Bu yazının May 26, 2011 tarihinde vefat Dr Wenlan Wang anısına adanmıştır. Biz cömertçe Bu çalışmada kullanılan HBG3 MES hücreler sağlamak için Dr Douglas A. Kerr teşekkür ederim. Bu çalışma Nemours tarafından finanse edildi, bir Araştırma Kaynakları Ulusal Merkezi (NCRR) ve Merkezi desteklemek için NCRR bir Cobre hibe (5 P20 RR020173-05) INBRE program kapsamında hibe (2 RR016472-10) Çocuklar, Wilmington, Delaware, ABD için Alfred I. duPont Hastanesi Pediatrik Araştırma.

1. Adım 1: Fare Embriyonik Kök (MES) Hücre Kültürü (Zamanlama: 3 gün) 1. Kaplama birincil fare embriyonik fibroblast (PMEF) <ol><li> PMEF yapışması için jelatin ile kaplayın dört adet 100 mm doku kültürü yemekleri. Her bir çanak% 0.1 jelatin çözeltisi (StemCell Technologies) 8 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Yemeklerinden jelatin fazla çıkarın. Bulaşıkları durulama yapmayın. </li><li> Yaklaşık içeren Mitomisin C-inaktive PMEF (Millipore) bir şişe sulandırınız. 5 x 10 6 PMEF ortam 40 ml içine hücreleri (Tablo 1 &#39;de tarif bakınız) ve dört adet 100 mm&#39;lik doku kültürü plakası üzerine tabaklar. PMEF MES hücreleri için bir besleyici tabakası oluşturmak. </li><li> PMEF MES hücre kültürleri eklemeden önce en az bir gün kaplama edilmelidir. PMEF kaplama sonra 1 hafta kadar kullanılabilir. </li></ol> 2. Kaplama MES Hücreleri Motor nöronların içine MES hücre farklılaşmasının etkinliğini izlemekBiz HBG3, motor nöron özel yükseltici HB9 kontrolü altında eksprese EGFP bir transjenik fare elde edilen bir ES hücre hattı kullanılır. <ol><li> Defrost 37 ° C su banyosunda HBG3 MES hücrelerin 1 flakon (yaklaşık 1 x 10 7, Dr Douglas Kerr, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından katkı). 15 ml tüp ES medya (Tablo 1 tarife bakınız) 5 ml ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 rpm&#39;de hücreleri aşağı spin. </li><li> 10 ng / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon taze olarak eklendi Lösemi inhibe edici faktör (LİF) ile ES ortam 20 ml süpernatan aspirat ve Pastör pipetiyle MES hücreleri. NOT: LİF kullanım gününde ilave edilmesi ve farklılaşmadan durumda MES hücreleri korumak için gereklidir. </li><li> Her yemekte PMEF 10 ml PMEF ortamı çıkarın ve her yemek için HBG3 ES hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin. </li><li> 24 saat sonra kaplama, MES hücre boyutu Şekil 1B ok ile gösterilen koloni benzer küçük koloniler oluştururlar. Kaplama sonrası 72 saat, koloniboyutu es artış, çok sayıda çapı yaklaşık 100 mikron (Şekil 1B, oklarla gösterilen) olmak. Bu hücrelerin farklılaşması için hazırız. Ortam hücrelerinin proliferasyon korumak için günlük değiştirilmesi gerekir. </li></ol> 2. Adım 2: Sinir İndüksiyon (Zamanlama: 2 gün) Motor nöron içinde MES hücrelerinin farklılaşmasını teşvik etmek için, MES hücreleri PMEF ayrılmış ve bir süspansiyon bir ortamda yetiştirilir gerekir. Jelatin kaplı şişeler MES hücrelerinden PMEF ayırmak için kullanılır. <ol><li> MES koloniler nöral indüksiyon (farklılaşma gün 0 olarak tanımlanır), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin (18 ml / şişe) ile kat 2 T150 şişeler için hazır ve ardından aşırı jelatin kaldırmak ve 1x PBS üç kez yıkayın zaman. NOT: Her 100 mm çanak kültür PMEF ayırmak için bir T150-jelatin kaplı şişesi gerekir. </li><li> Dikkatle gevşek bağlı koloniler çıkarmak için değil emin, aspirasyon ortamı çıkarın. 10 ml PBS kısa eklely ve sonra yıkama adımı tamamlamak için aspirasyon kaldırın. </li><li> PMEF gelen MES hücreleri ayırmak için,% 0.25 eklemek tripsin / EDTA (3 ml / çanak, StemCell Teknolojileri) ve 37 &#39;de 3-5 dakika inkübe ° C kök hücre ve PMEF levhadan ayırmak kadar. Koloniler (15-20 kez) kırmak için aşağı LIF ve pipet hücreleri olmadan 15 ml taze ES medya ekleyin ve. Daha sonra, bir% 0.1 jelatin kaplı T150 şişesine ilave ve 37 C&#39;de 30 dakika inkübe ° C. ES hücrelerinin yüzen gerekirken inkübasyondan sonra, PMEF jelatinize yüzey eklemek gerekir. 50 ml&#39;lik bir tüp içine kayar MES hücreler toplanır. </li><li> (Tablo 1 tarife bakınız) Sinir Farklılaşma Orta 10 ml 800 rpm ve Pastör pipetiyle hücreleri aşağı Spin. </li><li> Bir 100 mm bakteriyel ya da süspansiyon kültürü çanağı üzerine bir hemasitometre ve ardından plaka yaklaşık 2 x 10 6 MES hücreleri kullanılarak hücreleri hesaplama. Bu plakalar süspansiyon kültürleri büyüme izin ve embriyoid organları (EBS) oluşumunu arttırabilir. </li><li> Differentia AçıkTION gün 1, MES hücrelerinin ışık mikroskobu altında görülebilen küçük kayan agrega (EBS) oluştururlar. Herhangi bir bulaşma, PMEF çanak eklemek. 3 dk için düşük hızda (500 rpm) 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne ve içine süspansiyon hücreleri ve medya transfer edin. Dikkatli medya aspire, yeni bir bakteriyel çanak plaka hücreleri daha sonra pelet EBS taze Sinir Farklılaşma Orta 10 ml ekleyin ve. Ortam ikmal ek olarak, bu adım adım önceden arta taşıyan herhangi bir PMEF kaldırır. </li><li> Farklılaşma Gün 2, EBS motor nöronlar indüklenen hazırdır. </li></ol> 3. Adım 3: Motor Nöron Özelliği (Zamanlama: 5 gün) <ol><li> Farklılaşma gün 2, girdap kültürü çanak ve 15 ml tüp içine medya ve EBS aktarmak Açık. EBS ağırlık (~ 10 dakika) ile ya da 3 dk için düşük hızda (500 rpm) santrifüje edilerek dinlendiriniz. </li><li> (Tarifi bkz. Motor Nöron Farklılaşma 10 ml (MSB) orta dikkatli ve Pastör pipetiyle EBS orta aspire <strong&gt; Tablo 1). Plaka yeni bir bakteriyel çanak EBS ve 5 gün boyunca günde ortamı değiştirmek. </li><li> Çapı 200 mikron ve kuvvetli GFP sinyali (Şekil 1C) ifade olmalıdır - farklılaşma 7. günde, EBS yaklaşık 150 olmalıdır. Bu EBS kaplı yemekleri veya lamelleri poly-DL-ornithine/laminin üzerine disosiye ve kaplama olmaya hazırız. </li></ol> 4. Adım 4: Poly-DL-ornithine/laminin Kaplı lameller hazırlanması (Zamanlama: 2 gün) İki gün EBS dissociating önce (farklılaşma 5. gününde yani), poly-DL-ornithine/laminin-coated lamelleri hazırlamak. <ol><li> 24-iyi plakanın altına yerleştirin 12 mm yuvarlak lamelleri (Warner Araçlar). 10X bir stok çözelti (1 mg / ml) elde etmek için 25 mg 25 ml&#39;de poli-DL-ornitin (Sigma-Aldrich), steril, çift damıtılmış su (d 2 H 2 O) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, konsantrasyonlarda elde etmek için d 2 H 2 O ile poli-DL-ornitin bir 1/10 dilüsyon yapmak100 mcg / ml oranı. Gece boyunca 4 at 24-kuyulu plakalı ve inkübe her bir yanı ° C ila 0.5 ml ilave edilir. </li><li> Ertesi gün (farklılaşma günde 6), aspirat poli-DL-ornitin ve doku kültürü kaputu plakaları ve kuru kapak slipleri hava sağlar. D 2 H2O ile üç kez plakası kuyuları çalkalayın. Bir saat için hava kurumasını bekleyin. </li><li> 100X stok solüsyonu (200 ug / ml) yapmak için buzlu soğuk PBS 1X 5 ml içinde 1 mg fare laminin (Millipore) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, buzlu-soğuk 1X PBS (2 mcg laminin / ml) 1/100 dilüsyon olun. 0.5 mL / 4 iyi bir 24-iyi plaka ve inkübe ° C gece için. Tohum hücreleri önce, aşırı laminin kaldırılır ve kuyular 1X PBS iki defa durulanmalıdır. Lamelleri MSB&#39;nin ortamı (0.5 ml / oyuk) saklanabilir. </li></ol> 5.. Adım 5: Axon Uzama (Zamanlama: 2 gün) <ol><li> Farklılaşma Gün 7 günü, 15 ml tüp içine EBS toplamak ve EBS (yaklaşık 3 dakika) yerleşmesine izin. Aspirat ortam ve yeniden sPBS içinde uspend EBS. EBS yerleşmek ve sonra PBS aspire izin verin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Hafifçe karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir, EBS üzere Accumax (Millipore) 1 ml ilave edilir. Sonra EBS kapsayan aşırı Accumax aspire. </li><li> EBS ayırmak için, MSB orta 3 ml ekleyin. EBS bozmak için 1 ml Eppendorf mikropipet (mavi uç) kullanarak pipet aşağı yukarı 20 kez. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre süzgecinden kap (BD Falcon) ile 12x75 mm tüp için hücre süspansiyonu aktarın. Tek hücrelerin verim zenginleştirmek şekilde filtre tarafından tutulan kalan topaklar ve hücreler ile ayrışma adımda tekrar edin. Nihai tek bir hücre süspansiyonu 6 ml olacaktır. </li><li> Yavaşça bu tek hücre süspansiyonu karıştırmak ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 2x10 ml başına 5 bir hücre yoğunluğuna MND ortamı (10, her BDNF ng / ml, GDNF, CNTF ve NT-3 ile desteklenmiş) içine hücreleri ile seyreltilir. Po içeren 24 kuyucuklu plaklar hücre süspansiyonu (0.5 ml / oyuk) ekleyinly-DL-ornithine/laminin kaplamalı lamelleri (yukarıda tarif edildiği gibi, daha önce hazırlanmış). Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün (Şekil 1D) sonra uzun neurites uzatmak. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1A protokolünün bir taslağını göstermektedir. 1. adımda, MES hücreleri PMEF üzerinde yetiştiriliyor ve spontan farklılaşmasını önlemek için LIF ile desteklenmiş. Genel olarak, farklılaşmamış MES koloniler yuvarlak ve kompakt olup, kenarları açıkça tanımlamıştır. Koloniler birbiri ile temas halinde değildir. Tipik olarak, MES hücrelerin her 2 ~ 3 gün 1:04 oranında bölünmüş olmalıdır. Ancak, her bir hücre hattı farklı bir oranda artacak ve split oranı ampirik olarak tespit edilmelidir. Şekil 1B oklar 3 gün için bir PMEF besleyici tabakaya kültürleme sonra MES hücrelerinin tipik görünüşünü göstermektedir. Bu koloniler büyük (çapı 50-100 mikron) ama yine yuvarlak ve tanımlanmış avantajı sağlamaks. Bu aşamada koloniler farklılaşma ya da alt kültür için hazırız. Şekil 1B bir ok ucu, genellikle kaplama 24 saat sonra bulduğu küçük bir MES koloni gösterir. Kaplama dört gün sonra, MES hücreleri büyümüş olur. Onlar ayrım başlıyor belirten düzleştirilmiş bir görünüm ve tanımlanan sınırlar kaybı gösterir. Böyle hücreler, nöronal hücre içine farklılaşma için optimal değildir. Motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için, MES hücreleri EB oluşumuna izin süspansiyon koşullarda yetiştirilen gerekir. Adım 2&#39;de, ES hücreleri EB oluşumunu teşvik etmek için bir besleyici tabakası olmadan bir kültür yüzey üzerine aktarılmaktadır. Bu adımda, bunlar bir sinir soyu için doğrudan hücrelere 2 gün süreyle Noggin, bFGF ve FGF-8 ile desteklenmiş Neural Farklılaştırma besiyerinde enkübe edilir. Küçük EBS farklılaşma 1. günde mikroskop altında görülebilir. Bunlar, orta yüzen edilmelidir. Bulaşma PMEF da gün 1 adresinde bulunabilirdiferansiyasyonun ve çıkarılması gerekir. Bu hücreler EBS yeni bir bakteriyel bir çanakla pasajlanmağa çok zaman ortadan kalkar bakteriyel yemekler uygun. Böylece, farklılaşma günde 2 tarafından, az ya da hiç PMEF kültürü tabağına görülmelidir. 3. adımda, yeni yemekler için EBS transferi kalan PMEF çıkarılmasını sağlamalıdır devam etti. EBS RA ile takviye Motor Nöron Farklılaşma (MSB) medya kültürü ve motor nöronların içine hücreleri ayırt etmek için 5 gün boyunca SAG edilir. Kültür sırasında, EBS boyutları büyümeye devam ediyor ve farklılaşma 3. günde çıplak gözle görülebilir ~ 4. Şekil 1C farklılaşma 7. günde EBS mikroskobik görünüm gösterir. Farklılaşmamış hücrelerin aksine, EBS GFP ekspresyonu nedeniyle güçlü floresans gösterir. Bu EBS optimal farklılaşmış ve ayrışma için hazırız. Akış sitometrisi% 51 ± ayrışmış EBS gelen hücreler% 0.8 &#39;i ifade eden hücrelerin 5 GFP ayrışmıştır olduğunu gösterdi. Adım 5, inci kültürdeGDNF, CNTF, BDNF, ve uzun akson uzantısı projeksiyonlar NT3 sonuçlar varlığında ese motor nöron. Şekil 1B 2 gün ayrışmış EBS&#39;nin sonra kaplama farklılaşmış hücreler görünümünü gösterir. Kaplamalı hücrelerin hücre gövdeleri uzanan uzun neurites not edin. Immünofloresan boyama GFP + hücrelerin pan-nöronal marker (nörofilaman-orta zincirli) ve iki motor nöron spesifik belirteçler, (Islet-1 ve kolin asetiltransferaz, Şekil 2) ifade gösterir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Şekil 1. Motor nöronları (resim Wu ve ark güncellenmiştir. 5) MES hücrelerin Farklılaşma. MES hücrelerinden motor nöron için farklılaşma protokolünün A) şeması. B) ayrım MES hücreler fibroblast besleyici tabakasının üstünde yuvarlak koloniler oluştururlar. Onlar zayıf GFP var. C) MES hücreleri besleyici ve katmanlar ayrıldı kültürlerdekiEBS oluşturmak için düşük eki yemekler kırmızı. Farklılaştırma prosesi ilk iki gün boyunca, hücreler 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml FGF-8 maruz bırakıldı. Daha sonra, onlar 1 uM retinoik asit ve 5 gün süreyle 1 uM sonik kirpi agonisti SAG ile ayırt etmek için oluşturuldu. Farklılaştırılmış MES hücreleri güçlü GFP floresan dile getirdi. D)-7 gün sonra farklılaşma, EBS poly-DL-ornithine/laminin kaplı levhalar üzerine ekildi ve ayrıştırıldı. Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün sonra uzun nöral süreçleri uzatıldı. Ölçek çubuğu = 200 mikron. MN = motor nöron. B, C ve D parlak bir alan görüntüler ve B &#39;, C&#39; ve D &#39;ilgili floresans görüntülerdir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Şekil 2,. MES hücresinden türetilmiş motor nöron karakterizasyonu. Nörofilaman orta zincirli (NF-M, kırmızı), ChAT (kırmızı) ve Islet-1 (kırmızı) immünofloresan boyaması GFP (yeşil) ifade tesadüf olduession. DAPI (mavi) çekirdekleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 50 um.

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

MES hücrelerinin kalitesi motor nöron verimli bir kuşak için en önemli bir parametredir. MES hücreler spontan farklılaşmasını önlemek için PMEF yetişen gerekir. LIF eklenmesi farklılaşmadan devlet MES hücrelerin korunmasına yardımcı olur. MES hücreler her 12-15 saat, bölme olarak kültür ortamı hızla tüketilmiş hale gelir ve günlük olarak değiştirilmesi gerekir. Şşş yolunun Verimli aktivasyonu motor nöron özellikleri ikna etmek için gereken kritik bir para...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Hücre-Nitelikli FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Nükleosidlerin </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sinir Farklılaşma orta </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 06905 </td><td> % 15 </td></tr><tr><td> Olmayan amino asitler </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Mono-tiyo gliserol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Kafa </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (farklılaşma) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> Retinoik Asit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> Merck Kimyasallar </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MSB orta (Motor Nöron kültürü) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Bazal Orta-A </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout serum yerine </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td> N-2 takviyesi </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> ITS Ek-B </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07155 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07157 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> Penisilin / streptomisin </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> % 1 </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O% 0.15 </td></tr><tr><td> Fibronektin </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> D 2 içinde 20 ug / ml H2O </td></tr><tr><td> β-merkaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 1. MES hücre kültürü veya farklılaşma için PMEF ve Medya. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;reaktifin strong&gt; Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Nihai konsantrasyon </td></tr><tr><td> Jelatin% 0.1 </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> D 0.1 mg / ml 2 H2O </td></tr><tr><td> Fare laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 mcg / ml PBS </td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin / EDTA </td><td> StemCell Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Non-uygulanabilir. Tablo 2. Kaplama ve ayrışma için Reaktifler.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Fonksiyonel motor nöronların embriyonik kök (ES) hücreleri doğrudan farklılaşma, hastalık mekanizmaları incelemek için yeni ilaç bileşikleri taranması ve bu spinal müsküler atrofi (SMA) ve Amyotrofik lateral skleroz (gibi motor nöron hastalıkları için yeni tedaviler geliştirmek için bir umut kaynağı temsil ALS). Birçok mevcut protokoller motor nöronların 1-4 içine fare embriyonik kök (MES) hücreleri ayırt etmek için retinoik asit (RA) ve sonik kirpi (Sus) bir arada kullanabilirsiniz. Ancak, motor nöronların içine MES hücrelerin farklılaşması verimliliği sadece ılımlı bir başarı ile bir araya geldi. Şu anda önemli ölçüde standart prosedürlere göre farklılaşma etkinliğini arttırır iki adımlı bir farklılaşma protokolü 5 gelişmiştir. Birinci adımda Noggin ve fibroblast büyüme faktörleri (FGFs) ekleyerek neuralization işlemi arttırmaktır. Noggin bir kemik morfogenetik protein (BMP) antagonistidir ve nöral indüksiyon karışmış birnöron ve ön sinirsel desenlendirme 6 oluşumunda sonuçların varsayılan modeline ccording. FGF sinyal posterior nöral kimlik 7-9 teşvik ederek nöral doku oluşumuna sebep olarak Noggin ile sinerjik olarak hareket eder. Bu adımda, MES hücre soyları sinirsel doğru farklılaşmasını teşvik etmek için, iki gün süre ile Noggin, bFGF ve FGF-8 ile astarlanmış edildi. İkinci aşamada, motor nöron özellikleri elde edilmesini sağlanmaktadır. Noggin / MES hücreleri maruz FGFs motor nöron üretimi kolaylaştırmak için başka bir 5 gün süreyle RA ve bir Shh agonisti, düzeltilir agonisti (SAG) ile inkübe edildi. Motor nöron içinde MESS farklılaşma izlemek için, motor nöron özel yükseltici HB9 1 kontrolü altında, bir transjenik farenin ifade EGFP türetilmiş bir ES hücre dizisi kullanılabilir. Bu sağlam protokolü kullanarak, ± farklılaşma verimliliği% 0.8 51 elde (n = 3, p &lt;0.01, Student t-testi) 5. Immünofloresan elde edilen sonuçlar,boyama GFP + hücrelerin motor nöron spesifik belirteçler, Islet-1 ve asetil kolin (ChAT) olduğunu göstermiştir. Bizim iki adım farklılaşma protokolü spinal motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için etkili bir yol sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Motor Nöronlar içine Fare Embriyonik Kök Hücre Verimli Farklılaşma

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Görüntüleme.  Alfred I. duPont Hospital for Children. Biz motor nöronlar içine fare embriyonik kök hücreleri in vitro ayrımında verimliliğini artırmak için yeni bir protokol geliştirdi. Farklılaşmış ES hücreleri motor nöronlar gibi immünohistokimyasal teknikler kullanılarak nöron ve motor nöron belirleyicilerin ekspresyonu ile kanıtlandığı özellikleri satın aldı.

Video: Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Biyoloji

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

Asma Bırak Yöntemiyle Fare Embriyonik Kök (MES) Hücreler in vitro Farklılaşma

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Kültürleme İnsan Embriyonik ve Bağlı Pluripotent Kök Hücrelerinin için uygundur Fare embriyonik fibroblast hücreleri hazırlanması

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Bir Multititre Plaka Biçimi İnsan Pluripotent Kök Hücreler Nöron Hızlı ve Verimli Üretim

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...