El apoyo financiero para este trabajo fue proporcionado por la National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), el Centro de Tecnología de Materiales (MTC) y la ORDA en SIUC. Damos las gracias a una subvención NSF (CHE-0959568) para la compra de un FE-SEM. Nos gustaría dar las gracias al profesor Mateo McCarroll útil para los debates. Julia Reyes agradecer a COLCIENCIAS, Agencia Colombiana y la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia por su erudición y apoyo financiero.

A. Síntesis y Caracterización de liposomas PDA 4,5,6 Nota 1: Proteger la solución PDA de la luz utilizando envoltorio de papel de aluminio en cada recipiente a través de todas las etapas experimentales. Nota 2: Dos conjuntos diferentes de solución de liposomas (B y C) se prepararon siguiente procedimiento A (Síntesis y caracterización de liposomas PDA). 1. Síntesis de N-hidroxisuccinimida Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Para preparar liposomas, un ingrediente esencial PCDA-NHS es necesario. Hemos sintetizado PCDA-NHS mediante el siguiente procedimiento: </li><li> Añadir 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-hidroxisuccinimida (0,0914 g, 0,786 mmol) y 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (0,144 g, 0,713 mmol ) en seco CH 2 Cl 2 (20 ml). </li><li> Se agita la solución a temperatura ambiente durante 2 h. </li><li> Retire cuidadosamente el disolvente mediante el uso de rotary evaporador para producir una película delgada seca. </li><li> Use embudo de separación para extraer el residuo con éter dietílico (25 ml) y agua (25 ml) tres veces. </li><li> Se seca la capa orgánica con MgSO 4 (1,0 g) durante media hora. Filtrar y eliminar el disolvente por evaporación rotatoria para obtener un polvo sólido blanco (0,24 g,&gt; 90%). </li><li> Analizar compuesto final en virtud de Resonancia Magnética Nuclear (RMN). </li><li> 1 H RMN (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2,252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Preparación de liposomas 5,6,7 <ol><li> Disolver PCDA: PCDA-NHS: 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) :: 8: 1: 1 en 20 ml de diclorometano. </li><li> Filtrar la solución con un papel de filtro para eliminar los agregados. </li><li> Se evapora el disolvente completamente para producir una película delgada de monómeros. </li><li> Seque la película fina durante la noche bajo vacuum. </li><li> Hidratar la película con agua desionizada (50 ml) para hacer una solución de liposomas de la concentración deseada (0.65 a 1 mM). </li><li> Someter a ultrasonidos la suspensión resultante con un sonicador de sonda a 76 ° C durante ~ 18 min. </li><li> Cuidadosamente pasar la solución a través de un filtro de papel para eliminar los agregados de lípidos </li><li> Se enfría la solución a 4 ° C durante la noche para promover la auto-ensamblaje de los monómeros. La solución final debe ser ópticamente transparente. </li><li> Polimerizar los monómeros de diacetileno autoensambladas (liposoma) por irradiación con 254 nm de la radiación UV durante ~ 2 min utilizando una fuente de UV Ray Pen (4,5 mW / cm 2) en el aire. </li><li> La solución de liposomas era estable a temperatura ambiente durante al menos dos semanas. La solución fue más estable cuando está refrigerada. </li></ol> B. Preparación de Rodamina-etiquetados albúmina de suero bovino (BSA-Rh) modificados liposomas PCDA 1. La unión de BSA-Rh a la superficie del liposoma <ol><li> Disolver BSA en PBS-Rh buffer (concentración iónica fue 0,01 M, pH 7,2) para hacer que la concentración final de 1,2 M de solución de BSA-rodamina. </li><li> Añadir 2 ml (1,2 mM) de BSA-Rodamina a 10 ml de solución de liposomas preparada en la etapa A.2. (Véase más arriba) a temperatura ambiente. </li><li> Reacción clásica para la unión de grupos amino del residuo de lisina de las proteínas a ácido carboxílico activado por NHS grupo se ha seguido (esquema de reacción en la Figura 2). NHS-PCDA fue diseñado (Figura 2, etapa 1) para covalentemente moléculas de unión a proteínas con liposomas utilizando NHS-amina reacciones (Figura 2, Paso 2). NHS es un excelente agente dejando que impulsa la reacción de amina de ácido carboxílico en la dirección de avance. El rendimiento de esta reacción en las condiciones adecuadas deben ser cuantitativos. </li><li> La eliminación de BSA libre-Rh: Remoje un Spectra / Por Biotech éster de celulosa (CE) membrana (PM C O: 100.000) en agua desionizada water durante 15 min. Esta membrana se utiliza para la diálisis de reaccionar BSA-rodamina (peso molecular ~ 66000 Da) en agua desionizada. </li><li> Transferir cuidadosamente la solución en la membrana de diálisis. </li><li> Cambiar el agua a las 2 h, 8 h, 14 h, 24 h, 36 h y durante la diálisis. </li><li> Recoger la solución final en un frasco cubierto con papel de aluminio. </li></ol> C. Preparación de SR-diamina y biotina-etiquetados liposomas 1. En lugar de utilizar DMPC en el paso 2,1, utilizaremos biotina-etiquetados-(1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE). <ol><li> Siga todos los pasos a través de 2,2 a 2,9. </li><li> En lugar de BSA-Rh en el paso B, el uso Diamina Sulphorodamine etiquetados (SR-diamina). </li><li> Siga todos los pasos en B. </li><li> Los liposomas en esta preparación contenía biotina y SR-diamina en sus superficies. Los pasos subsiguientes fueron similares a A y B (ver arriba) con una excepción: estreptavidina se añadió a la solutia investigar biotina-estreptavidina interacciones a través de cambios en la eficiencia de FRET. </li></ol> D. Representante Resultados <img alt="Figura Título" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Figura título. Una historieta explicar la reacción y FRET proceso que ocurre en la superficie del liposoma (preparado siguiendo el paso B). A. Seguimiento de unión a proteínas a liposomas utilizando FRET 1 Monitoreo de FRET entre la rodamina y liposomas PDA preparados en la etapa B. Los espectros de excitación y emisión de BSA-Rh y espectro de absorción de PDA se toman (Figura 3A). Podemos ver claramente que el espectro de emisión de BSA-Rh se solapa con el espectro de absorción de PDA. Esto satisface el requisito de resonancia para el mecanismo de FRET. BSA-rodamina liposomas etiquetados antes y después de la polimerización se analizaron con UV-Vy es la espectroscopia de fluorescencia. Para el donante y el aceptor aislado, la eficiencia de FRET es altamente dependiente de la distancia donante-aceptor (r) y J 1 (valor p). La extinción de la emisión se observó (Figura 3B) porque de FRET entre la rodamina y PDA debido a la aparición de espectro electrónico de absorción de PDA azul después de la fotopolimerización. En nuestro caso, la eficiencia de FRET es cero para los liposomas no polimerizados y rodamina porque J = 0 para los liposomas no polimerizados en la región visible. Se realizaron experimentos similares con sólo liposomas PDA que no contenían NHS en su superficie. En estos casos, BSA-Rh no fue etiquetada para la superficie de los liposomas. En ese caso, la distancia media entre la rodamina y PDA (r promedio) fue mucho mayor que el radio de Forster (R 0 = 2,8 nm). Por lo tanto, no se observó una gran disminución en la intensidad de fluorescencia. Esta observación de unlso sugiere que la extinción de la fluorescencia es dominante cuando r &lt;2,8 nm. J y R 0 valores se calcularon utilizando las fórmulas siguientes: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0,211 [k 2 n -4 Q D J (λ)] 1/6 El coeficiente de extinción (ε) de azul-PDA está en el intervalo de ~ 2000-10000 M -1 cm -1 antes de la adición de estreptavidina. El coeficiente de extinción de azul-PDA es dependiente de la condición de la foto-polimerización. [2] Por ejemplo, los valores varepsilon será mayor para una solución que se polimerizó un tiempo más largo. Además, el auto-ensamblaje de los monómeros diacetileno también puede afectar a los valores e. El calcul Jciones tomar en cuenta estos cambios, y reflejan los cambios en los coeficientes de extinción debido a la PDA biotina-estreptavidina interacciones moleculares. valores de J se calculan mediante la absorción PDA experimental y SR-101 Datos de las emisiones. Los cambios en los valores de J son debido a cambio en el espectro electrónico de absorción de PDA después de la adición de estreptavidina a la solución (Figura 4C). La unidad de los valores de J es de M -1 cm -1 nm 4. B. Supervisión de FRET con la adición de estreptavidina-biotina a la solución de liposomas etiquetados Nota 1: Monitoreo de FRET entre rodamina y PDA liposomas preparados en el paso C anterior. Los espectros de excitación y emisión de Sulphorodamine-etiquetados diamina (SR-diamina) y el espectro de absorción de la PDA se toman (Figura 4A). Liposomas no polimerizados y biotina polimerizado etiquetadas se analizaron mediante UV-Visy espectroscopia de fluorescencia. La emisión de la rodamina (SR-101) se reduce en aproximadamente un 45% después de la polimerización (Figura 4B), sugiriendo temple de emisión debido a la FRET. Añadir 40 ml de alícuotas (1 M) de solución de estreptavidina a 2 ml de solución de liposomas. Con la adición de estreptavidina a la solución, los cambios en el valor de J se observó (Figura 4C). Como biotina se une a la estreptavidina, la intensidad del pico azul de PDA liposoma (centrado a ~ 645 nm en la Figura 1) se redujo mientras que un aumento en el pico de absorción a 540 nm se observa (F igura 1S). Figura 4D muestra los cambios en la FRET eficiencia. La eficiencia de FRET disminuyó con el aumento en la concentración de estreptavidina también es consistente con nuestra predicción. Registre la emisión SR después de cada adición alícuota de 40 l de estreptavidina. Se observó un aumento constante en la emisión de rodamina después de la adición de streptavidina (Figura 5). Este aumento en la emisión de rodamina es debido a una disminución en el valor de J para el espectro de emisión Sulphorodamine y espectro de absorbancia PDA siguiendo las interacciones de biotina-estreptavidina. A nivel molecular, las interacciones biotina-estreptavidina conducir a cambios sutiles en la longitud de la conjugación eficaz de la PDA que resulta en una disminución en la forma azul-PDA a una más estable termodinámicamente rojo-PDA forma 2. Esta es la base de los cambios en los valores de J. Curiosamente, las diferencias sutiles en las interacciones moleculares para la biotina unida covalentemente o no covalentemente a liposomas PDA se puede probar usando nuestro ensayo de detección 4. También hemos realizado experimentos de control y han monitorizado la emisión de las muestras de control en las mismas condiciones experimentales como los de estreptavidina-biotina sistema. Los experimentos de control se componen de: (1) soluciones de liposomas que contenían biotina en susuperficie se añadieron una solución tampón de mismo volumen y concentración, y (2) solución de liposomas sin receptores de biotina en su superficie se añadieron estreptavidina de mismo volumen y concentración. La intensidad del solución de biotina-etiquetados liposomas después de la adición de estreptavidina mostró intensidad mejorada, pero la intensidad de la solución de liposomas de los experimentos de control (por ejemplo, véase Figura 2S), por otra parte, mostraron una disminución en la intensidad de emisión. Esto se atribuye a la dilución de la solución. Estos experimentos indican claramente que la emisión mejorada de la solución se debe a interacciones moleculares específicas. Radio Forster (R 0) para el par de rodamina y PDA se calcula (ecuación 2) ser ~ 2.80 nm. Esto significa que para aisladas PDA-rodamina pares, 50% de las moléculas de rodamina estado excitado tendrá su energía transferida al PDA cuando r es 2,80 nm. Nos obs<html> erved que cuando la biotina se une covalentemente a la cadena principal PDA, el incremento de las emisiones fue 2-3 veces mayor que el de forma no covalente de biotina unido a liposomas. 4 Estos resultados sugieren fuertemente que el sistema propuesto es sensible para distinguir diferencias sutiles en las interacciones en el transductor (enlazador entre la biotina y la bicapa de liposomas) debido a los receptores unidos covalentemente y no covalentemente unidos a liposomas. Dependiendo de las capacidades de adquisición de exploración y datos del espectrofotómetro, supervisión en tiempo real (en milisegundos a segunda escala de tiempo) de las interacciones proteína (en la espectroscopía UV-Vis) son posibles con este sistema de detección. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Figura 1. Espectros de absorción de soluciones PDA azul y rojo. (Recuadro) micrografías ópticas tomadas con una cámara digital. g &quot;/&gt; Figura 2. El esquema de reacción para la síntesis PCDA-NHS (paso 1). La reacción del PCDA-NHS al sustituyente amina de proteínas (paso 2). El paso 2 es la base de la unión de los residuos de lisina de las proteínas en el ácido carboxílico del PCDA monómero. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img alt="Figura 3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> La Figura 3A. Cambio en la observada FRET eficiencia se debe a los cambios en el espectro de absorción de la PDA. Antes de polimerización no hay solapamiento entre BSA-Rh emisión y absorción PDA, pero después se superpone polimerización absorción PDA con BSA-Rh emisión, que es el requisito para FRET. Rodamina es un donante (rojo) y liposomas polimerizados PDA actuar como un aceptor (azul). <img alt="Figura 3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Figura3B. Espectros de fluorescencia de BSA-Rh liposomas etiquetados antes (azul) y después de la polimerización PCDA (rojo). Una gran disminución en la emisión de rodamina se observó debido a la FRET entre la rodamina y PDA. <img alt="Figura 4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> La Figura 4A.. Solapamiento espectral (J) para el cambio del espectro de absorción PDA (azul o rojo) y el espectro de emisión Sulphorodamine (naranja) La Figura 4A es el espectro representativo para condiciones extremas, es decir, cuando un exceso de estreptavidina se añadió a la solución. La Figura 4A muestra una casi completa azul a rojo transformación PDA después de la adición de un exceso de estreptavidina. Se ve claramente que J (solapamiento espectral) aumenta con azul de desplazamiento del espectro de absorción PDA <img alt="Figura 4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> La figura 4B. Espectros de fluorescencia antes (azul) y después (red) polimerización liposoma. <img alt="Figura 4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> Figura 4C Estado para FRET:. J cambio entre el donante (Sulphorodamine) y aceptor (PDA) con la adición de estreptavidina para la solución de liposomas. <img alt="Figura 4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Figura 4D. FRET cambio en la eficacia entre el donante (Sulphorodamine) y aceptor (PDA) con la adición de estreptavidina a la solución de liposomas. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Figura 5. Rodamina espectro de emisión después de la adición de partes alícuotas de estreptavidina a la solución de liposomas PDA. El recuadro muestra una vista más grande de los cambios en los espectros de emisión SR-101.

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	<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (1999).</li><li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly.">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li><li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors.">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li><li>Xuelian, L. i., Kohli, P. u. n. i. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Molecular+Interactions+in+Biosensors+Based+on+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer.">Investigating Molecular Interactions in Biosensors Based on Fluorescence Resonance Energy Transfer.</a> J. Phys. Chem. C. 114, 6255-6264 (2010).</li><li>Li, X., Matthews, S., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Polydiacetylene+Liposomes.">Fluorescence Resonance Energy Transfer in Polydiacetylene Liposomes.</a> J. Phys. Chem. B. 112, 13263-13272 (2008).</li><li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes.">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li><li>New, R. R. C., New, R. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , 33-104 (1990).</li><li>Chen, X., Lee, J., Jou, M. J., Kim, J. -. M., Yoon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorimetric+and+Fluorometric+Detection+of+Cationic+Surfactants+Based+on+Conjugated+Polydiacetylene+Supramolecules.">Colorimetric and Fluorometric Detection of Cationic Surfactants Based on Conjugated Polydiacetylene Supramolecules.</a> Chem. Commun. , 3434-3436 (2009).</li><li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -. K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene.">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Hemos llevado a cabo la unión selectiva de residuos de lisina de la proteína en la superficie de los liposomas utilizando NHS-amina reacción. Este método basado en FRET es capaz de hacer monitoreo en tiempo real de la biotina-estreptavidina y vinculante proteína (BSA) que se une a la superficie del liposoma. Procedimiento similar se puede aplicar para estudiar la dinámica de unión de interacciones de proteínas diferentes con sus receptores selectivos. Hay flexibilidad en la elección de fluoróforos que proporci...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic ácido (PCDA) </td><td> Productos químicos EFP </td><td> 3261 </td><td> Sensible a la luz </td></tr><tr><td> N-hidroxisuccinimida (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Sensible a la humedad </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimetilamino) propil)-3-etilcarbodiimida (EDC) </td><td> Chem-Impex International </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Dimyristoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rodamina-etiquetados Ser bovinoum albúmina (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-(biotinil) (biotina-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

real-time monitoring of ligand-receptor interactions with fluorescence resonance energy transfer

FRET es un proceso por el cual la energía es no radiativamente transferido de una molécula donadora excitada a una molécula aceptora del estado fundamental de largo alcance a través de interacciones dipolo-dipolo 1. En el presente ensayo de detección, que utilizan una propiedad interesante de PDA: azul-cambio en el espectro de absorción UV-Vis electrónico de PDA (Figura 1) después de un analito interacciona con los receptores unidos a PDA 2,3,4,7. Este cambio en el espectro de absorción PDA proporciona cambios en el solapamiento espectral (J) entre PDA (aceptor) y rodamina (donante) que conduce a cambios en la eficiencia de FRET. Por lo tanto, las interacciones entre analito (ligando) y los receptores se detectan a través de FRET entre los fluoróforos donantes y PDA. En particular, se muestra la detección de una molécula de proteína estreptavidina modelo. También demuestran la unión covalente de albúmina de suero bovino (BSA) a la superficie del liposoma con FRET mecanismo. Estas interacciones entre tél liposomas bicapa y moléculas de proteína se puede detectar en tiempo real. El método propuesto es un método general para la detección de productos químicos pequeño y grandes moléculas bioquímicas. Dado que la fluorescencia es intrínsecamente más sensible que la colorimetría, el límite de detección del ensayo puede ser en sub-rango nanomolar o inferior 8. Además, PDA puede actuar como un aceptor universal en FRET, lo que significa que varios sensores puede ser desarrollado con PDA (aceptor) funcionalizado con los donantes y los receptores de diferentes unidos en la superficie de los liposomas PDA.

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Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

Demostramos FRET entre polidiacetileno conjugado polímero (PDA) y el fluoróforo unido a la superficie de liposomas de PDA para la detección de biomoléculas. Liposomas PDA también contenía moléculas receptoras en sus superficies para las biomoléculas para ser utilizados como sondas. Ligando-receptor interacciones conducen a cambios en la eficiencia de FRET entre el fluoróforo y el PDA que es la base del mecanismo de detección.

Monitoreo en tiempo real de las interacciones ligando-receptor con transferencia de energía de resonancia fluorescente

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

real-time-monitoring-ligand-receptor-interactions-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

14.3K vistas.  Southern Illinois University. Demostramos FRET entre polidiacetileno conjugado polímero (PDA) y el fluoróforo unido a la superficie de liposomas de PDA para la detección de biomoléculas. Liposomas PDA también contenía moléculas receptoras en sus superficies para las biomoléculas para ser utilizados como sondas. Ligando-receptor interacciones conducen a cambios en la eficiencia de FRET entre el fluoróforo y el PDA que es la base del mecanismo de detección.

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Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Investigación

Biología

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

A largo plazo Prueba de toxicidad letal con el Crustáceo Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring of biochemical and signaling events in live cells and tissues. Compared to classical biochemical methods, this novel technology is characterized by high temporal and spatial resolution. FRET experiments use various genetically-encoded biosensors which can be expressed and imaged over time in situ or in vivo1-2. Typical biosensors can either report protein-protein interactions by measuring FRET between a fluorophore-tagged pair of proteins or conformational changes in a single protein which harbors donor and acceptor fluorophores interconnected with a binding moiety for a molecule of interest3-4. Bimolecular biosensors for protein-protein interactions include, for example, constructs designed to monitor G-protein activation in cells5, while the unimolecular sensors measuring conformational changes are widely used to image second messengers such as calcium6, cAMP7-8, inositol phosphates9 and cGMP10-11. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from single commercially available components and how to control the whole setup using the Micro-Manager freeware. This simple but powerful instrument is designed for routine or more sophisticated FRET measurements in live cells. Acquired images are processed using self-written plug-ins to visualize changes in FRET ratio in real-time during any experiments before being stored in a graphics format compatible with the build-in ImageJ freeware used for subsequent data analysis. This low-cost system is characterized by high flexibility and can be successfully used to monitor various biochemical events and signaling molecules by a plethora of available FRET biosensors in live cells and tissues. As an example, we demonstrate how to use this imaging system to perform real-time monitoring of cAMP in live 293A cells upon stimulation with a &beta;-adrenergic receptor agonist and blocker.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy is a powerful technique for real-time monitoring of signaling events in live cells using various biosensors as reporters. Here we describe how to build a customized epifluorescence FRET imaging system from commercially available components and how to use it for FRET experiments.

FRET Microscopía de Monitoreo en tiempo real de eventos de señalización en las células vivas Uso de biosensores unimoleculares

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Mammalian cell-based in vitro assays have been widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but have been limited due to the high monetary and time costs of parallel sample preparation that are necessitated due to the destructive nature of firefly luciferase-based screening methods. This video describes the utilization of autonomously bioluminescent mammalian cells, which do not require the destructive addition of a luciferin substrate, as an inexpensive and facile method for monitoring the cytotoxic effects of a compound of interest. Mammalian cells stably expressing the full bacterial bioluminescence (luxCDABEfrp) gene cassette autonomously produce an optical signal that peaks at 490 nm without the addition of an expensive and possibly interfering luciferin substrate, excitation by an external energy source, or destruction of the sample that is traditionally performed during optical imaging procedures. This independence from external stimulation places the burden for maintaining the bioluminescent reaction solely on the cell, meaning that the resultant signal is only detected during active metabolism. This characteristic makes the lux-expressing cell line an excellent candidate for use as a biosentinel against cytotoxic effects because changes in bioluminescent production are indicative of adverse effects on cellular growth and metabolism. Similarly, the autonomous nature and lack of required sample destruction permits repeated imaging of the same sample in real-time throughout the period of toxicant exposure and can be performed across multiple samples using existing imaging equipment in an automated fashion.

Mammalian cells expressing the bacterial bioluminescence gene cassette (lux) produce light autonomously. The resulting bioluminescent dynamics upon chemical exposure have been demonstrated to reflect the treatment effects on cellular growth and metabolism, making these cells an inexpensive, continuous, real-time toxicity screening tool that can easily be adapted for high-throughput automation.

Las células de mamíferos bioluminiscentes manera autónoma para la monitorización continua y en tiempo real de citotoxicidad

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

La investigación de las interacciones proteína-proteína en las células vivas utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

Mediciones en tiempo real de proteínas de membrana: Receptor interacciones utilizando resonancia de plasmones superficiales (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

PCR en tiempo real basada en sondeos Enfoques para la medición cuantitativa de microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoreo en tiempo real de la activación de aurora quinasa A utilizando biosensores FRET conformacionales en células vivas

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...