Este trabajo fue apoyado por una beca de la Wellcome Trust (Ref: 084277).

1. Granulares del cerebelo Preparación Neurona <ol><li> Autoclave de aproximadamente 100 mm de diámetro 25 cubreobjetos (Tabla 1). </li><li> Cubreobjetos en un tubo de 50 ml estéril que contiene estéril poli-D-lisina solución (Cuadro 2). Coloque sobre una plataforma giratoria de 2 h para cubrir los cubreobjetos. </li><li> Seco cubreobjetos recubiertos de papel de seda estéril en una campana de flujo laminar (Tabla 1). </li><li> Cubreobjetos estériles en lugar de placas de 6 pocillos y Cubreobjetos de calor en una incubadora de CO 2 (Tabla 1). Se puede almacenar durante 1 mes a 4 ° C para antes de su uso. </li><li> Practicar la eutanasia a 7 días de edad ratas Sprague Dawley cachorro de acuerdo a las pautas locales de comité de ética. Hemos sacrificado crías por dislocación cervical. </li><li> Diseccionar el cerebelo y colocarlo en una placa de Petri estéril que contiene una solución de sales de tampón fosfato (solución B, Tabla 3). </li><li> Repita los pasos 1.5 y 1.6 de 6.4 crías de rata. </li><li> Cerebelo se colocan en la etapa estéril de un tejido McIlwain ChoPPER (Tabla 1). Tejido se corta a 375 micras intervalos antes de girar el escenario a través de 90 ° y repetir el proceso. </li><li> El cerebelo picados se transfieren a una solución de tripsina (solución T, Tabla 4) que había sido previamente calentado a 37 ° C. </li><li> Incubar cerebelo a 37 ° C durante 20 min con agitación suave aproximadamente cada 5 minutos. </li><li> Durante la digestión tríptica, llama pulir tres pipetas de vidrio estériles (Tabla 1) con una llama de mechero Bunsen. Utilizar el fuego para crear un agujero bien, un agujero medio y un agujero de ancho en la desembocadura de las pipetas. </li><li> Después de la incubación de 20 minutos en la T solución, añadir 20 ml de una solución de inhibidor de tripsina / DNasa (solución de W, tabla 5) a la suspensión del cerebelo y las células de pellets a 1.000 g durante 1 min en una centrífuga de mesa (Tabla 1). </li><li> Se decanta el sobrenadante y resuspender el botón celular en 1,5 ml de una solución concentrada de tripsina / DNasa inhibidor (solución C, Tabla 6) con la más amplia pipeta de diámetro. </li><li&gt; Triturar las células utilizando primero la pipeta de ancho agujero, entonces el medio de diámetro y, finalmente, el agujero estrecho hasta que la suspensión celular homogénea. Este es un paso clave, la suspensión debe ser homogénea en esta etapa. </li><li> La capa de células en suspensión en la parte superior de 10 ml de una precalentado (37 ° C) de albúmina sérica bovina solución de sales equilibrada complementada Earles (Tabla 7) en un tubo estéril de 15 ml. </li><li> Centrifugar la suspensión durante 5 minutos a 1.500 gy resuspender el botón celular en 2 ml de precalentado (37 ° C) medio de cultivo (Tabla 8). </li><li> Estimar el número de células con un hemocitómetro (Cuadro 1) y diluir la suspensión de células a una densidad final de 3,3 x 10 6 células por ml. </li><li> Las células se colocan mediante la adición de 75 l de la suspensión de células en el centro de poli-D-lisina cubreobjetos (densidad final de 2,5 x 10 5). </li><li> Las placas de cultivo que contiene el cubreobjetos se colocan en la incubadora de CO 2 durante 60 minutos para permitir que las células a unaDhere. </li><li> Añadir 1,5 ml de medio de cultivo en cada pocillo con cuidado de no molestar a las células chapada y regresar las placas de cultivo a la incubadora de CO 2. </li><li> Al día siguiente, reemplazar el medio de cultivo con medio de cultivo fresco suplementado con el inhibidor de la mitosis arabinósido de citosina (Tabla 8). Esta proliferación detenciones de células gliales en la cultura. </li></ol> 2. Montaje experimental <ol><li> Montaje experimental básico debe consistir en lo siguiente (ver Cuadros 1 y 9 para el equipo y el software que se utiliza): <ul><li> Invertida epi-microscopio de fluorescencia </li><li> Cámara CCD refrigerada </li><li> Fuente de luz fluorescente (luz monocromador o rueda de filtros) </li><li> Gravedad aparato de perfusión </li><li> Imágenes de cámara con electrodos de platino en paralelo </li><li> Estimulador eléctrico </li><li> Computadora </li><li> Software de adquisición de la imagen </li></ul></li><li> Los experimentos deben realizarse en la oscuridad o bajo luz roja conditions con una iluminación mínima de fluorescencia de la muestra para evitar colorante FM blanqueo. </li><li> Los experimentos se llevan a cabo a temperatura ambiente. Si la temperatura fisiológica es necesario, un sistema de perfusión con control de temperatura se pueden utilizar. </li></ol> 3. Preparación de la muestra <ol><li> Los cultivos deben ser utilizados después de 8-12 días in vitro. </li><li> Transferencia de un cubre solo a una solución salina (Tabla 10) durante 10 min a temperatura ambiente para permitir la estabilización en el nuevo medio. </li><li> Quitar los cubreobjetos, seca su parte inferior y la zona que rodea las células unido con un pequeño pedazo de papel toalla o papel absorbente. </li><li> Con grasa de silicona (Tabla 2), pegue el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara de imágenes. Las celdas deben estar entre los dos alambres paralelos. Grasa de silicona suficiente debe ser utilizado para sellar por completo la cámara, pero sin ningún tipo de grasa de entrar en el centro de la cámara del baño. </li><li> Vierta la cámara de baño con ~ 260 l SAlínea de solución y luego llene el tubo de entrada con la misma solución. </li><li> Pegue un cubreobjetos limpio con grasa de silicona en la parte superior de la cámara para sellarlo. La tubería de entrada y salida se puede utilizar para eliminar las burbujas de aire atrapado en la cámara. Es importante que el circuito eléctrico no se interrumpe por las burbujas de aire. </li><li> Inmovilizar la cámara de imágenes en una plataforma de acero inoxidable y comprobar si hay fugas con cuidado la perfusión de solución salina a través del tubo de entrada. </li><li> Monte la cámara montada en el escenario de un microscopio invertido, y conectar la cámara a un sistema de perfusión por gravedad, después de haber preparado la entrada con una solución salina. </li><li> Conecte los cables de conexión de la cámara al estimulador eléctrico. </li><li> Agregue una gota de aceite de inmersión con el objetivo, si un objetivo se utiliza el aceite. Centrarse en las células en el centro de la cámara con iluminación de campo claro. </li></ol> 4. S1 fase <ol><li> Neuronas perfundir con 1,5 mlFM de medio de contraste (Tabla 2) diluida en solución salina. </li><li> Estimular las neuronas para provocar la absorción de colorante con el estimulador conectado. </li><li> Después de la estimulación, las neuronas de perfusión con una solución salina fresca durante 2 minutos para quitar el exceso de tinte FM (velocidad de flujo de 7 ml / min). La contaminación gliales en el sistema de cultivo CGN es inferior al 5% 14, por lo tanto, este marco de tiempo es suficiente para quitar el tinte . </li><li> Dejar las neuronas en reposo durante 8 min. </li><li> Durante este intervalo, localizar las redes axonal en el individuo FM tinte cargado terminales nerviosas son visibles usando longitudes de onda de fluoresceína (excitación, 480 nm, emisión,&gt; 550 nm). Evite las áreas con grupos de células. Mantenga al mínimo la iluminación en este paso, ya que la excitación intensa puede dar lugar a la fototoxicidad tinte. Signos evidentes de esto son vesiculación de los axones y la falta de tinte descarga (debido a la fijación de colorante). </li><li> Re-enfoque de la imagen justo antes de la adquisición de imágenes desde una desviación leve puede haber ocurrido durante el período de descanso. </li&gt; <li> Comience lapso de tiempo de adquisición de imágenes a una velocidad de 1 fotograma cada 4 s. </li><li> Tras la adquisición de 5 a 10 imágenes de referencia, evoca la exocitosis de venta al público mediante la entrega de un estímulo de 30 Hz durante 2 s (60 potenciales de acción) 8 Comenzar la estimulación manual inmediatamente después de la captura de imágenes.. </li><li> Tras la adquisición de otras 10 imágenes, evocan exocitosis SV de la RP con tres estímulos de 40 Hz a 10 s (400 potenciales de acción), cada 30 s, aparte 8. </li><li> Adquirir otro 5 a 10 imágenes y luego la adquisición de imágenes de pausa. </li></ol> 5. Fase de recuperación (ver Figura 2) <ol><li> Permiten a las neuronas para recuperar por lo menos 20 min. </li><li> Opcional - Si el efecto de un medicamento en la endocitosis es haciéndose la prueba, las neuronas de perfusión con la solución de las drogas durante este período (Figura 2b) 3,8. </li></ol> 6. Fase S2 <ol><li> Repita el protocolo de fase S1 (sección 4) para un experimento de control utilizando el mismo campo de visión comoen S1. </li><li> Opcional - Si el efecto de un medicamento en la endocitosis es haciéndose la prueba, perfundir las neuronas con la solución de la droga complementa con FM tinte (Figura 2b) 3,8. </li><li> Opcional - Por otra parte, si los efectos del fármaco sobre la exocitosis son de interés, las neuronas de perfusión con la solución de drogas, tanto antes como durante el RRP y RP estímulos descarga (figura 2c) 3. </li></ol> 7. Análisis de Datos <ol><li> Utilice ImageJ y Microsoft Excel u otro software similar para el análisis de datos. </li><li> Para el análisis, una secuencia de imágenes en formato de pila es necesario. Algunos software de imágenes puede exportar secuencias de imágenes individuales. Si este es el caso, convertir las imágenes en una pila con un ImageJ incorporada en función de la imagen&gt; Pilas&gt; Imágenes de pila. </li><li> Ajustar el brillo y el contraste de la pila para maximizar el rango dinámico. Imagen&gt; Ajustes&gt; Brillo / Contraste (Figura 3a). </li><li> Si la deriva horizontal significativo se ha producido durante el tque experimento, ejecute StackReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a> ) y TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a> ) plugins en ImageJ para alinear la imagen de pila (Figura 3b) . </li><li> Run Time Series Analizador de plugin ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a> ) (Figura 3c). </li><li> Definir regiones de interés (ROI) a través de al menos 90 terminales de los nervios. Estos deben ser idénticas (ROI circular con un diámetro de 1,5 micras) Es útil para cambiar entre las imágenes antes y después del tinte descarga para revelar las terminales nerviosas activas (o bien una estimulación pre-imagen se puede restar de una imagen después de la estimulación). Un ideal tamaño de retorno de la inversión es la que es ligeramente más grande que una terminación nerviosa típica (Figura 3c). </li><li> Obtener la intensidad de la fluorescencia total / integral de cada ROI sobre Time y la exportación a Microsoft Excel (Figura 3d y 4a). </li><li> Normalizar las huellas retorno de la inversión al valor arbitrario misma mediante la alineación de los rastros en el plano del eje Y para el estímulo de la primera descarga en ambas fases S1 y S2 (Figura 4b-c). Esto es para controlar las variaciones en la intensidad de fluorescencia de fondo. </li><li> Medir la disminución absoluta de la fluorescencia evocada por cada estímulo descarga en unidades arbitrarias de fluorescencia para S1 y S2 de la siguiente manera (Figura 4d): <ul><li> PVP = cambio en la fluorescencia (Df) desencadenado por 30 Hz 2 s </li><li> RP = Suma de Df provocada por 3 x 40 Hz 10 s </li><li> Piscina de reciclaje total = PVP + RP </li></ul></li><li> Para cada parámetro en el 7,9, calcular el valor medio de todas las terminaciones nerviosas de un solo experimento. </li><li> Para el análisis estadístico, los valores medios obtenidos a partir de varios experimentos independientes pueden ser promediadas. El número de laminillas en vez de el número de terminaciones nerviosas se debe utilizar como el STATISTICAl n. </li></ol> 8. Los resultados representativos: Un experimento de control, donde CGNs sometido a dos ruedas de idénticas medidas de carga y descarga se representa en la figura 5. Al comenzar una serie de experimentos, es esencial que un experimento de control de este tipo se lleva a cabo cada día para confirmar que S1 y S2 son comparables antes de diferentes condiciones experimentales en S2. En este ejemplo, CGNs se cargaron con 10 M FM1-43 con un 80 Hz 10 s de estimulación (Figura 5). Figura 5b muestra FM1-43-Bornes nervio representado por fluorescentes puntos lagrimales. Rendimiento de la inversión se definieron más de 90 terminales de los nervios, como se muestra en la figura 5c. El mismo conjunto de regiones de interés se utiliza tanto para S1 y S2. Durante las dos descarga, el PVP se ha descargado primero con un 30 Hz (2 s) la estimulación seguida de RP descarga con 3 40Hz secuencial (10 s) estímulos (Figura 5). La caída de la fluorescencia en cada estímulo puede ser claramente observado y cuantificado (Figura 5d-e).<html> Cuando se examina, la fluorescencia de gotas que corresponda a la PVP, RP y piscina reciclado total fueron comparables en ambos S1 y S2. Además, el 20% de reciclado SV residido en el PVP mientras que el 80% residía en el RP, tanto en S1 y S2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" /> Figura 1 Esquema de un experimento típico de FM. A) endocitosis SV se activa en presencia de FM tinte (representado en verde). El tinte es absorbido por la membrana invagina (solo SV o endosomas a granel). B) No interiorizado del colorante en la membrana plasmática es arrastrado por la perfusión. C) Tras la aplicación de un estímulo de descarga, etiquetado SV que se han hecho disponibles para fusible de liberación con la membrana plasmática que resulta en una pérdida de fluorescencia. D) El cambio en la fluorescencia (Df), que es proporcional a la cantidad de liberados etiqueta SV puede ser cuantificado. _upload/3143/3143fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2 Manual de usuario de los posibles protocolos experimentales. A) Diagrama de flujo de un experimento de control donde las células pasan por dos rondas de FM colorante de carga y descarga (S1 y S2). Las células se pueden cargar mediante una serie de estímulos diferentes. Pasos de descarga son idénticos en que el PVP se descarga con 30 Hz durante 2 s seguido por RP descargar usando 3 veces 40 Hz durante 10 s. PVP y los estímulos reserva piscina descarga fueron separados por 40 segundos, todos los otros estímulos por 30 segundos. Las células se dejan de recuperar durante 20 minutos entre S1 y S2. Los diagramas de flujo de posibles modificaciones para probar el efecto de una sustancia ya sea B) endocitosis o C) exocitosis también se muestran. Prueba de la droga correspondiente puede ser perfundida en la cámara durante los períodos indicados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" /> Figura 3 Imágenes de análisis de datos en J de la imagen. Imágenes se muestranUna de brillo) y ajuste de contraste, B) la alineación del marco, c) Selección ROI, y D) la extracción de los valores de intensidad de uso de la imagen J. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" /> Figura 4 Imágenes de análisis de datos en Microsoft Excel. Imágenes se muestran en A) la importación de datos crudos de la imagen J (1 columna st = número del cuadro, columnas = datos de terminales nerviosas individuales) B) el ajuste de los valores de referencia S1 (cuadro 10) a un valor arbitrario (200) en el inicio del primer estímulo, C) el ajuste de los valores de referencia S2 en el fotograma 55 con un protocolo idéntico al S1, y D) la medición de las gotas de fluorescencia utilizando Microsoft Excel. Tenga en cuenta que la huella promedio se muestra en la D se utiliza para definir los puntos de tiempo antes y después de cada caída. El tamaño de las gotas de fluorescencia para cada ROI debe determinarse a partir de los valores en la hoja de cálculo se muestra en la C. <img alt="Figura 5" src = &quot;/ files/ftp_upload/3143/3143fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Representante experimento de control. A) Diagrama de flujo de un experimento de control, donde CGNs fueron cargados con 10μM FM1-43 con 80 Hz (10 s) la estimulación. Las fases de S1 y S2 son idénticos. PVP y los estímulos reserva piscina descarga fueron separados por 40 segundos, todos los otros estímulos por 30 segundos. B) Una imagen que muestra los terminales nerviosos cargados con FM1-43. C) La misma imagen que muestra B 90 ROIs contados seleccionados para el análisis. D) Las imágenes de un área representada por un recuadro rojo en la B en los puntos de tiempo seleccionado. = Antes de la estimulación basal, 30 Hz = después de la estimulación de 30 Hz 2 s, 40 Hz = 1,2,3 después de cada estimulación 40 Hz 10 s. Estas imágenes se presentan en pseudocolor para ilustrar los cambios en la fluorescencia (barra del espectro aparece a la derecha). E) Media ± SEM huella obtenida a partir de 90 terminales de los nervios se muestra en los estímulos C. individuales están representados por barras horizontales. Las barras de escala = 10 micras.

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No tenemos nada que revelar.

Colorantes FM se utilizan ampliamente para investigar la función del nervio terminal en muchas preparaciones neuronales. Ellos se han empleado principalmente para controlar la extensión de cualquiera de endocitosis SV, la rotación de SV o la cinética de la exocitosis 6. El protocolo descrito extiende estos estudios para examinar la diferencia de la descarga de determinados grupos de SV. Esto proporciona información adicional con respecto a la reposición de las piscinas SV y también su grado de movilización. Colorantes FM puede ser utilizada para etiquetar múltiples rondas de reciclaje de SV en los terminales nerviosos. Hemos explotado esta propiedad y diseñado protocolos en los que puede ser el volumen de negocios SV en cada terminal de control dos veces en los terminales nerviosos. Esto proporciona un control preciso de internos, lo cual es esencial debido a la naturaleza heterogénea de reciclaje de SV en los terminales nerviosos paralelo 11. A través de la utilización de la fase S1 como control interno, la recarga de los PVP, RP y el totalPiscina SV en la presencia de drogas puede ser confiable y comparar directamente. Además de proporcionar información sobre el tamaño absoluto del reciclaje, piscinas y RP PVP bajo condiciones de estimulación diferentes, este protocolo también puede proporcionar datos para los siguientes - 1) La división de SV entre el PVP y RP en función de la piscina de reciclaje de S1 y S2, 2) el tamaño relativo de las piscinas S2 (RRP y RP) en función de la reserva total de reciclaje de S1 y 3) el tamaño relativo de cualquier grupo de SV se define en el S2 en función de la misma piscina en S1. Este protocolo en particular no proporcionará información sobre la cinética de descarga sin embargo, desde el tiempo de adquisición es demasiado lento (para mediciones cinéticas tiempos de adquisición deberá ser tan rápida como sea posible y descarga sincronizan automáticamente para capturar la imagen). Nuestros 30 Hz 2 estímulos s evoca una medida idéntica de PVP descarga de sacarosa hipertónica 8. Dado que el tamaño de la venta al públicose define por la sacarosa hipertónica descarga 15, se puede afirmar que este protocolo de descarga todos los SV PVP, de acuerdo con estudios en las neuronas del hipocampo 16. La reserva está casi completamente agotados por tres trenes de 400 estímulos (40 Hz 10 s cada uno), ya que este estímulo se descarga una cantidad idéntica de medio de contraste para un nuevo paradigma (2 estímulos con KCl 50) que reduce el 95% de todos los SV marcado tinte 8,17. Cuantificación exacta de la magnitud tanto de la PRR y el fondo de reserva también depende de la adquisición de la información dentro del rango lineal dinámico de la cámara CCD. Este protocolo simple también se puede modificar aún más. La fuerza de los estímulos de carga también se puede variar para determinar cómo la actividad neuronal y diferentes modos de endocitosis afectan reposición de SV de la piscina. Además, más de dos ciclos de carga y descarga también se puede realizar si es necesario. Este protocolo también se puede utilizar en las células transfectadas con sobreexpresión oARNhc vectores. Debido a la baja eficiencia de transfección de cultivos primarios de neuronas, proteínas que se expresan deben ser etiquetados con proteínas fluorescentes. Es esencial que estas etiquetas fluorescentes no interfieran con la señal de FM tinte (cian o utilizar proteínas de color rojo, por ejemplo). En este caso, las terminaciones nerviosas de las células transfectadas y no transfectadas, en el mismo campo de visión también puede ser comparado como un control adicional 8. En los experimentos de una comparación de la magnitud de la carga entre las cargas S1 y S2 es de poco valor, ya que la perturbación está presente durante las dos cargas. Partición de tinte entre piscinas SV todavía se pueden visualizar sin embargo 8. Periodistas genética llamada pHluorins también se puede emplear para controlar la exocitosis y la endocitosis SV en cultivos neuronales primarios. Estas sondas utilizan un pH sensible a la proteína fluorescente verde en el medio ambiente pH luminal de los dominios de las proteínas marcadas SV como VAMP, sinaptofisina y VGLUT1 18 </sup&gt;. Cuando se utiliza junto con inhibidores de la ATPasa vesicular, pHluorins puede reportar tanto la cinética y la magnitud de la movilización de la piscina SV 19. El enfoque basado en FM-dye descrito aquí tiene algunas ventajas sobre la técnica pHluorin, En primer lugar, colorantes FM proporcionar información sobre el modo SV endocitosis repone el RRP y las piscinas de reserva 8. Piscinas SV segundo lugar específicos pueden ser etiquetados con tintes de FM que tienen diferentes propiedades espectrales 20 y, finalmente, no hay ningún requisito para la transfección. Colorantes FM no puede proporcionar información sobre el tráfico entre el SV y el reciclaje de descanso piscinas SV sin embargo (en contraste con pHluorins 19), ya que por definición SV tiene que ser cargado con medio de contraste durante la endocitosis para ser visibles. Así, tanto los tintes FM y pHluorins tienen fortalezas y debilidades, y son más potentes cuando se utilizan en experimentos independientes para hacer frente a la misma pregunta. Imágenes de alta calidad son esenciales para el análisis de validez y reproducibLe resultados. Mientras que la deriva horizontal puede ser fácilmente corregido, los experimentos en los que hay un desvío en el eje Z no se pueden recuperar. Por esta razón, es importante re-enfocar las imágenes antes de comenzar la descarga S1 y S2. En los casos en un deterioro significativo se ha producido fluorescentes, las correcciones de la caries se puede aplicar (por lo general, restando una huella previamente grabado de FM-cargado las células en ausencia de estimulación). Sin embargo, se sugiere que la corrección de la decadencia sólo se realiza para la representación gráfica y no a ser utilizado para cualquier análisis cuantitativo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM Rev. 3 Cámara Digital </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio Observer.A1 Microscopio </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> Placas de cultivo celular (6 pozos) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Centrífuga (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> Incubadora de CO 2 </td><td> Heraeus Instrumentos </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> Tubos Falcon (15/50 ml) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0.75 ∞ / 0.17 Objetivo </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> Vidrio cubreobjetos (Ø25mm) </td><td> VWR International </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> Pipetas Pasteur de vidrio (230 nm) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> Imágenes de la cámara </td><td> Warner </td><td> RC-21 SLRV </td></tr><tr><td> Campana de flujo laminar </td><td> BIOHIT </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain Chopper tejido </td><td> Mickle Laboratorio de Ingeniería Co. Ltd. </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> Lámpara de mercurio </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim estimulador del sistema eléctrico (100 mV, 1 ms ancho Pluse) </td><td> Digitimer Ltd. </td><td> D330 </td></tr><tr><td> Perfusión de la bomba </td><td> Watson-Marlow </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Pipetas serológicas (05/10/25 ml) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> Shutter controlador </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> Jeringa (20 ml) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> Filtros de jeringa (Minisart - 0,20 micras) </td><td> Sartorius Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 seis canales controlador de válvula </td><td> Warner </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP filtranter teléfono (46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Equipos específicos y aparatos utilizados <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> BioScience Cambridge </td><td> BT70021 </td><td> 10 M </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> BioScience Cambridge </td><td> BT70044 </td><td> 100 M </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P7886 </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td> Grasa de silicona </td><td> Sigma </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos específicos utilizados <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 0,3% </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 mg/100 ml </td></tr></tbody></table> -100ml hacer de nuevo para cada preparación -Filtro estéril antes de su uso Tabla 3. Solución B para la preparación de CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> Solución B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 ml </td></tr><tr><td> Tripsina (5 mg / ml, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9201 </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Solución de T para la preparación de CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> Solución C </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> Solución B </td><td align= &quot;Center&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16,8 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 5. Solución de W para la preparación de CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> Desoxirribonucleasa (DNasa, 500 U por 0,5 ml de valores, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> Solución B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Inhibidor de tripsina de soja (SBTI, 0,5 mg por 0.5 ml de valores, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9003 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabla 6. Solución C para la preparación de CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Solución salina balanceada de Earle (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 3 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 7. EBSS solución para la preparación de CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> Citosina β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td> 10 M </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Sigma </td><td> G3126 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> Medio mínimo esencial (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Penicilina (P) / estreptomicina (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (p), 100 mg / ml (S) </td></tr></tbody></table> * Ara-C debe ser añadido al medio a partir del 1 DIV Tabla 8. Medios de cultivo para la preparación de CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Versión </th><th> Empresa </th></tr><tr><td> AxioVision Rel. </td><td> 4.8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> Institutos Nacionales de Salud </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> Microsoft </td></tr></tbody></table> Tabla 9. Programas informáticos específicos que se utilizan <table border="1"><tbody><tr><th> Nombre </th><th> Empresa </th><th> Catálogo no. </th><th> Concentración </th></tr><tr><td> De CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,3 mM </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td> 0,4 mM </td></tr><tr><td> De MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mM </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> BDH Suministros de Laboratorio </td><td> 10264 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> TES </td><td> Sigma </td><td> T1375 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table> Tabla 10. Solución salina (pH 7,4)

quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using fm dyes

Después de la liberación de neurotransmisores en las terminaciones nerviosas centrales, SV son rápidamente recuperados por endocitosis. Consultado el SV se volvió a llenar con los neurotransmisores y reincorporarse a la piscina de reciclaje, definida como la SVS que están disponibles para 1,2 exocitosis. La piscina de reciclaje en general, se puede subdividir en dos grupos distintos - la piscina fácilmente liberable (PVP) y el fondo de reserva (RP). Como sus nombres lo indican, el PVP se compone de SV que están disponibles de inmediato para la fusión, mientras que RP SV sólo se liberan durante 1,2 estimulación intensa. Es importante tener un método seguro de que los informes de la reposición diferencial de estas piscinas SV a fin de comprender 1) cómo SV tráfico después de los diferentes modos de endocitosis (como clatrina dependiente de la endocitosis y la actividad dependiente de la endocitosis a granel) y 2) los mecanismos de la el control de la movilización tanto de la PRR y RP en respuesta a diferentes estímulos. Colorantes FM se emplean habitualmenteed para informar cuantitativamente el volumen de negocios SV en los terminales nerviosos centrales 3-8. Tienen una cola de hidrocarburo hidrofóbico que permite particionar reversible en la bicapa lipídica, y un grupo de cabeza hidrofílica que bloquea el paso a través de membranas. Los colorantes tienen poca fluorescencia en solución acuosa, pero su rendimiento cuántico se incrementa dramáticamente cuando particionado en la membrana de 9. Así, colorantes FM es ideal para el seguimiento de sondas fluorescentes que se reciclan activamente SV. El protocolo estándar para el uso de tinte de FM es la siguiente. En primer lugar se aplican a las neuronas y se toman durante la endocitosis (Figura 1). Después de no internalizadas tinte se lava fuera de la membrana plasmática, reciclado redistribuir SV dentro de la piscina de reciclaje. Estos SV son consumidos con estímulos descarga (Figura 1). Desde FM tinte de etiquetado de la SVS es cuántica 10, la caída de la fluorescencia resultante es proporcional a la cantidad de vesículas liberadas. De este modo, el reciclaje y la fusión de SV generados a partir de la previous ronda de la endocitosis puede cuantificarse. Aquí, se presenta un protocolo que ha sido modificado para obtener dos elementos adicionales de información. En primer lugar, los estímulos descarga secuencial se utilizan para descargar diferencialmente el PVP y la RP, para permitir la cuantificación de la reposición de determinados grupos de SV. En segundo lugar, cada terminación nerviosa se somete el protocolo en dos ocasiones. Por lo tanto, la respuesta de la terminal nerviosa mismo en S1 se puede comparar con la presencia de una sustancia de ensayo en fase S2 (Figura 2), proporcionando un control interno. Esto es importante, ya que el grado de reciclaje de SV a través de las terminales nerviosas distintas es muy variable 11. Cualquier seguidor cultivos neuronales primarios pueden ser utilizados para este protocolo, sin embargo, la densidad de la galvanización, soluciones y condiciones de estimulación están optimizados para las neuronas granulares del cerebelo (CGNs) 12,13.

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Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Una técnica en vivo imágenes de fluorescencia para cuantificar la reposición y la movilización de las vesículas sinápticas específicas (SV) se estanca en los terminales nerviosos centrales se describe. Dos rondas de SV de reciclaje son monitoreados en las terminales nerviosas que se proporciona un control interno.

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

quantitative-analysis-synaptic-vesicle-pool-replenishment-cultured

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.0K vistas.  University of Edinburgh. Una técnica en vivo imágenes de fluorescencia para cuantificar la reposición y la movilización de las vesículas sinápticas específicas (SV) se estanca en los terminales nerviosos centrales se describe. Dos rondas de SV de reciclaje son monitoreados en las terminales nerviosas que se proporciona un control interno.

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Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The vesicles are then retrieved from the plasma membrane (endocytosis) and grouped together with the general pool of vesicles within the nerve terminal, until they undergo a new exo- and endocytosis cycle (vesicle recycling). These processes have been studied using a variety of techniques such as electron microscopy, electrophysiology recordings, amperometry and capacitance measurements. Importantly, during the last two decades a number of fluorescently labeled markers emerged, allowing optical techniques to track vesicles in their recycling dynamics. One of the most commonly used markers is the styryl or FM dye 1; structurally, all FM dyes contain a hydrophilic head and a lipophilic tail connected through an aromatic ring and one or more double bonds (Fig. 1B). A classical FM dye experiment to label a pool of vesicles consists in bathing the preparation (Fig. 1Ai) with the dye during the stimulation of the nerve (electrically or with high K+). This induces vesicle recycling and the subsequent loading of the dye into recently endocytosed vesicles (Fig. 1Ai-iii). After loading the vesicles with dye, a second round of stimulation in a dye-free bath would trigger the FM release through exocytosis (Fig. 1Aiv-v), process that can be followed by monitoring the fluorescence intensity decrease (destaining).

Although FM dyes have contributed greatly to the field of vesicle recycling, it is not possible to determine the exact localization or morphology of individual vesicles by using conventional fluorescence microscopy. For that reason, we explain here how FM dyes can also be used as endocytic markers using electron microscopy, through photoconversion. The photoconversion technique exploits the property of fluorescent dyes to generate reactive oxygen species under intense illumination. Fluorescently labeled preparations are submerged in a solution containing diaminobenzidine (DAB) and illuminated. Reactive species generated by the dye molecules oxidize the DAB, which forms a stable, insoluble precipitate that has a dark appearance and can be easily distinguished in electron microscopy 2,3. As DAB is only oxidized in the immediate vicinity of fluorescent molecules (as the reactive oxygen species are short-lived), the technique ensures that only fluorescently labeled structures are going to contain the electron-dense precipitate. The technique thus allows the study of the exact location and morphology of actively recycling organelles.

FM dyes have been of invaluable help in the understanding of synaptic dynamics. FMs are normally followed under the fluorescent microscope during different stimulation conditions. However, photoconversion of FM dyes combined with electron microscopy allows the visualization of distinct synaptic vesicle pools, among other ultrastructure components, in synaptic boutons.

El estudio de Piscinas vesícula sináptica con fotoconversión de tintes estirilo

The fusion of synaptic vesicles with the plasma membrane (exocytosis) is a required step in neurotransmitter release and neuronal communication. The ...

Investigación

Neurociencias

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Difusión lateral y exocitosis de proteínas de membrana en neuronas cultivadas evaluó a través de la recuperación de fluorescencia y la pérdida de fluorescencia photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracelularmente Identificar las neuronas motoras de un músculo en la piscina Motor<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Examination of Synaptic Vesicle Recycling Using FM Dyes During Evoked, Spontaneous, and Miniature Synaptic Activities

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using styryl FM dyes, which reveal membrane turnover. Conventional protocols for the use of FM dyes were designed for analyzing neurons following stimulated (evoked) synaptic activity. Recently, protocols have become available for analyzing the FM signals that accompany weaker synaptic activities, such as spontaneous or miniature synaptic events. Analysis of these small changes in FM signals requires that the imaging system is sufficiently sensitive to detect small changes in intensity, yet that artifactual changes of large amplitude are suppressed. Here we describe a protocol that can be applied to evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities, and use cultured hippocampal neurons as an example. This protocol also incorporates a means of assessing the rate of photobleaching of FM dyes, as this is a significant source of artifacts when imaging small changes in intensity.

We describe the use of styryl FM dyes to image synaptic vesicle recycling in functional nerve terminals. This protocol can be applied not only to evoked, but also spontaneous and miniature synaptic activities. The protocol expands the variety of synaptic events that can be effectively evaluated.

El examen de la vesícula sináptica Reciclaje utilizando tintes FM Durante Evocados, espontánea, y actividades sinápticas miniatura

Synaptic vesicles in functional nerve terminals undergo exocytosis and endocytosis. This synaptic vesicle recycling can be effectively analyzed using ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

La manipulación genética de las neuronas cerebelosa gránulo<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em&gt; Estudiar Neuronal Morfología y Migración

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

Ex Vivo Imaging de Postnatal cerebelosa gránulo migración celular utilizando confocal Macroscopía

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique &#8211; described here &#8211; is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer&#8217;s or Parkinson&#8217;s disease.

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

El agotamiento selectivo de la microglía de cerebeloso gránulos Cultivos Celulares El uso de L-leucina metil éster

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating ...

High-Resolution Quantitative Immunogold Analysis of Membrane Receptors at Retinal Ribbon Synapses

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA receptors (NMDARs) and AMPA receptors (AMPARs). Physiological data have indicated that glutamate receptors at RGCs are expressed not only in postsynaptic but also in perisynaptic or extrasynaptic membrane compartments. However, precise anatomical locations for glutamate receptors at RGC synapses have not been determined. Although a high-resolution quantitative analysis of glutamate receptors at central synapses is widely employed, this approach has had only limited success in the retina. We developed a postembedding immunogold method for analysis of membrane receptors, making it possible to estimate the number, density and variability of these receptors at retinal ribbon synapses. Here we describe the tools, reagents, and the practical steps that are needed for: 1) successful preparation of retinal fixation, 2) freeze-substitution, 3) postembedding immunogold electron microscope (EM) immunocytochemistry and, 4) quantitative visualization of glutamate receptors at ribbon synapses.

The postembedding immunogold method is one of the most effective ways to provide high-resolution analyses of the subcellular localization of specific molecules. Here we describe a protocol to quantitatively analyze glutamate receptors at retinal ribbon synapses.

Resolución de alta Análisis Cuantitativo Inmunoelectrónica de Receptores de Membrana en la retina cinta sinapsis

Retinal ganglion cells (RGCs) receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells. Synaptic excitation of RGCs is mediated postsynaptically by NMDA ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

Evaluación de la Viabilidad Neuronal Utilizando Colorante de Fluoresceína-Ioduro de Propidio Doble Coloración en Gránulos Cerebelosos Cultura de Neuronas

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...