Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM094246, la American Heart Association Beca 11GRNT7890004, y la Fundación Nacional de Ciencia de subvención MCB-1110501.

1. Cree la construcción que contiene la proteína de interés Clonar el gen que expresa la proteína de interés en un vector adecuado. Use vectores tales como la serie pcDNA o pRK5 ya que son muy adecuados para la expresión en sistemas de mamíferos como células HEK293 y CHO. 2. Seleccione los sitios en la proteína que se han etiquetado con la Fluoróforos <ol><li> Elija los sitios de etiquetado que son capaces de reflejar posibles cambios conformacionales en la proteína. Si es posible, utilice una estructura cristalina de la proteína o de una proteína homóloga a ayudar a hacer esta determinación. Si no hay ninguna estructura cristalina disponible, utilizar software en línea para predecir la posible estructura de la proteína y por lo tanto recibir penetración en los sitios apropiados. </li><li> Elija residuos tales que las cadenas laterales de los residuos seleccionados son de superficie expuesta y accesible para los fluoróforos de modo que la proteína puede ser etiquetado. <ol><li> Elija residuos queno son críticos para la función de proteínas, por ejemplo, los sitios que no están involucrados en la unión del ligando. </li><li> En la introducción de la mutación cisteína, dar preferencia a los sitios que son similares, por ejemplo, serina, que podrían causar perturbación mínima a la estructura de la proteína. </li><li> Después de la elección de los sitios de etiquetado, que las mutaciones para asegurar que la proteína sólo da LRET de estos sitios previstos. Utilice protocolos estándar de mutagénesis dirigida al sitio para mutar de distancia cisteínas no unidas por disulfuro que podrían unirse a maleimida conjugados etiquetas fluorescentes. No mutar distancia cisteínas unidas por disulfuro y enterrados, cisteínas libres ya que no deben reaccionar con tintes fluorescentes en forma plegada de la proteína. </li></ol></li><li> Introducir residuos de cisteína en los sitios deseados por hacer mutaciones puntuales utilizando protocolos estándar de mutagénesis dirigida al sitio. </li><li> Incluir un sitio de escisión de la proteasa que puede escindir específicamente de una de las cisteínas de la proteína. Si elsecuencia proteica permite, introducir el sitio por conservadoramente mutando la proteína para tener una trombina (secuencia de reconocimiento LVPRGS) o Factor Xa (secuencia de reconocimiento IDGR o IEGR) secuencia cerca de la cisteína introducida y accesible a la proteasa de escisión; de otro modo la secuencia de tetra o hexa-péptido puede ser insertado como un todo. Elige el sitio de tal manera que tras la escisión una de las cisteínas introducidas se disocia del resto de la proteína-en ciertos casos, esto puede requerir dos sitios de escisión que flanquean una cisteína mutado. </li></ol> 3. Pruebe la Expresión y la funcionalidad de la proteína <ol><li> Realizar una transferencia de Western para confirmar la expresión de la proteína mutada. </li><li> Realizar un ensayo funcional de la proteína para asegurar que las mutaciones han alterado la función de la proteína sólo mínimamente, en todo caso, para evitar estudiar los cambios conformacionales de una proteína disfuncional. NOTA: Dado que todas las proteínas tienen diferentes funciones, no existe una única f<html> ensayo unctional que se utiliza específicamente para LRET; sin embargo, algunos ejemplos de ensayos funcionales incluyen ensayos enzimáticos de actividad de enzimas, ensayos de unión a ligandos para los receptores, y los estudios de electrofisiología para canales iónicos. </li></ol> 4. Seleccione los fluoróforos para ser usados Seleccionar fluoróforos basados ​​en el rango de distancia de esperar que se mide de tal manera que el rango es entre 0 0.5-1x la R del par fluoróforo. NOTA: Esto permite una más fácil sustracción del fondo, que tiene típicamente tiempos de vida más largos. Por ejemplo, si se mide el rango de distancia esperada es de alrededor de 35 Å, un par fluoróforo apropiado utilizar sería quelato de terbio como donante y Alexa 594 como receptor, ya que el R 0 para este par es de 53 Å (Tabla 1). 5. expresar la proteína mediante transfección transitoria de la cantidad necesaria de células de mamíferos ntent &quot;&gt; transitoriamente transfectar la proteína de interés en las células de mamíferos escogidos utilizando cualquiera de los reactivos de transfección comunes Normalmente, utilice cuatro placas de 10 cm por experimento LRET para líneas de células HEK y CHO;. Sin embargo, esta cantidad puede variar en función de la expresión de proteínas , estabilidad, etc. permitir que las células expresan la proteína de 36-48 h antes de la cosecha. 6. Rotula las Proteínas <ol><li> Separar las células de la placa de cultivo. Separar las células HEK simplemente pipeteando amortiguador contra la parte inferior del plato. Separe las células CHO con un raspador de células, lavarse de los medios de comunicación con tampón extracelular. </li><li> Recoger las células por centrifugación a 1100 xg durante 3 min. Utilice estos mismos ajustes de centrífuga para recoger células después de etiquetado, así como después de los lavados posteriores. </li><li> Suspender las células en 3 ml de tampón extracelular, a continuación, añadir los fluoróforos donador y aceptor en cantidades equimolares hasta una concentración final de 100-300 nM. Incubar en un rotador fo 1 hora a TA. </li><li> Lavar estas células marcadas 3-4 veces con tampón extracelular para eliminar fluoróforos no unidos, a continuación, suspender estas células en tampón extracelular (por lo general 2 ml) para las mediciones de LRET. </li><li> Como control, etiquetar un conjunto separado de las células con sólo fluoróforo donante (quelato de terbio) sin la adición de cualquier fluoróforo aceptor. NOTA: Los datos de estos experimentos de donante sólo es necesario para completar el análisis. Estos experimentos se pueden realizar en el mismo o diferentes días. </li><li> Una vez más, realizar la validación funcional, esta vez con la proteína mutante marcado, como el proceso de etiquetado también puede interferir con la función dependiendo del sitio utilizado para el etiquetado. NOTA: Estos experimentos se pueden realizar en el mismo o diferentes días. </li></ol> 7. preparar el experimento LRET <ol><li> Colocar las células resuspendidas en una cubeta de cuarzo con un volumen mínimo de 1 ml. </li><li> Encienda el ordenador y el instrumento y ajustar los parámetros de la datun programa de adquisición en consecuencia. <ol><li> Establecer la longitud de onda de excitación a la gama de absorbancia del fluoróforo donante (330-340 nm funciona bien para quelato de terbio). </li><li> Ajuste la longitud de onda de emisión de forma adecuada, teniendo en cuenta que la emisión del aceptor varía en función del aceptor utilizado. Es importante destacar que seleccionar una longitud de onda de detección que mide sólo la emisión del aceptor y no incluye cualquier sangrado a través de la emisión del donante. Por ejemplo, utilizar una longitud de onda de 565 nm para Alexa 555 como un aceptor Tabla 1. Para las mediciones de donante único, en el que la proteína se marcó sólo con donantes pero sin aceptador, utiliza una longitud de onda de 545 nm para la medición de emisiones de quelato de terbio. </li><li> Establezca el tiempo de detección de emisiones sea al menos tres veces el tiempo de vida esperado LRET para asegurar que un componente de largo curso de la vida no se puede perder. </li></ol></li><li> Lleve a cabo la exploración. Hacer por lo menos tres exploraciones de 99 barridos para asegurar la consistencia de los resultados. Ahorra ªe los resultados como un archivo de texto (* txt). </li><li> Para medir los cambios conformacionales de una proteína con respecto a las diferentes condiciones (tales como la adición de un ligando), alterar esas condiciones y de nuevo realizar al menos tres exploraciones de 99 barridos cada uno en la misma muestra en esta nueva condición. Si el estudio de los efectos del glutamato sobre la conformación de receptores de glutamato, por ejemplo, añadir glutamato a 1 mM a la misma muestra de escaneado en el paso 7.3, y luego escanear de nuevo. </li><li> Agregue hasta cinco unidades de la proteasa adecuada y tomar las exploraciones continuamente hasta que la escisión es completa y no profundizar el cambio es visto en el curso de la vida de tres exploraciones sucesivas. Por lo general, la escisión se completa en dos a 3 hr. Si un sitio de escisión de Factor Xa se usa para la escisión de la proteasa, por ejemplo, añadir 3 l de Factor Xa a la muestra, y escanear cada 30 min durante 3 horas. </li></ol> 8. Analizar los datos obtenidos <ol><li> Abra el software de análisis de datos. </li><li> Cargue el tiempo de vida de fluorescenciadatos mediante la importación ASCII para abrir los archivos de texto. Cargar todas las réplicas, así como las mediciones de fondo final, en un solo archivo. </li><li> La media de los datos de todas las exploraciones para cada condición experimental para obtener los datos finales. Para ello, seleccione las columnas que contienen los ensayos individuales, a continuación, en el menú Datos en la barra de menú, haga clic en Estadísticas en filas para mostrar las intensidades medias de fluorescencia de los ensayos, así como la desviación estándar y error estándar. </li><li> Representar gráficamente los valores medios como un gráfico de líneas con la intensidad de fluorescencia en el eje Y y la vida útil en microsegundos en el eje X para crear una curva que representa el tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor. Cambiar el eje Y de la parcela a una escala logarítmica, para permitir una mejor visualización de los datos. </li><li> Repita el paso 8.3 en los datos de medición de fondo, con un promedio de las exploraciones finales que muestran la superposición indica la escisión completa. </li><li> Visualizar los datos de la media de antecedentes sobre lamisma trama que contiene los datos en bruto en promedio. Para ello, abra el cuadro de diálogo Control de capas se encuentra bajo el menú Plot. Luego, transferir los datos que contienen el fondo significa en la lista de contenidos de capa. </li><li> Alinear los datos de la media de fondo a los datos brutos medios. Para ello, utilice la función matemática simple en el menú Math para multiplicar o dividir los datos de fondo como sea necesario hasta que el extremo de la cola del fondo coincide con el final de los datos en bruto. NOTA: En este extremo de la cola, el tiempo de vida de la proteína de interés debería tener ya completamente decaído; lo que está alineado es simplemente la señal de fondo presente antes y después de la escisión de la proteasa. </li><li> Reste la señal de fondo alineado de la señal inicial LRET prima, siempre con la función matemática simple. </li><li> Ajustar los datos a un decaimiento exponencial (exponenciales únicos o múltiples, dependiendo de los sitios y el diseño experimental). <ol><li> Establecer el límite de inicio para el montaje para comenzar después del finaldel pulso de láser. Utilice este mismo punto de inicio para todos los accesorios de curvas posteriores. </li><li> En el cuadro de diálogo Función de montaje Select, seleccione decaimiento exponencial con el fin de adaptarse a la vida con la siguiente ecuación para una sola caída exponencial: <img alt="Ecuación 4" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq4.jpg" width="200" /> Eq. 4 donde, Y representa la intensidad de fluorescencia, y 0 representa la intensidad de fondo debido al ruido del sistema, A 1 es la intensidad de la señal, t es el tiempo de vida de fluorescencia, x es el tiempo, y x 0 es el desfase de tiempo. </li><li> Fijar x 0 hasta 0, comenzar la función de ajuste, y ajustar los datos. NOTA: Si el experimento está diseñado para tener la señal sólo de un par de sitios, los datos resultantes deben ser de fácil ajuste por un único decaimiento exponencial 8. El residual del ajuste es un buen método para determinar la bondad del ajuste y si vidas decaimiento adicionales son required. </li></ol></li><li> Usa los tiempos de vida obtenidos a partir de los datos para calcular la distancia entre los fluoróforos usando la ecuación de Förster (un reordenamiento de las ecuaciones 1 y 2 anteriores): <img alt="Ecuación 5" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq5.jpg" width="200" /> Eq. 5 NOTA: Todas las variables son como se ha mencionado anteriormente, con τ DA haber sido medido como el tiempo de vida de emisión sensibilizada del aceptor. Más detalles y ejemplos sobre las mediciones de R 0 y R se pueden encontrar en otro lugar 7,9,10. </li><li> Repetir el análisis experimento y los datos de al menos tres veces para asegurar la reproducibilidad. La inconsistencia entre las repeticiones individuales de la misma medida pone en duda la validez de los datos; utilizar experimentos o repeticiones de control adicionales. Calcular errores en la medición utilizando el Gustavus calculadora libre Análisis de errores (desarrollado por el Dr. Thomas Huber) o un sistema similar que se propaga el error en elarrebatos de la vida. </li></ol>

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	<li>Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+biophysical+applications+of+lanthanide-based+probes.">Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).</li><li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer:+a+spectroscopic+ruler.">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).</li><li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+energy+transfer+as+a+spectroscopic+ruler.">Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler.</a> Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).</li><li>Selvin, P. R., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescence+energy+transfer+using+a+terbium+chelate:+improvements+on+fluorescence+energy+transfer.">Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).</li><li>Chen, J., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+chelates+of+terbium+and+europium.">Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).</li><li>Ge, P., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiol-reactive+luminescent+lanthanide+chelates:+part+2.">Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2.</a> Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).</li><li>Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRET+investigations+of+conformational+changes+in+the+ligand+binding+domain+of+a+functional+AMPA+receptor.">LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor.</a> Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).</li><li>Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton+mediated+conformational+changes+in+an+Acid+Sensing+Ion+Channel.">Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel.</a> J. Bio. Chem. 288, (2013).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+at+the+agonist+binding+domain+of+the+N-methyl-D-aspartic+acid+receptor.">Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).</li><li>Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+arrangement+in+N-methyl-D-aspartate+(NMDA)+receptors.">Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).</li><li>Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terbium(III)+chelate+as+an+efficient+donor+for+multiple-wavelength+fluorescent+acceptors.">Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors.</a> Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

LRET es una técnica poderosa que permite a los científicos para medir distancias entre dominios dentro de una única proteína, así como entre las subunidades en una proteína multimérica. Como tal, LRET está bien adaptado para el examen de los cambios conformacionales y dinámica de las proteínas u otras macromoléculas. El protocolo anterior debe permitir el laboratorio debidamente equipado para probar fácilmente sus hipótesis; Sin embargo, hay muchas fuentes comunes de error que pueden plagar el nuevo investi...

Transferencia de Energía de Resonancia de luminiscencia (LRET) es un derivado de la técnica bien conocida de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) 1. Similar a la FRET, LRET se puede utilizar para medir distancias y los cambios de distancia entre donante y aceptor fluoróforos unidos a sitios específicos en la proteína de interés dentro de la gama de 10-100 Å 1-3. Los principios de LRET son también similares a FRET en que la transferencia de energía de resonancia se produce entre dos fluoróforos proximales cuando el espectro de emisión del fluoróforo donante se solapa con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. La eficiencia de esta transferencia está relacionada con la distancia entre los dos fluoróforos por la siguiente ecuación: <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq1.jpg" width="120" /> Eq. 1 donde R es la distancia entre los dos fluoróforos, E es la eficiencia de la norma ENtransferencia ener-, y R 0, se discute a continuación, es el radio de Förster para el par fluoróforo, es decir, la distancia a la que la eficiencia de la transferencia es la mitad de la máxima. A partir de esta ecuación, se puede ver que la eficiencia está relacionada con la magnitud de la distancia elevado a la sexta potencia inversa 1. Es esta dependencia sexta potencia inversa que permite la FRET y las mediciones lRet ser exquisitamente sensible, incluso a pequeños cambios de distancia cuando está cerca del 0 R del par de FRET. La capacidad para etiquetar específicamente sitios deseados en proteínas u otras macromoléculas permite a uno tomar ventaja de esta sensibilidad para monitorizar los cambios conformacionales. Cuando se compara con FRET, que utiliza moléculas de colorantes orgánicos convencionales, LRET ofrece ventajas adicionales. En LRET, en lugar de utilizar un colorante orgánico como el fluoróforo donante, un catión serie de los lantánidos, normalmente Tb 3 + o Eu 3 +, se utiliza 1,4-6. Los fluoróforos que u caennder esta categoría, por ejemplo, quelato de terbio, son también muy versátil en que se pueden utilizar con una amplia gama de fluoróforos aceptores. Esta flexibilidad es posible porque los espectros de emisión de los lantánidos quelados contienen múltiples picos de emisión agudos, lo que permite una única especie de fluoróforo donante para ser utilizado con una de una amplia variedad de fluoróforos aceptores. Por lo tanto, la emisión aceptor sensibilizado puede ser detectado sin ningún temor a la contaminación de sangrado a través de la emisión de los donantes 5. El experimentador selecciona el aceptor específico basado en la distancia esperada entre los dos fluoróforos (Figura 1 y Tabla 1). En estos fluoróforos lantánidos quelados, el ión metálico es quelado por una molécula que contiene un grupo de antenas que sensibiliza al lantánido normalmente mal de absorción a la excitación, así como un grupo funcional biorreactivo para atar el ion a un grupo funcional específico de la macromolécula 1, 5,6. Once excitado, lantánidos relajarse al estado fundamental a través de la liberación de fotones con una tasa de atenuación en el rango de milisegundos. Debido a que la descomposición es ni una relajación-singlete-singlete ni a una relajación triplete a singlete, la emisión de fotones no puede adecuadamente ser llamado fluorescencia o fosforescencia, pero se denomina más correctamente la luminiscencia 1. La larga decadencia de la luminiscencia de los lantánidos ayuda mucho en las mediciones de toda la vida. Mediciones de por vida se pueden utilizar para determinar la eficacia a través de la siguiente relación: <img alt="Ecuación 2" fo:content-width="1.2in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq2.jpg" width="120" /> Eq. 2 donde, E es la eficiencia de la transferencia, τ D es el tiempo de vida del donante (lantánido quelado) cuando no participan en la transferencia de energía, y τ DA es el tiempo de vida del donante cuando se participa en la transferencia de energía con el aceptor. Con LRET, DA τ puede colasí ser medido como el tiempo de vida de la emisión sensibilizada del aceptor debido a la vida de terbio es mucho más grande que un fluoróforo aceptor orgánico. El aceptor emite con la misma vida útil como su excitación incitar (lantánido donante), y cualquier contribución a la vida útil de la propia vida de la fluorescencia intrínseca del aceptor es relativamente insignificante. Mediante la medición de la emisión sensibilizada lugar de emisión del donante, también eliminamos la necesidad de garantizar el etiquetado exactamente en una proporción 1: 1 de los donantes al aceptor. La proteína puede marcarse en lugar simultáneamente con ambos fluoróforos donantes y aceptor. Dará como resultado una población heterogénea marcada, pero las proteínas marcadas con doble donantes no emitirá en la longitud de onda y aceptor proteínas marcadas doble aceptor no le hará ilusión. Por otra parte, la distancia entre fluoróforos debe ser la misma, independientemente de qué sitio cisteína un fluoróforo dado se une a, especialmente cuando se utilizan los lantánidos isotrópicas como un donante, por lo que el need para especificar un sitio determinado para recibir ya sea el donante o aceptor es innecesaria. La intensidad puede ser afectada con una población heterogénea, pero aún debe ser más que suficiente para ser detectado. Cuando la planificación de los experimentos, la elección de fluoróforos debe ser dictado por el valor de R 0 de la pareja, así como el rango de distancia esperada que está siendo medido. El valor de R 0 se define por la siguiente ecuación: <img alt="Ecuación 3" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895eq3.jpg" width="250" /> Eq. 3 donde, R 0 es el radio de Förster en Angstroms, κ 2 es el factor de orientación entre los dos colorantes (se asume que son 2/3), φ D es el rendimiento cuántico del donante, J es el solapamiento espectral integral entre el donante de espectro de emisión y el espectro de absorbancia del aceptor en M - 1cm -1 nm 4, y n es el índice de refracción del medio 1. Nuestro laboratorio ha añadido una modificación a la técnica convencional LRET mediante la introducción de un sitio de reconocimiento de proteasa entre los sitios donador y aceptor de etiquetas en la proteína que se probaron. Esta modificación permite la investigación en sistemas no-purificada tales como células de mamífero enteros 7. Esta técnica es particularmente útil cuando se utiliza cisteínas como sitios para el etiquetado, ya que en el proceso de etiquetado con tintes-maleimida conjugado que se unen a los grupos sulfhidrilo de cisteína, otras proteínas en las células que tienen cisteínas también se marcan. Sin embargo, mediante la inclusión de sitios de escisión de la proteasa de la proteína de interés y la medición de tiempos de vida antes y después de la escisión, el experimentador puede restar cuantitativamente la señal de fondo después de la escisión de la proteasa a partir de la señal sin procesar. Esta resta aísla la señal específica derivada de la proteína de interés (FigUre 2). Uso de la modificación descrita anteriormente, LRET se puede utilizar para medir los cambios de distancia entre el donante de quelato de terbio y la sonda aceptora en una proteína, y así vigilar los cambios conformacionales en estado fisiológico cerca de la proteína sin el requisito para la purificación. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1.El absorción y espectros de emisión de terbio quelado en negro, así como un aceptor de representante, Alexa 488, en rojo. Observe los múltiples picos de emisión y el, estrecho rango de emisión para cada pico agudo de quelato de terbio. Este patrón permite terbio para ser utilizado con una variedad de fluoróforos aceptores y facilita la medición de la emisión sensibilizada dentro de esos rangos, donde terbio muestra ninguna emisión. Pico de emisión del terbio a 486 nm se superpone bastante bien con el de un<html> pico bsorption de Alexa 488, lo que permite la transferencia de energía de resonancia que se produzca entre los dos fluoróforos. Una longitud de onda de 515 nm es una excelente elección para detectar la emisión sensibilizada para este par, ya que es en el valle entre los picos de emisión terbio, y bastante cerca de pico de emisión de Alexa 488 de 520 nm. Tenga en cuenta que estar cerca del pico de aceptor, aunque deseable, no se requiere-565 nm es todavía capaz de detectar emisión de Alexa 488 sin también detectando la emisión de terbio. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="374"><tbody><tr height="27"><td height="27" style="height:27px;width:147px;"> Fluoróforo aceptor </td><td style="width:45px;"> R 0 (Å) </td><td style="width:183px;"> Longitud de onda de emisión (nm) </td></tr><tr height="23"><td height="23" style="height:23px;width:147px;"> Atto 465 </td><td align="right" style="width:45px;"> 36 </td>3px; &quot;&gt; 508 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Fluoresceína </td><td align="right" style="width:45px;"> 45 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 488 </td><td align="right" style="width:45px;"> 46 </td><td align="right" style="width:183px;"> 515 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 680 </td><td align="right" style="width:45px;"> 52 </td><td align="right" style="width:183px;"> 700 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 594 </td><td align="right" style="width:45px;"> 53 </td><td align="right" style="width:183px;"> 630 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Alexa 555 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 565 </td></tr><trheight = &quot;22&quot;&gt; <td height="22" style="height:22px;width:147px;"> Cy3 </td><td align="right" style="width:45px;"> 65 </td><td align="right" style="width:183px;"> 575 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Una lista de fluoróforos aceptores usados ​​comúnmente para LRET usando quelato de terbio como donante 11. Se midieron los valores de R 0 cuando el donante y el aceptor se unen al dominio de unión del agonista soluble de los receptores AMPA. Es ideal para medir el valor de R 0 de nuevo para que se estudió cada nuevo sistema. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51895/51895fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Una visión general del método LRET presentado. (A) El receptor AMPA es una proteína de membrana que sufre cambios conformacionales a ligando vinculante. El ligando bi-en forma de concha de almeja-dominio hallazgo es un círculo aquí en rojo. (B) Existe el dominio de unión al ligando del AMPA cuando no se une a las proteínas en una conformación abierta (izquierda). Cuando se une a ligando de glutamato, la proteína se cierra alrededor de su ligando (derecha). Mediante la colocación de los fluoróforos en los sitios probatorios en el LBD, la naturaleza de este cambio conformacional puede ser visto como la distancia entre los fluoróforos cambios, que luego afectar de vida de fluorescencia. (C) Cuando, pueden ocurrir etiquetado tanto de la proteína de interés, así como proteínas de membrana fondo etiquetado células enteras (izquierda). Después de la escisión de la proteasa, la señal de LRET de la proteína de interés desaparecerá debido a la liberación de un fragmento soluble, dejando intacta la señal de fondo (derecha). Esta señal de fondo puede entonces ser sustraída de la señal sin procesar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1394">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:223px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:693px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">PV3579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F-150</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10254</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20346</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-10256</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide</td>
			<td style="width:223px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-20344</td>
			<td>Choice of acceptor depends on the specific experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">QuantaMaster 3-SS</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the ms range</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">FluoreScan 2.0</td>
			<td style="width:223px;">Photon Technology International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Origin 8.6</td>
			<td style="width:223px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Quartz Cuvette</td>
			<td style="width:223px;">Starna Cells, Inc</td>
			<td style="width:119px;">3-Q-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:360px;">Stir Bar&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Bel-Art Products</td>
			<td style="width:119px;">F37119-0007</td>
			<td>Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

luminescence resonance energy transfer to study conformational changes in membrane proteins expressed in mammalian cells

Transferencia de Energía de Resonancia de luminiscencia, o LRET, es una técnica poderosa utilizada para medir distancias entre dos sitios en las proteínas dentro de la gama de distancias de 10-100 Å. Mediante la medición de las distancias en diversas condiciones ligadas, los cambios conformacionales de la proteína se pueden evaluar fácilmente. Con LRET, un lantánido, terbio más a menudo quelado, se utiliza como el fluoróforo donante, proporcionando ventajas tales como una mayor vida útil de donantes única emisión, la flexibilidad de utilizar múltiples fluoróforos aceptores, y la oportunidad de detectar emisión del aceptor sensibilizado como una manera fácil para medir la transferencia de energía sin el riesgo de también la detección de la señal de donantes solamente. Aquí se describe un método para utilizar LRET en proteínas de membrana expresadas y ensayados en la superficie de las células de mamífero intactas. Se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre el par fluoróforo LRET. Después de obtener la señal LRET original, la escisión en ese sitio elimina la señal LRET específica de la proteína deinterés que nos permite restar cuantitativamente la señal de fondo que queda después de la escisión. Este método permite más fisiológicamente relevantes para mediciones pueden realizar sin la necesidad de purificación de proteína.

Una medición de LRET éxito con un donante lantánido debe tener un donante sólo toda la vida en el rango de tiempo de milisegundos. El tiempo de vida de la emisión sensibilizada LRET para la proteína marcada tanto con el donante y el aceptor será notablemente más corto, con un tiempo de vida en el rango de microsegundos después de sustracción de fondo Figura 3. Proteasa resultados de escisión en un aumento de la vida útil que debe ser estable en el tiempo ( es decir, ya no cambia), d...

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Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Se describe aquí un método mejorado de transferencia de energía de resonancia de luminiscencia (LRET) donde se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre los sitios de fluoróforo donante y receptor. Esta modificación nos permite obtener señales LRET específicas derivadas de proteínas de la membrana de interés, lo que permite el estudio de las proteínas de membrana sin la purificación de proteínas.

La luminiscencia de energía de resonancia de transferencia para estudiar cambios conformacionales en proteínas de membrana expresado en células de mamífero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

luminescence-resonance-energy-transfer-to-study-conformational

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.9K vistas.  University of Texas Health Science Center at Houston.  Se describe aquí un método mejorado de transferencia de energía de resonancia de luminiscencia (LRET) donde se introduce un sitio de escisión de la proteasa entre los sitios de fluoróforo donante y receptor. Esta modificación nos permite obtener señales LRET específicas derivadas de proteínas de la membrana de interés, lo que permite el estudio de las proteínas de membrana sin la purificación de proteínas. 

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Visualizing Proteins and Macromolecular Complexes by Negative Stain EM: from Grid Preparation to Image Acquisition

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural biology 1. In recent years, this method has achieved great success in studying structures of proteins and macromolecular complexes 2, 3. Compared with electron cryomicroscopy (cryoEM), in which frozen hydrated protein samples are embedded in a thin layer of vitreous ice 4, negative staining is a simpler sample preparation method in which protein samples are embedded in a thin layer of dried heavy metal salt to increase specimen contrast 5. The enhanced contrast of negative stain EM allows examination of relatively small biological samples. In addition to determining three-dimensional (3D) structure of purified proteins or protein complexes 6, this method can be used for much broader purposes. For example, negative stain EM can be easily used to visualize purified protein samples, obtaining information such as homogeneity/heterogeneity of the sample, formation of protein complexes or large assemblies, or simply to evaluate the quality of a protein preparation.
In this video article, we present a complete protocol for using an EM to observe negatively stained protein sample, from preparing carbon coated grids for negative stain EM to acquiring images of negatively stained sample in an electron microscope operated at 120kV accelerating voltage. These protocols have been used in our laboratory routinely and can be easily followed by novice users.

Visualizing protein samples by negative stain electron microscopy (EM) has become a popular structural analysis method. It is useful for quantitative structural analysis, such as calculating a 3D reconstruction of the molecules being studied, and also for qualitative examination of the quality of protein preparations. In this article we present detailed protocols for preparing the EM grids, staining the sample and visualizing the sample in an electron microscope. Novice users can follow these protocols easily and to utilize negative stain EM as a routine assay, in addition to other biochemical assays, for evaluating their protein samples.

Visualización de las proteínas y complejos macromoleculares de Negative EM Mancha: desde la preparación de la cuadrícula para adquisición de imágenes

Single particle electron microscopy (EM), of both negative stained or frozen hydrated biological samples, has become a versatile tool in structural ...

Investigación

Bioingeniería

An Experimental System to Study Mechanotransduction in Fetal Lung Cells

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key component of lung development is the differentiation of alveolar type II epithelial cells, the major source of pulmonary surfactant. These cells also participate in fluid homeostasis in the alveolar lumen, host defense, and injury repair. In addition, distal lung parenchyma cells can be directly exposed to exaggerated stretch during mechanical ventilation after birth. However, the precise molecular and cellular mechanisms by which lung cells sense mechanical stimuli to influence lung development and to promote lung injury are not completely understood. Here, we provide a simple and high purity method to isolate type II cells and fibroblasts from rodent fetal lungs. Then, we describe an in vitro system, The Flexcell Strain Unit, to provide mechanical stimulation to fetal cells, simulating mechanical forces in fetal lung development or lung injury. This experimental system provides an excellent tool to investigate molecular and cellular mechanisms in fetal lung cells exposed to stretch. Using this approach, our laboratory has identified several receptors and signaling proteins that participate in mechanotransduction in fetal lung development and lung injury.

Mechanical forces play a key role in lung development and lung injury. Here, we describe a method to isolate rodent fetal lung type II epithelial cells and fibroblasts and to expose them to mechanical stimulation using an in vitro system.

Un sistema experimental para estudiar Mecanotransducción en células de pulmón fetal

Mechanical forces generated in utero by repetitive breathing-like movements and by fluid distension are critical for normal lung development. A key ...

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein activity and have diverse roles in many biological processes. For example, SUMO covalently modifies a large number or proteins with important roles in many cellular processes, including cell-cycle regulation, cell survival and death, DNA damage response, and stress response 1-5. SENP, as SUMO-specific protease, functions as an endopeptidase in the maturation of SUMO precursors or as an isopeptidase to remove SUMO from its target proteins and refresh the SUMOylation cycle 1,3,6,7.
The catalytic efficiency or specificity of an enzyme is best characterized by the ratio of the kinetic constants, kcat/KM. In several studies, the kinetic parameters of SUMO-SENP pairs have been determined by various methods, including polyacrylamide gel-based western-blot, radioactive-labeled substrate, fluorescent compound or protein labeled substrate 8-13. However, the polyacrylamide-gel-based techniques, which used the "native" proteins but are laborious and technically demanding, that do not readily lend themselves to detailed quantitative analysis. The obtained kcat/KM from studies using tetrapeptides or proteins with an ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) or AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophore were either up to two orders of magnitude lower than the natural substrates or cannot clearly differentiate the iso- and endopeptidase activities of SENPs.
Recently, FRET-based protease assays were used to study the deubiquitinating enzymes (DUBs) or SENPs with the FRET pair of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP) 9,10,14,15. The ratio of acceptor emission to donor emission was used as the quantitative parameter for FRET signal monitor for protease activity determination. However, this method ignored signal cross-contaminations at the acceptor and donor emission wavelengths by acceptor and donor self-fluorescence and thus was not accurate.
We developed a novel highly sensitive and quantitative FRET-based protease assay for determining the kinetic parameters of pre-SUMO1 maturation by SENP1. An engineered FRET pair CyPet and YPet with significantly improved FRET efficiency and fluorescence quantum yield, were used to generate the CyPet-(pre-SUMO1)-YPet substrate 16. We differentiated and quantified absolute fluorescence signals contributed by the donor and acceptor and FRET at the acceptor and emission wavelengths, respectively. The value of kcat/KM was obtained as (3.2 &plusmn; 0.55) x107 M-1s-1 of SENP1 toward pre-SUMO1, which is in agreement with general enzymatic kinetic parameters. Therefore, this methodology is valid and can be used as a general approach to characterize other proteases as well.

Quantitative FRET F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

A novel method involving quantitative analysis of FRET (F&ouml;rster Resonance Energy Transfer) signals is described for studying enzyme kinetics. KM and kcat were obtained for the hydrolysis of the catalytic domain of SENP1 (SUMO/Sentrin specific protease 1) to pre-SUMO1 (Small Ubiquitin-like MOdifier). The general principles of this quantitative-FRET-based protease kinetic study can be applied to other proteases.

Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

Reversible posttranslational modifications of proteins with ubiquitin or ubiquitin-like proteins (Ubls) are widely used to dynamically regulate protein ...

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana<em&gt; En Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

A Protocol for Using F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

A Protocol for Using F&amp;#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Un protocolo para el uso de Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) y forzar Biosensores para medir fuerzas mecánicas en todo el complejo nuclear de LINC

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Escritura de Electrospinning de andamios Poly(ε-caprolactone) tridimensional con morfologías controlables para aplicaciones de ingeniería de tejidos del derretimiento

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Culturing Mammalian Cells in Three-dimensional Peptide Scaffolds

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an environment that closely mimics the structural features of non-polarized tissue. Furthermore, the particular intrinsic nanofiber structure of the scaffold makes it transparent to visual light, which allows for easy visualization of the sample under microscopy. This advantage was largely used to study cell migration, organization, proliferation, and differentiation and thus any development of their particular cellular function by staining with specific dyes or probes. Furthermore, in this work, we describe the good performance of this system to easily study the redifferentiation of expanded human articular chondrocytes into cartilaginous tissue. Cells were encapsulated into self-assembling peptide scaffolds and cultured under specific conditions to promote chondrogenesis. Three-dimensional cultures showed good viability during the 4 weeks of the experiment. As expected, samples cultured with chondrogenic inducers (compared to non-induced controls) stained strongly positive for toluidine blue (which stains glycosaminoglycans (GAGs) that are highly present in cartilage extracellular matrix) and expressed specific molecular markers, including collagen type I, II and X, according to Western Blot analysis. This protocol is easy to perform and can be used at research laboratories, industries and for educational purposes in laboratory courses.

Here, we present a protocol to obtain 3D-culture systems in self-assembling peptide scaffolds to promote the differentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes into cartilage-like tissue.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

A useful technique for culturing cells in a self-assembling nanofiber three-dimensional (3D) scaffold is described. This culture system recreates an ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

Un Orbital agitación cultivo de células mamíferas en vasos en forma de O para producir agregados uniforme

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...