de polisomas sin fabricantes de gradiente ni sistemas de fraccionamiento

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

Aislamiento de sitios de contacto mitocondrial

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

Autor destacado: Desvelando los sitios de contacto mitocondrial y los conocimientos arquitectónicos 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

Resumen

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Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un

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Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

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Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje