כתב יד זה מוקדש לזכרו של ד&quot;ר וואנג Wenlan שהלך לעולמו ב -26 במאי 2011. אנו מודים ד&quot;ר דאגלס א קר בנדיבות על מתן HBG3 MES תאים המשמשים במחקר זה. עבודה זו מומנה על ידי Nemours, מענק (2 RR016472-10) במסגרת תוכנית INBRE של המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR), וכן בפרס מענק COBRE מ NCRR (5 P20 RR020173-05) כדי לתמוך המרכז מחקר ילדים בבית א &#39;אלפרד duPont החולים לילדים, בווילמינגטון, דלאוור, ארה&quot;ב.

1. שלב 1: עכבר גזע עובריים (MES) תרבית תאים (תזמון: 3 ימים) 1. ציפוי העיקריים עכבר fibroblasts עובריים (PMEF) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל 4 100 מ&quot;מ בתרבית רקמה מנות עם ג&#39;לטין של הידבקות PMEF. הוסף 8 מ&quot;ל של תמיסת הג&#39;לטין 0.1% (StemCell טכנולוגיות) לצלחת כל דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת עודפי ג&#39;לטין מן הכלים. אין לשטוף את הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 בקבוקון של mitomycin C-מומת PMEF (Millipore) המכיל כ. 5 x 10 6 תאים לתוך 40 מ&quot;ל של PMEF התקשורת (ראה מתכון טבלה 1) לבין צלחת על ארבע 100 מ&quot;מ צלחות תרבית הרקמה. PMEF לספק שכבת מזין עבור תאים MES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PMEF צריך להיות מצופה לפחות יום אחד לפני הוספת תרביות תאים MES. PMEF ניתן להשתמש עד שבוע 1 לאחר ציפוי. </li></ol> 2. ציפוי MES תאים כדי לפקח על היעילות של התמיינות תאים MES אל הנוירונים המוטוריים, השתמשנו HBG3, תא ES קו נגזר עכבר מהונדס המבטא eGFP בשליטת היזם המנוע נוירון מסוים Hb9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 1 בקבוקון של HBG3 תאים MES (בערך 1 x 10 7, שנתרם על ידי ד&quot;ר דאגלס קר, ג&#39;ון הופקינס) ב C ° 37 אמבט מים. הוסף 5 מ&quot;ל של ES התקשורת (ראה מתכון טבלה 1) בצינור 15 מ&quot;ל ומסובב את התאים בסל&quot;ד 800 דקות 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate supernatant ו resuspend תאים MES ב 20 מ&quot;ל של התקשורת גזע עובריים עם גורם הוסיף טרי מעכבות לוקמיה (LiF) בריכוז סופי של 10 ng / mL. הערה: LiF יש להוסיף ביום השימוש יש צורך לשמור על התאים MES במדינה מובחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 10 מ&quot;ל התקשורת PMEF מ PMEF בכל צלחת ומוסיפים 10 מ&quot;ל של השעיה ES HBG3 תא כל מאכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות לאחר ציפוי, תאים MES ליצור מושבות קטנות, בגודל דומה המושבה שמסומן על ידי ראש חץ ב איור 1 ב. 72 שעות לאחר ציפוי, coloniגידול בגודל ES, רבים להיות כ 100 מיקרומטר קוטר (איור 1 ב, שמסומן על ידי חיצים). תאים אלו מוכנים בידול. בתקשורת יש להחליף מדי יום כדי לשמור על התרבות התאים. </li></ol> 2. שלב 2: השראה עצבית (תזמון: 2 ימים) להשרות התמיינות של תאים MES אל הנוירונים המוטוריים, תאים MES צריך להיפרד PMEF, והוא גדל בסביבה ההשעיה. צלוחיות מצופה ג&#39;לטין משמשים להפריד PMEF מתאי MES. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המושבות MES מוכנים אינדוקציה עצבית (כפי שמוגדר היום בידול 0), מעיל 2 T150 צלוחיות עם 0.1% ג&#39;לטין (18 מ&quot;ל / בקבוק) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הסר ג&#39;לטין עודף ולשטוף עם 1x PBS שלוש פעמים. הערה: כל התרבות 100 מ&quot;מ צלחת תצטרך 1 T150-ג&#39;לטין בקבוק מצופה להפריד PMEF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את התקשורת על ידי שאיפה, כדי לוודא שלא לעקור מושבות המחוברים באופן רופף. הוסף 10 מ&quot;ל PBS קצרLY ולאחר מכן הסר ידי השאיפה להשלים שלב הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד תאים MES מ PMEF, מוסיפים 0.25% טריפסין / EDTA (3 מ&quot;ל / צלחת, StemCell Technologies) ו דגירה של 3-5 דק &#39;ב 37 ° C עד בתאי גזע PMEF להתנתק מהצלחת. הוסף 15 מ&quot;ל טריים התקשורת גזע עובריים ותאי ללא LiF pipet למעלה ולמטה כדי לשבור המושבות (כ 15-20 פעמים). לאחר מכן, להוסיף בקבוק 0.1% T150 ג&#39;לטין מצופה ו דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C. לאחר הדגירה, PMEF צריך לצרף אל פני השטח gelatinized תוך תאים ES יש צף. אוספים את התאים הצפים MES לתוך צינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה על 800 סל&quot;ד ותאי resuspend ב 10 מ&quot;ל של מדיום בידול עצבית (ראה מתכון טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים באמצעות hemocytometer ואז כ צלחת 2 x 10 6 תאים MES על צלחת 100 מ&quot;מ התרבות חיידקי או השעיה. לוחות אלו מאפשרים צמיחה של תרבויות ההשעיה ולקדם הקמת גופים embryoid (EBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על הפרשיום tion 1, תאים MES ליצור אגרגטים צף קטן (EBS) הנראים תחת מיקרוסקופ אור. כל PMEF שריד לצרף צלחת. להעביר את התאים ההשעיה ומדיה לתוך צינור 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגה במהירות נמוכה (500 סל&quot;ד) 3 דקות. Aspirate התקשורת בזהירות, מוסיפים 10 מ&quot;ל של מדיום חדש בידול עצבית אל EBS pelleted ולאחר מכן התאים צלחת בצלחת חיידקים חדש. בנוסף חידוש התקשורת, צעד זה מסיר כל PMEF כי לשאת על מהשלב הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום בידול 2, EBS מוכנים להיגרם אל הנוירונים המוטוריים. </li></ol> 3. שלב 3: Motor Neuron מפרט (תזמון: 5 ימים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום בידול 2, לערבל את המנה התרבות ולהעביר את התקשורת EBS לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל. בואו EBS ליישב על ידי כוח הכבידה (~ 10 דקות) או על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה (500 סל&quot;ד) על 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aspirate בינוני בזהירות resuspend EBS ב 10 מ&quot;ל של התמיינות תא עצב מוטורי (MND), בינוני (ראו מתכון <strong&gt; לוח 1). הצלחת EBS בצלחת חיידקים חדש ולשנות את התקשורת מדי יום במשך 5 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום בידול 7, EBS צריך להיות כ 150 - 200 מיקרומטר בקוטר צריך להביע את אותות ה-GFP חזק (איור 1 ג). EBS אלה מוכנים להיות מנותק ולא מצופה על poly-DL-ornithine/laminin כלים מצופים או coverslips. </li></ol> 4. שלב 4: הכנת Coverslips מצופה Poly-DL-ornithine/laminin (תזמון: 2 ימים) יומיים לפני מתנער EBS (כלומר ביום בידול 5), להכין coverslips poly-DL-ornithine/laminin-coated. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 מ&quot;מ מקום עגולים coverslips וורנר (מכשירים) בחלק התחתון של צלחת של 24 באר. ממיסים 25 פולי-DL-ornithine (Sigma-Aldrich) ב 25 מ&quot;ג מ&quot;ל מים סטריליים, מזוקקים פעמיים (ד 2 H 2 O) כדי להשיג פתרון המניות 10X (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל). כאשר מוכן לשימוש, לבצע דילול 1/10 של פולי-DL-ornithine עם ד 2 H 2 O להשיג concentמנה של 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. הוסף 0.5 מ&quot;ל היטב כל צלחת 24 הבאר דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת (יום בידול 6), aspirate פולי-DL-ornithine ולתת את צלחות תלושי חיפוי אווירי יבשה מכסה המנוע בתרבית רקמה. שוטפים את בארות צלחת עם D 2 H 2 O שלוש פעמים. תנו אוויר יבש עוד שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1 מ&quot;ג העכבר laminin (Millipore) ב 5 מ&quot;ל של קר, קר 1X PBS לעשות פתרון המניות 100x (200 מיקרוגרם / מ&quot;ל). כאשר מוכן לשימוש, להפוך את 1/100 דילול ב קר קר 1X PBS (2 מיקרוגרם laminin / ml). הוסף 0.5 מ&quot;ל / גם בצלחת 24 גם וגם דגירה של 4 מעלות צלזיוס למשך לילה. לפני זריעת תאים, laminin עודף יש להסיר בארות שטפה עם 1x PBS פעמיים. Coverslips ניתן לאחסן MND בינוני (0.5 מ&quot;ל / טוב). </li></ol> 5. שלב 5: התארכות אקסון (תזמון: 2 ימים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום בידול 7, לאסוף EBS לתוך צינור 15 מ&quot;ל ולאפשר EBS להתיישב (כ -3 דקות). Aspirate התקשורת מחדש שלuspend EBS ב PBS. אפשר EBS להתיישב ואחר כך לשאוב PBS. חזור על פעולה זו 3 פעמים. הוסף 1 מ&quot;ל של Accumax (Millipore) כדי EBS, בעדינות לערבב דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז לשאוב Accumax עודף המכסה את EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתק את EBS, להוסיף 3 מ&quot;ל של מדיום MND. Pipet למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות 1 מ&quot;ל Eppendorf micropipette (כחול בקצה) כדי לשבש את EBS. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את ההשעיה התא צינור 12x75 מ&quot;מ עם תא מסננת שוק (BD פלקון) לקבל השעיה תא בודד. חזור על פעולה זו דיסוציאציה עם גושים ותאים הנותרים שמרו על מסנן כדי להעשיר את התשואה של תאים בודדים. ההשעיה הסופי תא בודד יהיה 6 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות מערבבים את ההשעיה תא בודד ולספור תאים באמצעות hemocytometer. לדלל את התאים לתוך MND בינוני (בתוספת 10 ng / ml של כל BDNF, GDNF, CNTF, ו NT-3) לצפיפות של 2x10 5 תאים לכל מיליליטר. הוסף ההשעיה התא (0.5 מ&quot;ל / טוב) ל 24 גם צלחות המכילות poly-DL-ornithine/laminin coverslips מצופים (שהוכן קודם לכן כמתואר לעיל). התאים הבדיל להאריך neurites זמן רב לאחר 2 ימי תרבות (1D איור). </li></ol> 6. נציג תוצאות איור 1 א מציג את קווי המתאר של הפרוטוקול. בשלב 1, תאים MES מעובדות על PMEF שיושלם עם LiF למנוע התמיינות ספונטנית. באופן כללי, שלא עברו התמיינות מושבות MES עגולות קומפקטית, הגדירו באופן ברור הקצוות. המושבות אינם בקשר זה עם זה. בדרך כלל, בתאי MES יש פיצול ביחס של 1:4 כל 2 ~ 3 ימים. עם זאת, כל שורה התא היחיד יגדל בקצב שונה יחס הפיצול צריכה להיקבע באופן אמפירי. החצים מצביעים על תרשים 1 ב את המראה האופייני של תאים MES לאחר culturing על שכבת מזין PMEF במשך 3 ימים. מושבות אלה הן גדולות (50-100 מיקרומטר קוטר), אך עדיין לשמור על היתרון עגול מוגדרs. בשלב זה המושבות מוכנים בידול או תת. ראש חץ ב 1B איור מראה המושבה הקטנה MES, כי אתה בדרך כלל למצוא 24 שעות לאחר ציפוי. ארבעה ימים לאחר ציפוי, תאים MES להיות מגודל. הם מראים מראה שטוח ואובדן גבולות מוגדרים, המעיד על כך שהם מתחילים להבחין. תאים אלה אינם אופטימליים עבור בידול לתאים עצביים. להבדיל תאים MES אל הנוירונים המוטוריים, תאים MES צריך לטפח בתנאי ההשעיה כדי לאפשר היווצרות EB. בשלב 2, בתאי גזע עובריים מועברים על גבי משטח תרבות ללא שכבת מזין לקדם הקמת EB. בשלב זה, הם מודגרות במדיום בידול עצבית להשלים עם ספלון, bFGF, ו FGF-8 ל -2 ימים לתאי ישירים שושלת עצבית. קטן EBS ניתן לראות תחת מיקרוסקופ על יום 1 של בידול. הם צריכים להיות מרחפת בתווך. שריד PMEF ניתן למצוא גם ביום 1בידול ויש להסירו. תאים אלה לדבוק מנות חיידקים כך בוטלו כאשר EBS הם passaged לצלחת חיידקי חדש. לפיכך, ביום 2 של בידול, PMEF מעטים, אם בכלל יש לראות בכלי התרבות. בשלב 3, המשיך העברת EBS על מנות חדשות להבטיח הסרת PMEF כל הנותר. EBS מתורבתים במנוע נוירונים (MND) התקשורת בידול השלימו עם RA ו לשקוע במשך 5 ימים כדי לבדל את התאים לתוך הנוירונים המוטוריים. במהלך התרבות, EBS ממשיכים לגדול בגודל שניתן לראות בעין בלתי מזוינת ביום בידול 3 ~ 4. איור 1 ג מראה מראה מיקרוסקופית של EBS ביום בידול 7. שלא כמו תאים שלא עברו התמיינות, EBS להראות הקרינה חזקה בשל הביטוי של ה-GFP. EBS אלה מובחנים בצורה אופטימלית והם מוכנים דיסוציאציה. Cytometry זרימת הראה כי 51% ± 0.8% מכלל התאים של EBS ניתק לא הבדיל את ה-GFP לבטא בתאי 5. ב 5 אחר צעד, תרבות הדרום הנוירונים המוטוריים בנוכחות GDNF, CNTF, BDNF, ו NT3 תוצאות הרחבה של תחזיות axonal ארוכים. 1D איור מראה את המראה של תאים הבדיל 2 ימים לאחר ציפוי של EBS ניתק. הערה neurites ארוכות המשתרעות על גופי התא של התאים המצופים. מכתים Immunofluorescent עולה כי + תאים GFP לבטא את הסמן פאן העצבית (neurofilament בינוני שרשרת) ושני מנועי סמנים נוירונים ספציפיים (איילט-1 ו כולין acetyltransferase, איור 2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> באיור 1. התמיינות של תאים MES אל הנוירונים המוטוריים (תמונה שונה מ וו et al. 5). א) תוכנית לפרוטוקול התמיינות מתאי MES אל הנוירונים המוטוריים. ב) שלא עברו התמיינות תאים MES ליצור מושבות עגולות על גבי שכבת מזין פיברובלסטים. יש להם ביטוי של GFP חלש. ג) תאים MES הופרדו שכבות מזין cultuאדום נמוך מצורפים כלים ליצירת EBS. במהלך היומיים הראשונים של תהליך התמיינות, התאים נחשפו 50 ng / ml noggin, 20 ng / ml bFGF, ו 20 ng / ml FGF-8. לאחר מכן, הם גרמו להבדיל עם חומצה רטינואית 1 מיקרומטר ו 1 מיקרומטר סוניק הקיפוד SAG אגוניסט במשך 5 ימים. הבדיל תאים MES הביע GFP הקרינה חזקה. ד) לאחר התמיינות 7 ימים, היו EBS ניתק והוא מצופה בלוחות מצופים poly-DL-ornithine/laminin. התאים הבדיל הוארך תהליכים עצביים ארוכים אחרי 2 ימים בתרבות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. MN = נוירון מוטורי. B, C ו-D הם תמונות שדה בהירים ב &#39;, ג&#39;ו - ד&#39; הם תמונות הקרינה המתאימים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> איור 2. אפיון MES תא הנגזרות הנוירונים המוטוריים. מכתים immunofluorescence לרשת neurofilament בינוני (NF-M, אדום), דברו (אדום), ואת איילט-1 (אדום) היה ביחד עם ה-GFP (ירוק) expression. DAPI (כחול) היה בשימוש כדי לזהות את הגרעינים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.

<ol>
	<li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li><li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li><li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons.">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li><li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies,+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery.">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li><li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25 (2011).</li><li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite.">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li><li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo.">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li><li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers.">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li><li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened.">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li><li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity.">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li><li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain.">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

איכות התאים MES הוא הפרמטר הקריטי ביותר עבור הדור יעיל של הנוירונים המוטוריים. תאים MES יש לטפח על PMEF למנוע התמיינות ספונטנית. תוספת של LiF מסייע לשמור על התאים MES במדינה מובחן. ככל שהתאים מתחלקים MES כל 12-15 שעות, בינוני התרבות הופכת תיגמר במהירות יש להחליף מדי יום. <p class="jove...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF בינוני </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES בינוני </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cell מוסמך FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> לא חיוניות חומצות אמינו </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> נוקלאוזידים </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LiF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> בידול עצבית בינוני </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES פולחן FBS </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> לא חיוניות חומצות אמינו </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> מונו thio גליצרול </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mm </td></tr><tr><td> Noggin </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND בינוני (בידול) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-פולחן בינוני בסל </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> נוק אאוט סרום החלפת </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 תוספת </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS מוסף-B </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0.15% ב ד 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 07159 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> הפרין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב ד 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Retinoic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 מיקרומטר </td></tr><tr><td> לשקוע </td><td> EMD כימיקלים </td><td> 566660 </td><td> 1 מיקרומטר </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND בינוני (Motor Neuron תרבות) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-פולחן בינוני בסל </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> נוק אאוט סרום החלפת </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 תוספת </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS מוסף-B </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> חומצה אסקורבית </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0.15% ב ד 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemCטו טכנולוגיות </td><td> 07159 </td><td> 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל </td></tr><tr><td> הפרין </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב ד 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> מחקר ופיתוח מערכות </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = ללא רלוונטי. טבלה 1. PMEF ומדיה של תרבית תאים MES או בידול. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> &lt;&gt; שם חזק של מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ריכוז סופי </td></tr><tr><td> לטין 0.1% </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornithine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב ד 2 H 2 O </td></tr><tr><td> עכבר laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ב PBS </td></tr><tr><td> 0.25% טריפסין / EDTA </td><td> StemCell טכנולוגיות </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = ללא רלוונטי. טבלה 2. ריאגנטים עבור ציפוי דיסוציאציה.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

בידול ישירה של גזע עובריים (ES) תאים לתוך תפקודית הנוירונים המוטוריים מהווה משאב מבטיח ללמוד את מנגנוני המחלה, לסנן חומרים תרופתיים חדשים, ולפתח טיפולים חדשים למחלות עצב מוטוריים כגון ניוון שרירים (SMA) וטרשת לרוחב amyotrophic ( ALS). פרוטוקולים רבים כיום להשתמש בשילוב של חומצה רטינואית (RA) ו סוניק הקיפוד (ששש) להבדיל עכבר גזע עובריים (MES) התאים לתוך המנוע נוירונים 1-4. עם זאת, יעילות התמיינות של תאים MES לתוך המנוע נוירונים נפגש רק עם הצלחה בינונית. פיתחנו פרוטוקול שני שלבים 5 בידול זה משפר באופן משמעותי את יעילות בידול לעומת פרוטוקולים שהוקמו זמינה. הצעד הראשון הוא לשפר את תהליך neuralization ידי הוספת noggin צמיחה גורמים פיברובלסטים (FGFs). Noggin הוא המוךפו&quot;גנטי שהולך העצם חלבון (BMP) יריבו, והוא מעורב אינדוקציה עצביתccording מודל ברירת המחדל של neurogenesis ותוצאות בהיווצרותה של דפוסים עצביים הקדמי 6. FGF איתות פועל בסינרגיה עם ספלון של גרימת היווצרות רקמה עצבית באמצעות קידום הזהות עצבית האחורי 7-9. בשלב זה, התאים MES היו טעונים עם ספלון, bFGF, ו FGF-8 למשך יומיים כדי לקדם את הבידול כלפי שושלות עצביים. הצעד השני הוא לגרום מפרט המנוע נוירון. Noggin / FGFs נחשפו תאים MES היו מודגרות עם RA ו אגוניסט ששש, אגוניסט והחליק (SAG), למשך 5 ימים כדי להקל על הדור נוירון מוטורי. כדי לפקח על בידול של בלגן בתוך הנוירונים המוטוריים, השתמשנו בתא ES קו נגזר eGFP עכבר מהונדס המבטא בשליטת היזם המנוע נוירון מסוים Hb9 1. שימוש בפרוטוקול חזקה, השגנו 51 ± 0.8% של יעילות בידול (n = 3, p &lt;0.01, של סטודנטים מבחן t) 5. תוצאות immunofluorescentמכתים הראו כי ה-GFP בתאים + לבטא את הנוירונים המוטוריים סמנים ספציפיים, איילט-1 ו כולין acetyltransferase (צ&#39;אט). פרוטוקול שני שלבים שלנו בידול מספק דרך יעילה להבחין בתאי MES אל הנוירונים המוטוריים השדרה.

Watch this Scientific Journal Video about Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons at JoVE.com

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Views.  Alfred I. duPont Hospital for Children. פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.

Video: Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

הכנת עובריים של עכברים תאים פיברובלסטים מתאים האדם culturing תאים עובריים pluripotent המושרה בתאי גזע

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

זיהום retroviral של Murine גזע עוברי תאי Embryoid גוף תא נגזר לניתוח של בידול המטופואטיות

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...