Este manuscrito está dedicado a la memoria del Dr. Wenlan Wang, quien falleció el 26 de mayo de 2011. Se agradece al Dr. Douglas A. Kerr por su generosidad al proporcionar los HBG3 células TEr utilizados en este estudio. Este trabajo fue financiado por Nemours, una subvención (2 RR016472-10) en el marco del programa de INBRE del Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR), y un premio COBRE subvención de la CNRR (5 P20 RR020173-05) para apoyar el Centro de Investigación Pediátrica en el Alfred I. duPont Hospital para Niños, de Wilmington, Delaware, EE.UU..

1. Paso 1: madre embrionarias de ratón (ES) de cultivo celular (Tiempo: 3 días) 1. Revestimiento fibroblastos primarios de embriones de ratón (PMEF) <ol><li> Cubra cuatro platos de 100 mm de cultivo de tejidos con la gelatina para la adhesión PMEF. Añadir 8 ml de solución al 0,1% de gelatina (StemCell Technologies) a cada placa y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Eliminar el exceso de gelatina a partir de los platos. No enjuague los platos. </li><li> Diluir un vial de mitomicina C inactivado PMEF (Millipore) que contiene aprox. 5 x 10 6 células en 40 ml de PMEF los medios de comunicación (ver la receta en la Tabla 1) y la placa en cuatro de 100 mm placas de cultivo de tejidos. El PMEF proporcionar una capa alimentadora de células TEr. </li><li> PMEF deben ser cultivadas por lo menos un día antes de la adición de cultivos celulares TEr. PMEF se puede utilizar hasta 1 semana después de placas. </li></ol> 2. Revestimiento TEr células Para controlar la eficacia de la diferenciación celular en neuronas motoras MES, Hemos utilizado HBG3, una línea de células ES derivada de un ratón transgénico que expresa EGFP bajo el control del promotor de la neurona motora específica HB9. <ol><li> Descongelar un vial de células HBG3 MES (aprox. 1 x 10 7, aportados por el doctor Douglas Kerr, la Universidad Johns Hopkins) en un baño de agua 37 ° C. Añadir 5 ml de los medios de comunicación ES (ver la receta en la Tabla 1) en un tubo de 15 ml y centrifugar las células a 800 rpm durante 5 min. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender las células MES en 20 ml de medio ES con recién añadido factor inhibidor de leucemia (LIF) a una concentración final de 10 ng / ml. Nota: L hay que añadir el día de su uso y es necesario para mantener las células MES en un estado indiferenciado. </li><li> Retire los medios de comunicación de 10 ml de la PMEF PMEF en cada plato y añadir 10 ml de la suspensión de células ES HBG3 a cada plato. </li><li> 24 h después de la siembra, las células TEr formar pequeñas colonias, similar en tamaño a la colonia indicada por la flecha en la Figura 1B. 72 horas después de placas, colonizaciónaumento es de tamaño, muchos siendo aproximadamente 100 micras de diámetro (Figura 1B, indicado por las flechas). Estas células están listas para la diferenciación. Los medios han de ser reemplazado a diario para mantener la proliferación de las células. </li></ol> 2. Paso 2: Inducción neural (Tiempo: 2 días) Para inducir la diferenciación de las células TEr en neuronas motoras, las células TEr necesita ser separado de PMEF y se cultivaron en un medio ambiente de la suspensión. Gelatina matraces revestidos se utiliza para separar PMEF a partir de células TEr. <ol><li> Cuando las colonias TEr están listos para la inducción neural (definido como día diferenciación 0), la capa 2 T150 matraces con 0,1% de gelatina (18 ml / matraz) durante 30 min a temperatura ambiente y después eliminar el exceso de gelatina y se lava con PBS 1x tres veces. NOTA: Cada cultura plato de 100 mm se necesita un frasco de gelatina T150-revestido para separar PMEF. </li><li> Retire con cuidado los medios de comunicación por aspiración, teniendo cuidado de no desalojar a colonias poco adheridas. Añadir 10 ml de PBS brevemente y luego eliminar por aspiración de completar el paso de lavado. </li><li> Para separar las células MEs de PMEF, añadir 0,25% de tripsina / EDTA (3 ml / placa, StemCell Technologies) e incubar durante 3-5 min a 37 ° C hasta que las células madre y PMEF desprenderse de la placa. Añadir 15 ml de medio fresco sin ES LIF y las células de la pipeta hacia arriba y abajo para romper las colonias (alrededor de 15-20 veces). A continuación, añadir a un 0,1% de gelatina recubierto T150 matraz y se incuba durante 30 min a 37 ° C. Después de la incubación, PMEF debe adjuntar a la superficie gelatinizada, mientras que las células madre embrionarias deben estar flotando. Recoger las células flotantes TEr en un tubo de 50 ml. </li><li> Girar hacia abajo a 800 rpm y Resuspender las células en 10 ml de medio de diferenciación neuronal (ver la receta en la Tabla 1). </li><li> Cuenta las células utilizando un hemocitómetro y luego placa aproximadamente 2 x 10 6 células TEr en una placa de cultivo de 100-mm bacteriana o suspensión. Estas placas permiten el crecimiento de los cultivos en suspensión y promover la formación de cuerpos embrionarios (EBS). </li><li> En diferenciaciónción día 1, las células TEr formar pequeños agregados flotantes (EBS) que son visibles bajo un microscopio de luz. Cualquier prórroga PMEF conectar a la antena. Transferir las células y los medios de suspensión en un tubo de 15 ml y se centrifuga a baja velocidad (500 rpm) durante 3 min. Aspirar los medios de comunicación con cuidado, añadir 10 ml de medio fresco a la diferenciación neural pellets EBS, y luego las células de la placa bacteriana en un plato nuevo. Además de la reposición de los medios de comunicación, este paso se elimina la PMEF que llevan desde el paso anterior. </li><li> En el día diferenciación 2, EBS están listos para ser inducida en neuronas motoras. </li></ol> 3. Paso 3: Especificación de la Neurona Motora (Tiempo: 5 días) <ol><li> En el día de la diferenciación 2, agitar la placa de cultivo y transferencia de los medios de comunicación y EBS en un tubo de 15 ml. Vamos EBs asentarse por gravedad (~ 10 minutos) o por centrifugación a baja velocidad (500 rpm) durante 3 min. </li><li> Aspirar el medio de cuidado y EBS volver a suspender en 10 ml de diferenciación de las neuronas del motor (MND) medio (ver receta en el <strong&gt; Tabla 1). Placa de EBS en un plato bacteriana nueva y cambiar los medios de comunicación al día durante 5 días. </li><li> El día 7 de diferenciación, EBS debe ser aproximadamente de 150 a 200 micras de diámetro y debe expresar fuertes señales de buenas prácticas agrarias (Figura 1C). Estos EBS están listos para ser disociado y chapada en poly-DL-ornithine/laminin placas revestidas o cubreobjetos. </li></ol> 4. Paso 4: Preparación de Poly-DL-ornithine/laminin cubreobjetos recubiertos (Tiempo: 2 días) Dos días antes de la disociación EBS (es decir, el día de la diferenciación de 5), preparar cubreobjetos poly-DL-ornithine/laminin-coated. <ol><li> Colocar 12-mm redondas cubreobjetos (Warner Instruments) en la parte inferior de una placa de 24 pocillos. Disolver 25 mg de poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) en 25 ml de agua estéril, doble destilada (d 2 H 2 O) para obtener una solución madre de 10 veces (1 mg / ml). Cuando esté listo para usar, realizar una dilución a 1/10 de poli-DL-ornitina con d 2 H 2 O para obtener concentración de 100 g / ml. Añadir 0,5 ml a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incuba a 4 ° C durante la noche. </li><li> El día siguiente (día diferenciación 6), aspirado poli-DL-ornitina y dejar que las placas de cubierta y de aire seco se desliza en una campana de cultivo de tejidos. Lavar los pocillos de la placa con el d 2 H 2 O tres veces. Deje secar al aire durante una hora. </li><li> Disolver 1 mg laminina de ratón (Millipore) en 5 ml de helado-frío 1X PBS para hacer solución madre 100x (200 ug / ml). Cuando esté listo para utilizar, crear dilución 1/100 en el helado frío PBS 1X (2 mg de laminina / ml). Añadir 0,5 ml / pocillo en una placa de 24 pocillos y se incuban en 4 ° C durante la noche. Antes de las células de siembra, laminina exceso debe ser eliminado y pozos enjuagó con 1X PBS dos veces. Los cubreobjetos se pueden almacenar en DMN medio (0,5 ml / pocillo). </li></ol> 5. Paso 5: Alargamiento AXON (Tiempo: 2 días) <ol><li> En el día 7 diferenciación, recoger EBs en un tubo de 15 ml y permitir EBS para asentarse (aproximadamente 3 minutos). Aspirar medios de comunicación y de re-suspender EBs en PBS. Permitir EBs se asiente y luego aspirar el PBS. Repita este paso 3 veces. Añadir 1 ml de Accumax (Millipore) para el EBS, mezclar suavemente y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, aspirar el exceso de Accumax que cubre el EBS. </li><li> Para disociar EBS, añadir 3 ml de medio de MND. Pipetas arriba y hacia abajo 20 veces usando una micropipeta Eppendorf de 1 ml (punta azul) para interrumpir EBS. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferir la suspensión celular a un tubo de 12x75 mm con células colador tapa (BD Falcon) para obtener una suspensión de células individuales. Repita este paso disociación con el resto de grupos y células retenidas por el filtro con el fin de enriquecer el rendimiento de las células individuales. La suspensión final de células solo será de 6 ml. </li><li> Mezclar suavemente esta suspensión de células individuales y contar las células utilizando un hemocitómetro. Diluir las células en medio DMN (suplementado con 10 ng / ml de cada BDNF, GDNF, CNTF, y NT-3) a una densidad de 2x10 5 células por ml. Añadir suspensión celular (0,5 ml / pocillo) a placas de 24 pocillos que contienen POly-DL-ornithine/laminin recubiertos cubreobjetos (previamente preparado como se ha descrito anteriormente). Las células diferenciadas se extienden neuritas largas después de 2 días de cultivo (Figura 1D). </li></ol> 6. Los resultados representativos La Figura 1A muestra un esquema del protocolo. En el paso 1, las células se cultivan en TEr PMEF y suplementado con LIF para impedir la diferenciación espontánea. En general, no diferenciadas colonias TEr son redondos y compactos, y han definido claramente los bordes. Las colonias no están en contacto uno con el otro. Típicamente, las células TEr debe ser dividido en una proporción de 1:4 cada 2 ~ 3 días. Sin embargo, cada línea celular individual crecerá a un ritmo diferente y la relación de separación debe ser determinado empíricamente. Las flechas en la Figura 1B indican el aspecto típico de las células TEr después de cultivar en una capa alimentadora PMEF durante 3 días. Estas colonias son grandes (50-100 micras de diámetro), pero todavía mantienen borde redondo y definidos. En esta etapa las colonias están listos para la diferenciación o subcultivo. Una punta de flecha en la Figura 1B muestra una pequeña colonia MES que se encuentran típicamente 24 h después de placas. Cuatro días después de placas, las células TEr sido cubierto. Ellos muestran una apariencia aplastada y la pérdida de límites definidos, lo que indica que están empezando a diferenciarse. Tales células no son óptimas para la diferenciación en las células neuronales. Para diferenciar las células TEr en neuronas motoras, las células TEr necesitan ser cultivados en condiciones de suspensión para permitir la formación de EB. En el paso 2, las células ES se transfieren a una superficie de cultivo sin una capa alimentadora para promover la formación de EB. En este paso, se incuban en un medio suplementado con diferenciación neuronal Noggin, bFGF, y FGF 8-durante 2 días a las células directos a un linaje neural. Pequeñas EBs puede observarse bajo el microscopio en el día 1 de diferenciación. Deben estar flotando en el medio. Prórroga PMEF también se puede encontrar en el día 1de la diferenciación y debe ser eliminado. Estas células se adhieren a los platos de bacterias que se eliminan cuando se EBs se pasan a un plato bacteriana nuevo. Así, por día 2 de diferenciación, PMEF pocas o ninguna debe ser visto en la placa de cultivo. En el paso 3, continuación de la transferencia de EBS para nuevos platos debe asegurar la eliminación de cualquier PMEF restante. EBS se cultivan en las neuronas motoras (MND diferenciación) los medios suplementados con AR y SAG por 5 días para diferenciar las células en las neuronas motoras. Durante el cultivo, EBS continuará creciendo en tamaño y se puede ver a simple vista en el día de diferenciación 3 ~ 4. Figura 1C muestra el aspecto microscópico de EBS en día la diferenciación 7. A diferencia de las células no diferenciadas, EBS muestran una fuerte fluorescencia debido a la expresión de GFP. Estos EBs son óptimamente diferenciados y están listos para la disociación. La citometría de flujo mostró que el 51% ± 0,8% de las células de la disociada EBs se habían diferenciado en células que expresan GFP 5. En el paso 5, la cultura de THESE neuronas motoras en la presencia de GDNF, CNTF, el BDNF y NT3 resultados en la extensión de las proyecciones a largo axonal. Figura 1D muestra la apariencia de las células diferenciadas 2 días después de placas de disociarse EBS. Tenga en cuenta neuritas largas que se extienden desde los cuerpos celulares de las células cultivadas en placas. Tinción inmunofluorescente demuestra que las células GFP + expresan el marcador pan-neuronal (neurofilamentos-cadena media) y dos marcadores de motor neurona específica, (Islet-1 y colina acetiltransferasa, Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Figura 1. La diferenciación de las células TEr en las neuronas motoras (imagen modificada de Wu et al. 5). A) Esquema del protocolo de diferenciación de las células TEr a las neuronas motoras. B) las células no diferenciadas TEr forman colonias redondas en la parte superior de una capa alimentadora de fibroblastos. Tienen la expresión de GFP débil. C) Las células TEr fueron separados de las capas de alimentación y de culde color rojo en los platos de sujeción de baja para formar EBS. Durante los dos primeros días del proceso de diferenciación, las células fueron expuestas a 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml de bFGF, y 20 ng / ml de FGF-8. Posteriormente, fueron inducidas a diferenciarse con 1 mM de ácido retinoico y 1 mM de Sonic hedgehog SAG agonista durante 5 días. Células diferenciadas TEr expresó fluorescencia de GFP fuerte. D) Después de la diferenciación de 7 días, EBS se disocian y se colocaron en placas recubiertas poly-DL-ornithine/laminin. Las células diferenciadas extiende largos procesos neuronales después de 2 días de cultivo. Barras de escala = 200 micras. MN = de la neurona motora. B, C y D son imágenes brillantes sobre el terreno y B &#39;, C&#39; y D &#39;son las imágenes de fluorescencia correspondientes. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Figura 2. Caracterización de las neuronas motoras TEr derivadas de células. La tinción de inmunofluorescencia para la cadena de neurofilamentos medio (NF-M, de color rojo), chat (rojo), y el Islote de 1 (rojo) fue coincidente con las buenas prácticas agrarias (verde) expresión. DAPI (azul) se utilizó para identificar los núcleos. Barras de escala = 50 micras.

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No hay conflictos de interés declarado.

La calidad de las células MES es el parámetro más crítico para la generación eficiente de las neuronas motoras. TEr células deben ser cultivadas en PMEF para impedir la diferenciación espontánea. Además de LIF ayuda a mantener las células MES en un estado indiferenciado. Mientras que las células se dividen cada TEr h 12-15, el medio de cultivo se agota rápidamente y debe ser reemplazado a diario. Activación eficaz de la vía de Shh es un parámetro crítico necesario para induci...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF medio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES medio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cell-calificado de SFB </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> No aminoácidos esenciales </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nucleósidos </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio de diferenciación neuronal </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Culto de SFB </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> No aminoácidos esenciales </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-tio glicerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Vaso </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND medio (diferenciación) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Medio-A basal </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Golpe de gracia de suero de reemplazo </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Suplemento SU-B </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> El ácido ascórbico </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% en d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> La fibronectina </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07159 </td><td> 5 g / ml </td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml en D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> El ácido retinoico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> Merck Chemicals </td><td> 566660 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND medio (la cultura de la Neurona Motora) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Medio-A basal </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Golpe de gracia de suero de reemplazo </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Suplemento SU-B </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> El ácido ascórbico </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% en d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> La fibronectina </td><td> StemCTecnologías de ell </td><td> 07159 </td><td> 5 g / ml </td></tr><tr><td> La heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml en D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = no aplicable. Tabla 1. PMEF y Medios de Comunicación para el cultivo celular o la diferenciación MES. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;Nombre strong&gt; del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> La concentración final </td></tr><tr><td> 0,1% de gelatina </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml en D 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Laminina de ratón </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 g / ml en PBS </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina / EDTA </td><td> StemCell Tecnologías </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = no aplicable. Tabla 2. Reactivos para revestimiento y la disociación.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

La diferenciación directa de las madre embrionarias (ES) las células en las neuronas motoras funcionales representa un recurso promisorio para estudiar mecanismos de la enfermedad, para examinar los nuevos compuestos de drogas, y para desarrollar nuevas terapias para enfermedades de las neuronas motoras como la atrofia muscular espinal (SMA) y la esclerosis lateral amiotrófica ( ALS). Muchos protocolos actuales utilizan una combinación de ácido retinoico (RA) y Sonic hedgehog (Shh) para diferenciar madre embrionarias de ratón (ES) de las células en las neuronas motoras 1-4. Sin embargo, la eficacia de la diferenciación de las células en las neuronas motoras TEr sólo ha tenido un éxito moderado. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación de dos pasos 5 que mejora significativamente la eficiencia diferenciación en comparación con los protocolos establecidos actualmente. El primer paso consiste en mejorar el proceso de neuralization añadiendo Noggin y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Noggin es una proteína morfogenética ósea (BMP) antagonista y está implicada en la inducción neural unae acuerdo con el modelo por defecto de la neurogénesis y los resultados en la formación de patrones neural anterior 6. FGF señalización actúa sinérgicamente con Noggin en la inducción de la formación de tejido neuronal mediante la promoción de una identidad neuronal posterior 7-9. En este paso, las células fueron TEr imprimado con Noggin, bFGF, y FGF 8-durante dos días para promover la diferenciación hacia linajes neuronales. El segundo paso es inducir motor especificación neurona. Noggin / FGF expuestas las células fueron incubadas con TEr RA y un agonista de Shh, agonista Smoothened (SAG), por otros 5 días para facilitar la generación de neuronas del motor. Para controlar la diferenciación de ETM en neuronas motoras, se utilizó una línea de células ES derivan de un eGFP ratón transgénico que expresa bajo el control del promotor de la neurona motora específica HB9 1. El uso de este protocolo completo, hemos logrado 51 ± 0,8% de la eficiencia de la diferenciación (n = 3, p &lt;0,01, t de Student-test) 5. Los resultados de inmunofluorescenciatinción mostró que las buenas prácticas agrarias + células expresan los marcadores de la neurona motora específicos, Islet-1 y la colina acetiltransferasa (CAT). Nuestro protocolo de dos pasos de diferenciación proporciona una solución eficiente para diferenciar células TEr en neuronas motoras espinales.

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

JoVE Journal

Biology

22.1K vistas.  Alfred I. duPont Hospital for Children. Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Video: Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Investigación

Biología

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

En la diferenciación in vitro de la madre embrionarias de ratón (MES), las células con el método de gota

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivación eficiente de los Derechos Humanos precursores cardiacos y cardiomiocitos de pluripotentes células madre embrionarias humanas mediante la inducción de moléculas pequeñas

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generación de ratones derivados de células madre pluripotentes inducidas

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

La diferenciación de ratón recién nacido piel derivados de las células madre en células germinales-como<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...