This work was supported by Ministerio de Econom&#236;a y competitividad (BFU2012-37146) and Junta de Castilla y Le&#242;n (BIO103/VA45/11, VA145U13 and BIO/VA33/13), Spain. MCR was supported by Junta de Castilla y Le&#242;n (Spain) and the European Social Fund. We thank the late Dr. Philippe Br&#251;let (1947-2013) for the mitochondrial GFP Aequorin plasmid.

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido manejados bajo los protocolos aprobados por la instalación de alojamiento de los animales de la Universidad de Valladolid, de acuerdo con la Convención Europea 123 / Consejo de Europa y la Directiva 86/609 / CEE. 1. Corto y Largo Plazo Cultura de las neuronas del hipocampo de rata <ol><li> Preparación de poli-D-lisina recubierto, 12 mm cubreobjetos de vidrio. <ol><li> Esterilizar 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro en etanol durante al menos 24 h. Deje que se seque en condiciones estériles. </li><li> Distribuir los cubreobjetos en una tira de Parafilm en una placa de Petri. Cubrir la superficie de cada cubreobjetos con 200 l de 1 mg / ml de poli-D-lisina. Permitir el tratamiento de O / N. </li><li> El día siguiente lavado los cubreobjetos con agua bidestilada estéril cada 15 min durante 90 min en condiciones estériles. </li><li> Llenar una placa de cuatro pozos multiplaca con 500 l de Neurobasal medio de cultivo por pocillo. Neurobasal medio de cultivo debe ser complementado conSuero bovino fetal al 10%, 2% B27, 1 mg / ml de gentamicina y 2 mM L-glutamina. </li><li> Coloque el cubreobjetos en la placa multiplaca. Mantener en un humidificado 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora hasta su uso. </li></ol></li><li> Aislamiento de las neuronas del hipocampo de ratas neonatales. <ol><li> Preparar 1,8 ml de solución de papaína (directa comprado) en un vial (20 l / ml) en condiciones estériles: para obtener una concentración final de 20 l / ml de añadir alrededor de 40 l papaína en 1,8 ml de Hank, más 0,6% de BSA (l debe calcularse dependiendo de las condiciones de proveedores). De Hank 0,6% de BSA se prepara mezclando 85 ml de medio HBSS con 15 ml de albúmina de suero bovino al 4% (BSA, preparado la solución de 4 g de BSA en 100 ml HBSS). Preparar en una campana estéril. </li><li> Incubar la papaína en Hank de más 0,6% de BSA durante 30 min a 37 ºC antes de su uso. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 micras antes de su uso. </li><li> Preparar medio F-12 de Ham añadiendo DulbeccoModificado polvo de Medio de Eagle (13,5 g por L) en 900 ml de agua bidestilada estéril. A continuación, añadir 6 g de HEPES y 336 mg NaHCO3 y ajustar el pH a 7,42 con NaOH 4 N. Añadir agua estéril para obtener una solución de 1 L y filtrarla usando una polietersulfona 0,20 micras (PES) botella de filtro superior. Realizar este proceso en una campana estéril. Finalmente saturar la solución con CO 2 en condiciones estériles antes de su uso. Soluciones Almacenar a 4 ºC y utilizarlos refrigerada. </li><li> La eutanasia a recién nacido (P0) crías de ratas por decapitación y se lava la cabeza en medio HBS estéril. Abra el cráneo con la ayuda de unas tijeras estériles. Extraer el cerebro con una espátula y lavar rápidamente en medio F-12 de Ham. </li><li> Haga un corte diagonal con la ayuda de un bisturí en cada hemisferio (Figura 1B), y llevarla a una placa de Petri que contiene medio F-12 de Ham. </li><li> Meninges Descartar cuidadosamente con la ayuda de unas pinzas de disección y bajo una lupa. </li> &lt;li&gt; Identificar el hipocampo en una zona cóncava característica más de la corteza usando la lupa. Luego, separe el hipocampo de la corteza tirando cuidadosamente de una frontera y de sacarlo de su posición con unas tijeras oculares. </li><li> Transferir el tejido del hipocampo a una placa de 4 bien lleno de medio estéril de Hank carente Ca 2+ y Mg 2+, más 0,6% de BSA y lavar el tejido del hipocampo. Sin retirar los medios de comunicación cortar el tejido en trozos pequeños (alrededor de 2 x 2 mm) utilizando las mismas tijeras oculares. </li><li> Transferencia piezas de hipocampo a un vial que contiene 1,8 ml de solución de papaína pre-filtrada. Entonces incuban a 37 ºC con ocasional, agitación suave. 15 min después, añadir 90 l de solución de DNasa I (50 mg / ml final) y se incuba durante 15 min adicionales. </li><li> Transferir el tejido a un tubo de centrífuga de 10 ml y lavar los fragmentos con frescos Neurobasal medio de cultivo. Obtener suspensión de células haciendo pasar los fragmentos de tejido a través de un pip plástico 5 mlette. </li><li> Suspensión de células Centrifugar a 160 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur de plástico estéril y suspender pellet cuidadosamente con una pipeta de 1 ml automatizados en 1 ml de medio de cultivo Neurobasal. </li><li> Medir la densidad de células usando una cámara de recuento Neubauer. Coloque el cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer. Añadir 10 l de suspensión celular. Asegúrese de que la suspensión celular entra en la cámara de manera uniforme y sin hacer burbujas. Contar el número de células bajo el microscopio y realizar cálculos correspondientes para obtener una gota adecuada de 40 a 80 l que contiene 30 x 10 3 células. El número total de células dependerá del número de animales utilizados. </li></ol></li><li> A corto plazo y la cultura a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata. <ol><li> Sobre la placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de Neurobasal medio de cultivo preparado antes y se mantienen en la incubadora, la placa alrededor de 30 x 10 3 células en una caída de alrededor de 50 l a cadapocillo de la placa multiplaca que contiene uno poli-D-lisina, 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro. </li><li> Mantener las células del hipocampo primaria en un humidificado 37 ° C y 5% de CO 2 incubadora durante 2-5 días in vitro (DIV, a corto plazo, las culturas jóvenes) o&gt; 15 DIV (a largo plazo, las culturas de edad) antes de experimentos sin necesidad de cambiar la cultura medios de comunicación. </li></ol></li></ol> 2. Fluorescencia de Imagen de citosólica de Ca2 + Concentración <ol><li> Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de fluorescencia. <ol><li> Preparar una solución externa de solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 1, glucosa 10, sodio-HEPES 10 (pH 7,42). </li><li> Preparar una solución exento externa, Mg 2+, solución salina tamponada con HEPES (HBS) que contiene, en mM: NaCl 146, KCl 5, CaCl2 1, glucosa 10 y 10 HEPES (pH 7,42). </li><li> Resuelva salina NMDA en Mg 2 + libre, tamponada con HEPES (HBS) a una final concentración de 100 mM y complementarlo con 10 mM glicina. </li><li> Preparar una solución de HBS que contenía KCl en lugar de NaCl mediante la resolución de (en mM): KCl 145, MgCl 2 1, CaCl 2 1, glucosa 10 y HEPES 10 (pH 7,42). </li></ol></li><li> La carga de las células del hipocampo con fluorescente sonda de calcio fura2 / AM. <ol><li> Tome el cultivo de células que contienen cubreobjetos fuera de la incubadora y lavarlos con medio HBS a RT transfiriéndolos a una nueva placa de cuatro pozos multiplaca que contiene 500 l de HBS por pocillo. </li><li> Se incuban las células con fura2 / AM 4 M (preparado en el mismo medio HBS) durante 60 minutos a temperatura ambiente (25 ºC) en un lugar oscuro. </li><li> Después de 60 minutos, lavar cubreobjetos con medio HBS fresco. </li></ol></li><li> Grabación de imágenes de fluorescencia de citosólico [Ca 2+] en células cultivadas. <ol><li> Encienda la lámpara, microscopio, sistema de perfusión, cámara de fluorescencia y el ordenador. </li><li> Coloque los cubreobjetos en una plataforma para termostatizadoabiertas 12 mm cubreobjetos de cristal en la platina del microscopio invertido y seleccionar un campo microscópico utilizando un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3). Perfundir células continuamente con precalentado (37 ºC) medio HBS en ausencia o presencia de sustancias de ensayo. Mantener el flujo a una velocidad de aproximadamente 5-10 ml / min. Nota: sistema de perfusión celular para células vivas está montado en una plataforma para termostatizado abiertas 12 mm cubreobjetos de vidrio. Sistema de perfusión por gravedad 8 líneas equipadas con un controlador de válvula se utiliza para perfundir las soluciones. Una bomba de vacío es responsable de la eliminación de cualquier exceso de medio. Las soluciones se calentaron usando un sistema de calefacción en el tubo. </li><li> Capturar una imagen de fondo con el obturador cerrado en ambas longitudes de onda de excitación. </li><li> Epi-iluminar células alternativamente a 340 y 380 nm. Record luz emitida a 520 nm cada 5-10 seg con una cámara de fluorescencia, que se filtra por un espejo dicroico fura-2. </li><li> Cuando finalice el período de registro, guarde la secuencia completa of imágenes emiten en 520 nm en el ordenador para su posterior análisis. </li></ol></li><li> Análisis de imágenes fluorescentes grabados. <ol><li> Abra el archivo de experimento. Usando el software aquacosmos, haga clic en &#39;Relación&#39; y seleccione el rango de relación deseada. Calcular la relación de pixel por pixel en las imágenes resultantes a fin de obtener una secuencia de imágenes de relación. </li><li> Reste fondo ajustando la &#39;eliminación de fondo&#39;. Pulse &#39;cálculo de inicio&#39;. </li><li> Pulse &#39;todo momento secuencia&#39; botón y borrar las antiguas regiones de interés (ROI). Para el análisis cuantitativo de las células individuales, establecer nuevas regiones de interés o regiones de interés correspondientes a las neuronas individuales. Promedio de todos los valores de la relación en cada píxel correspondientes a cada ROI y cada imagen para obtener una grabación de valores de fluorescencia ratio para ROI individuales (células). </li><li> Para graficar las grabaciones individuales exportar los valores de relación de fluorescencia correspondientes a cada retorno de la inversión a un progr gráficaa.m. </li><li> Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de las subidas de fluorescencias proporción en respuesta a cada estimulación mediante un análisis de datos adecuado y graficando software. </li></ol></li></ol> 3. La bioluminiscencia de imágenes de Ca2 + mitocondrial Concentración <ol><li> La transfección de las neuronas del hipocampo en cultivo con el plásmido mitGAmut. NOTA: Las células se transfectaron primero con el plásmido que contiene una secuencia mitGAmut mitocondrias-orientada y un aequorina mutado carente de un sitio de unión de Ca2 + fusionado a la proteína fluorescente verde (GFP). Esta construcción detecta grandes aumentos en mitocondrial de Ca 2 + captación y permite la identificación de células transfectadas por la fluorescencia GFP. El plásmido fue desarrollado y proporcionado amablemente por el P. Brulet y compañeros de trabajo 18 (CNRS, París). <ol><li> Preparar Neurobasal TF, que contiene Neurobasal medio de cultivo, que carece de suero fetal bovino, B27, gentamicy 2 mM L-glutamina. </li><li> Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 2,5 l reactivo de transfección en un vial (Solución A). Preparar 50 l de Neurobasal TF PLUS 4 g mitGAmut plásmido en un vial (Solución B). Añadir con cuidado la solución B sobre la solución A. Permitir la mezcla durante 20 minutos, sin agitar. </li><li> Transfiera los cubreobjetos que contienen las neuronas del hipocampo a nuevas placas multiplaca que contienen 200 l de TF Neurobasal fresco. </li><li> Añadir gota a gota 100 l de solución A + B sobre cada cubreobjetos. Incubar durante 30 min. Retire el medio. Lavar una vez las células con TF Neurobasal fresco. Devolver los cubreobjetos a la original Neurobasal medio de cultivo. </li><li> Neuronas de cultivo para un 24 h más a 37 ºC y 5% de CO 2 después de la transfección para permitir la expresión eficiente y la orientación de la sonda. </li></ol></li><li> Preparación de las soluciones de ensayo para imágenes de bioluminiscencia. <ol><li> Preparar soluciones HBS contienen NMDA 100 mM o 145 mM KCl comoanteriormente (Paso 2.1). Prepare la solución HBS conteniendo mM Ca 2 + 10 plus digitonin 100 mM. </li></ol></li><li> Reconstitución de aequorina mitocondrias-dirigida con coelenterazina n. <ol><li> Cubreobjetos de transferencia que contiene las neuronas del hipocampo transfectadas a una placa de cuatro pocillos que contenía 200 l de HBS. </li><li> Añadir 4 l de coelenterazina n (200 M) a 200 l de HBS para una concentración final de 4 mM y mezclar suavemente. Incubar durante 2 horas a RT (25 ºC) y en la oscuridad. </li></ol></li><li> Grabación de imágenes de bioluminiscencia de mitocondrial [Ca2 +]. <ol><li> Encienda el microscopio, la lámpara, el sistema de perfusión, cámara de bioluminiscencia y el ordenador. </li><li> Transferir a un cubreobjetos reconstituidas (37 ºC) cámara de perfusión termostatizada y perfundir continuamente con solución pre-calentado HBS a una velocidad de 5-10 ml / min. </li><li> El uso de un objetivo de 40X (aceite, NA: 1,3), seleccione un campo microscópico que contiene células que expresan la unapoaequorins como se muestra por la emisión de fluorescencia asociado con la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) utilizando los filtros FITC. Un campo típico puede contener 1-2 células transfectadas. Capturar la imagen de fluorescencia de GFP, usando una cámara CCD. </li><li> Apague la luz del microscopio. Quite la caja que contiene dicroico-ubicado en la vía de la luz. Apague la luz de excitación y cerrar la caja oscura de completa oscuridad. </li><li> Perfundir células a 5-10 ml / min con medio HBS con o sin soluciones de prueba pre-calentado a 37 ºC. </li><li> Captura de imágenes de emisión fotónicos cada 10 seg con una cámara de recuento de fotones manejado con un procesador de imagen. </li><li> Al final de cada experimento, permeabilizar las células con 0,1 mM de digitonina en 10 mM CaCl 2 en HBS con el fin de liberar a todos los restantes emisiones fotónicos. Nota: Estas emisiones fotónicas deben sumarse para estimar el total de emisiones fotónicas, un valor requerido para la calibración de Ca 2+ concentraciones &lt;./ li&gt; <li> Imágenes de bioluminiscencia tienda en el ordenador la imagen de fluorescencia de GFP asociado con capturaron antes de la proyección de imagen de recuento de fotones. </li></ol></li><li> Análisis de imágenes de bioluminiscencia que reflejan mitocondrial [Ca2 +]. <ol><li> Cuantificar las emisiones fotónicas utilizando software específico. Las emisiones fotónicos pueden ser convertidos a Ca 2+ mitocondrial libre de concentración ([Ca2 +] mit) utilizando el algoritmo descrito por Brini et al. 15. </li><li> Abra la imagen de fluorescencia de GFP experimento y. Seleccionar regiones de interés (ROIs) con la ayuda de software específico por dibujar la forma de las células transfectadas de acuerdo con las imágenes de fluorescencia capturados al comienzo del experimento. </li><li> Pegue las mismas regiones de interés en cada imagen. Total de emisiones fotónicas en cada retorno de la inversión se calculan con un software específico para obtener el valor de emisión de luminiscencia (L) para cada celda en cada punto en el tiempo. </li><li> Suma todo el emiss fotónicoiones en las imágenes de bioluminiscencia, incluidos los obtenidos después de digitonina permeabilización, utilizando el software específico, para obtener una imagen de bioluminiscencia que contiene todas las emisiones fotónicos. </li><li> Los valores de exportación de emisiones fotónicas para todas las regiones de interés para un software específico para los cálculos. Para ello, haga clic en &#39;Graph&#39; con el fin de calcular los valores de bioluminiscencia para cada ROI en cada momento. Seleccione &quot;valor total&quot; y &quot;utilizar ROI actual para todas las imágenes. Pulse &#39;calcular&#39;. Guarde el &#39;txt.file&#39; y exportar datos a una hoja de cálculo. Por cada ROI, [Ca 2 +] mit se calcula utilizando el siguiente algoritmo: [Ca2 +] (M) = [R + (R · K TR) - 1] / [K R - (R · K R)]; dónde, R = [L / (L λ total)] 1 / n L es la luminiscencia emitida en el momento de la medición en cada región de interés. L total esla luminiscencia total restante después de la adición de los recuentos presentes en el tejido en ese momento en el momento de la medición para cada región de interés. λ, K TR, K R y n son constantes cuyos valores dependen combinación de aequorina (tipo salvaje o mutado) y coelenterazin utilizado (de tipo salvaje o de tipo n), así como la temperatura 16 de grabación. Para la combinación usada aquí (AEQ y coelenterzine n mutado), a 37 ºC, se utilizaron los siguientes valores: K R = 8,47 x 10 7, K TR = 165,6 x 10 3, n = 1204 y λ = 0,138. </li></ol></li><li> Hacer los cálculos correspondientes para estimar el tamaño de los aumentos en la bioluminiscencia en respuesta a cada estímulo mediante un análisis de datos adecuado y graficando software. </li></ol>

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None of the authors have competing interests or conflicting interests.

La remodelación de Ca 2 + homeostasis intracelular en el envejecimiento del cerebro se ha relacionado con la pérdida cognitiva, aumento de la susceptibilidad a daños isquémico, la excitotoxicidad y la neurodegeneración. Para investigar esta hipótesis in vitro, procedimientos de imagen Ca 2+ están disponibles. Por desgracia, las culturas viables de las neuronas del hipocampo de edad no son fiables. Recientemente, se ha observado que los cultivos a largo plazo de las neuronas del hipo...

La excitotoxicidad es uno de los mecanismos más importantes que contribuyen al daño neuronal y muerte celular en insultos neurológicos tales como isquemia, y en algunas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer 1. Este tipo de neurotoxicidad está mediada principalmente por el glutamato actúa sobre Ca 2+ receptores ionotrópicos, -permeable NMDA (NMDAR) 2. La exposición de las neuronas cultivadas a glutamato puede conducir a la excitotoxicidad 3, lo que provoca la apoptosis neuronal 4. Nosotros y otros han informado anteriormente de que la vulnerabilidad neuronal a la apoptosis inducida por NMDA puede cambiar con el desarrollo in vitro y el envejecimiento de 5-8. Es ampliamente aceptado que un aumento en la concentración de Ca2 + citosólico-libre ([Ca2 +] cyt) conduce a la activación de las células. Sin embargo, si este aumento es demasiado alta y / o sostenida suficiente, puede desencadenar la muerte celular 9. Por otra parte, se ha propuestoque excitotoxicidad requiere Ca 2+ mitocondrial captación 10, ya que el tratamiento de las neuronas con las neuronas protegidas desacoplador mitocondrial contra glutamato inducida por la muerte celular 11. Si mitocondrias ocupan demasiado Ca 2+, se puede producir la apertura de la transición de la permeabilidad mitocondrial, lo que lleva a la liberación de citocromo c y otros factores pro-apoptóticos, y la apoptosis que induce. Recientemente hemos demostrado que este mitocondrial de Ca 2 + captación está directamente relacionado con la susceptibilidad dependiente de la edad a la excitotoxicidad, midiendo directamente inducida por NMDA mitocondrial de Ca 2 + captación en las neuronas del hipocampo individuales 5, un método que se informa en este artículo. El hipocampo, involucrado en procesos fisiológicos tales como el aprendizaje, la memoria y otros procesos cognitivos 12, es altamente vulnerable al envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos 13. Se ha propuesto que, después de varias semanas in vitro, se cultivaronlas neuronas del hipocampo muestran un número de características típicas de las neuronas de edad 14. En consecuencia, las neuronas del hipocampo en cultivo a largo plazo pueden proporcionar un modelo integral para investigar Ca 2+ mecanismos mediadas de mayor excitotoxicidad en el envejecimiento. El objetivo general del método presentado es, por lo tanto, para investigar los cambios sustanciales en el Ca 2+ intracelular homeostasis o Ca 2+ remodelación en el envejecimiento del cerebro incluyendo las respuestas el diferencial Ca 2+ provocadas por agonistas de los receptores NMDA en un largo plazo neuronas del hipocampo en cultivo . El método incluye una descripción detallada de la cultura de las neuronas del hipocampo de rata y el seguimiento de las concentraciones de Ca2 + citosólico y mitocondrial mediante fluorescencia y imágenes de bioluminiscencia en las neuronas individuales, respectivamente. Imágenes de fluorescencia de Ca 2+ citosólico en las neuronas cultivadas es un procedimiento estándar. Sin embargo, este método es menos fiable para subcelular Ca 2+ mediciones incluyendo mitocondrial de Ca2 +. Las razones para esto son la falta de orientación adecuada de sondas sintéticas y afinidad inapropiado para Ca 2+ concentraciones que pueden cambiar en las mitocondrias del bajo nivel M, incluso al nivel mM. El uso de Ca 2 + sondas basadas en proteínas como, por ejemplo, aequorina, ha permitido a la focalización a orgánulos subcelulares y el uso de derivados de diferentes Ca 2 + afinidades utilizando diferentes coelenterazines o sondas mutados que carecen de sitios de unión específica 15 Ca 2+. De esta manera, imágenes de bioluminiscencia de células que expresan aecuorina mitocondrias-dirigida puede permitir el seguimiento de mitocondriales de Ca 2 + concentraciones en neuronas individuales. Sin embargo, este procedimiento puede requerir el uso de cámaras de conteo de fotones o cámaras CCD ultrasensibles de imágenes de bioluminiscencia 16-18. Este método puede producir nuevos resultados que debe ser confirmada en más establmodelos cies de envejecimiento del cerebro como, por ejemplo, secciones de cerebro de animales viejos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Culture Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F-12 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31330-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (from bovine pancreas)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5025-15KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE14-801E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips</td>
			<td>Labolan</td>
			<td>0111520/20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well multidish plaques</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petry dishes</td>
			<td>JD Catalan s.l.</td>
			<td>2120044T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>431030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura2-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coelenterazine n</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>BT-10115-2250 uG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMDA</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>M3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axiovert S100 TV microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcite ilumination system</td>
			<td>EXFO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA ER fluorescence camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIM photon counting CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VC-8 valve controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SH-27B heating system&#160;</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquacosmos Software</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence and bioluminescence imaging of subcellular ca2+ in aged hippocampal neurons

La susceptibilidad a la muerte celular neuronal asociada a la neurodegeneración y la isquemia se incrementan excesivamente en el cerebro envejecido pero los mecanismos responsables están mal conocido. La excitotoxicidad, un proceso que se cree que contribuir al daño neuronal inducido por ambos insultos, está mediada por la activación de receptores de glutamato que promueve Ca 2 + afluencia y mitocondrial Ca 2 + sobrecarga. Un cambio sustancial en Ca 2 + homeostasis intracelular o remodelación de Ca2 + intracelular homeostasis puede favorecer el daño neuronal en las neuronas viejas. Para la investigación de Ca 2+ remodelación en el envejecimiento se han utilizado imágenes de células vivas en cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata que se asemejan en algunos aspectos las neuronas in vivo edades. Para este fin, las células del hipocampo son, en primer lugar, recién dispersa de nuevos hipocampo de rata nacida y chapada en cubreobjetos recubierto, vidrio poli-D-lisina. A continuación, los cultivos se mantienen en medios de comunicación controlados por varios días o varias wEeks para la investigación de las neuronas jóvenes y mayores, respectivamente. En segundo lugar, las neuronas cultivadas se cargan con fura2 y sometidos a mediciones de la concentración citosólica de Ca2 + utilizando imágenes de fluorescencia ratio digital. En tercer lugar, las neuronas cultivadas son transfectadas con plásmidos que expresan un tándem de aequorina baja afinidad y GFP apuntado a las mitocondrias. Después de 24 h, aequorina dentro de las células se reconstituye con coelenterazina y las neuronas son sometidos a imágenes de bioluminiscencia para la monitorización de la concentración de Ca 2+ mitocondrial. Este procedimiento de tres pasos permite la monitorización de citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos relevantes como, por ejemplo, el agonista del receptor de glutamato NMDA y comparar si estas y otras respuestas están influenciadas por el envejecimiento. Este procedimiento puede producir nuevos conocimientos en cuanto a cómo el envejecimiento influencia citosólica y mitocondrial Ca 2 + respuestas a los estímulos seleccionados, así como las pruebas de medicamentos seleccionados destinadas a prevenir célula de la neuronamuerte en enfermedades relacionadas con la edad.

Aquí se describe un método simple para evaluar Ca 2+ remodelación y los efectos del NMDA en citosólica y mitocondrial [Ca2 +] en las neuronas de edad. La Figura 1 muestra el esquema del procedimiento para el aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratas neonatales. Antes de empezar, tenemos que prepararnos, recubiertos, cubreobjetos de vidrio de poli-D-lisina estériles y colocarlos en una placa de 4 pocillos. A continuación, las ratas neonatales son asesinados y el...

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Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

8.3K vistas.  Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas. Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. 

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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Investigación

Neurociencias

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

La recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) de fluorescencia de proteínas marcadas en las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo cultivadas

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratones prenatales

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Ensayo de daño del ADN en las neuronas del hipocampo utilizando el ensayo cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this method on hard-to-transfect cells like primary neurons. Here we describe our detailed protocol for calcium phosphate transfection of hippocampal neurons cocultured with astroglial cells.

Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging las espinas dendríticas de las neuronas del hipocampo de rata primaria utilizando Estructurado Iluminación Microscopía

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervioso entérico

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching variations of the neuronal dendrites within the hippocampus are implicated in cognition and memory formation. There are several approaches to Golgi staining, all of which have been useful for determining the morphological characteristics of dendritic arbors and produce a clear background. The present Golgi-Cox method, (a slight variation of the protocol that is provided with a commercial Golgi staining kit), was designed to assess how a relatively low dose of the chemotherapeutic drug 5-flurouracil (5-Fu) would affect dendritic morphology, the number of spines, and the complexity of arborization within the hippocampus. The 5-Fu significantly modulated the dendritic complexity and decreased the spine density throughout the hippocampus in a region-specific manner. The data presented show that the Golgi staining method effectively stained the mature neurons in the CA1, the CA3, and the dentate gyrus (DG) of the hippocampus. This protocol reports the details for each step so that other researchers can reliably stain tissue throughout the brain with high quality results and minimal troubleshooting.

Here we present a Golgi-Cox protocol in extensive detail. This reliable tissue stain method allows for a high-quality assessment of the cytoarchitecture in the hippocampus, and throughout the entire brain, with minimal troubleshooting.

Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic transmission during repetitive nerve firing. Impaired endocytosis in pathological conditions leads to decreases in synaptic strength and brain functions. Here, we describe methods used to measure synaptic vesicle endocytosis at the mammalian hippocampal synapse in neuronal culture. We monitored synaptic vesicle protein endocytosis by fusing a synaptic vesicular membrane protein, including synaptophysin and VAMP2/synaptobrevin, at the vesicular lumenal side, with pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein that increases its fluorescence intensity as the pH increases. During exocytosis, vesicular lumen pH increases, whereas during endocytosis vesicular lumen pH is re-acidified. Thus, an increase of pHluorin fluorescence intensity indicates fusion, whereas a decrease indicates endocytosis of the labelled synaptic vesicle protein. In addition to using the pHluorin imaging method to record endocytosis, we monitored vesicular membrane endocytosis by electron microscopy (EM) measurements of Horseradish peroxidase (HRP) uptake by vesicles. Finally, we monitored the formation of nerve terminal membrane pits at various times after high potassium-induced depolarization. The time course of HRP uptake and membrane pit formation indicates the time course of endocytosis.

Synaptic vesicle endocytosis is detected by light microscopy of pHluorin fused with synaptic vesicle protein and by electron microscopy of vesicle uptake.