본 원고는 2011년 5월 26일 일에 돌아가셨 박사 Wenlan 왕의 기억에 전념하고 있습니다. 우리는 넉넉한 본 연구에 사용된 HBG3 MES 세포를 제공해 주셔서 박사 더글러스 A. 커 감사드립니다. 이 작품은 Nemours 추진하는 사업, 연구 자원을위한 국립 센터 (NCRR)을 위해 센터를 지원하는 NCRR에서 코브레 기금 수상 (5 P20 RR020173-05)의 INBRE 프로그램하에 부여 (2 RR016472-10) 어린이, 윌밍턴, 델라웨어, 미국의 알프레드 나 듀폰 병원 소아 연구.

1. 1 단계 : 마우스 배아 줄기 (MES) 세포 배양 (타이밍 : 3 일) 1. 도금 주 태아의 마우스 섬유아 세포 (PMEF) <ol><li> PMEF 부착을위한 젤라틴과 코트 넷 100-mm 조직 문화 요리. 각각의 접시에 0.1 % 젤라틴 용액 (StemCell 기술) 8 ML을 추가하고 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 요리에서 젤라틴 초과를 제거합니다. 요리 린스하지 마십시오. </li><li> 약 포함되어 있습니다 Mitomycin C-inactivated PMEF (Millipore) 중 하나 병을 희석. 5 X 10 6 PMEF 미디어의 40 ML로 셀 (표 1의 제조법 참조)과 네 개의 100 mm 조직 배양 요리 진입 판. PMEF는 MES 전지 피더 레이어를 제공합니다. </li><li> PMEF는 MES 셀 문화를 추가하기 전에 적어도 하루 도금해야한다. PMEF은 도금 후 1 주일까지 사용할 수 있습니다. </li></ol> 2. 도금 MES 셀 모터 뉴런으로 MES 세포 분화의 효율성을 모니터링하려면우리는 HBG3, 모터 뉴런 특정 발기인 Hb9의 통제하에 eGFP을 표현 형질 전환 생쥐에서 파생 ES 세포주를 사용했습니다. <ol><li> 서리를 없애다 37 ° C 물 목욕에 HBG3 MES 세포 중 1 개의 유리병 (약 1 × 10 7, 박사 더글라스 커, 존스 홉킨스 대학에 의해 기여). 15 ML 관에서 ES 미디어 (표 1에서 제조법 참조) 5 ML을 추가하고 5 분 800 rpm으로 세포를 다운 스핀. </li><li> 10 NG / ML의 최종 농도에서 갓 추가한 백혈병 억제 인자 (난생)와 ES 미디어 20 ML의 대기음 뜨는 및 resuspend MES 세포. 참고 : 난생는 이용 당일에 추가되어야하며 undifferentiated 상태에서 MES의 세포를 유지하기 위해 필요합니다. </li><li> 각 접시에 PMEF에서 10 ML PMEF 미디어를 제거하고 각 접시에 HBG3 ES 세포 현탁액의 10 ML에 추가합니다. </li><li> 24 H 도금 후, MES 세포의 크기는 그림 1B에 화살촉으로 표시 식민지와 비슷한 작은 식민지를 형성하고 있습니다. 도금 후 72 H, coloni크기 일이야 증가, 많은 지름이 약 100 μm의 (그림 1B, 화살표로 표시)되고. 이러한 세포는 차별 화를위한 준비가되어 있습니다. 미디어는 세포 증식을 유지하기 위해 매일 교체해야합니다. </li></ol> 2. 2 단계 : 신경 유도 (타이밍 : 2 일) 모터 뉴런으로 MES 세포의 분화를 유도하기 위해 MES 전지 PMEF에서 분리 및 서스펜션 환경에서 재배해야합니다. 젤라틴 코팅 flasks는 MES 세포에서 PMEF를 구분하는 데 사용됩니다. <ol><li> MES의 식민지가 신경 유도 (차별화 당일 0으로 정의), 실온에서 30 분에 대해 0.1 % 젤라틴 (18 ML / 술병)와 코트 2 T150 flasks을위한 준비 후 초과 젤라틴을 제거하고 1X PBS 세 번 함께 씻어 때. 참고 : 각 100 mm 음식 문화는 PMEF을 분리 하나 T150-젤라틴 코팅 플라스크가 필요합니다. </li><li> 조심스럽게 느슨하게 연결된 식민지를 이동시키다 않도록하고, 열망하여 미디어를 제거합니다. 10 ML PBS의 간단한 추가기껏해야 그리고 세차 단계를 완료하기 위해 흡인하여 제거합니다. </li><li> PMEF에서 MES 전지를 분리하려면, 0.25 %를 추가 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (3 ML / 요리 StemCell 기술)와 37에서 3-5 분 동안 품어 ° C를 줄기 세포와 PMEF는 접시에서 분리까지. 식민지를 (15-20 번) 부수 다운 난생와 pipet 전지없이 15 ML 신선한 ES 미디어를 추가합니다. 그런 다음, 0.1 % 젤라틴 코팅 T150 플라스크에 추가할 37시 30 분 동안 품어 ° C. ES 세포가 떠 있어야하면서 부화 후 PMEF는 gelatinized 표면에 부착해야합니다. 50 ML 튜브에 떠있는 MES 세포를 수집합니다. </li><li> (표 1에서 제조법 참조) 신경 분화 매체의 10 ML 800 RPM과 resuspend 세포에서 내려 봐. </li><li> 100 mm 세균이나 서스펜션 배양 접시에 hemocytometer 후 접시에 약 2 × 10 6 MES 세포를 사용하여 세포를 세어보세요. 이 번호판은 서스펜션 문화의 성장을 허용하고 embryoid 기관 (EBS)의 형성을 촉진. </li><li> differentia에서기 하루 1, MES 전지는 빛을 현미경으로 볼 수있는 작은 부동 집계 (EBS)를 형성하고 있습니다. 모든 carryover PMEF는 요리에 첨부해 주시기 바랍니다. 3 분위한 저속 (500 RPM)에서 15 ML 튜브와 원심 분리기에 현탁액 세포와 미디어를 전송합니다. 신중하게 미디어를 대기음, 새로운 세균 접시에 접시에 세포 후 pelleted EBS에 신선한 신경 분화 매체의 10 ML을 추가합니다. 미디어를 replenishing 이외에이 단계는 이전 단계에서 이월 어떠한 PMEF를 제거합니다. </li><li> 차별 하루 2, EBS는 운동 뉴런에 시달릴 수도 준비가 된 것입니다. </li></ol> 3. 3 단계 : 모터 뉴런 사양 (타이밍 : 5 일) <ol><li> 차별 하루 2, 소용돌이 문화 접시를하고 15 ML 관으로 미디어와 EBS를 전송에. EBS 중력 (~ 10 분)에 의해 또는 3 분 저속 (500 RPM)에서 원심 분리하여 정착하자. </li><li> (제조법을 볼에서 모터 신경 세포의 분화의 10 ML (국방부) 중간에 신중하고 resuspend EBS 미디어를 기음 <strong&gt; 표 1). 플레이트 새로운 세균 접시에있는 EBS와 5 일 동안 매일 미디어를 변경합니다. </li><li> 직경 200 μm의 강력한 GFP 신호 (그림 1C)을 표현한다 - 차별화의 날 7 일에 EBS가 약 150이어야합니다. 이러한 EBS는 코팅 요리 또는 coverslips을 poly-DL-ornithine/laminin에 dissociated 및 도금이 될 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. 4 단계 : Poly-DL-ornithine/laminin 코팅 Coverslips의 작성 (타이밍 : 2 일) 이틀 EBS를 dissociating 전에 (차별화의 날 5 예), poly-DL-ornithine/laminin-coated coverslips를 준비합니다. <ol><li> 24 잘 접시의 바닥에 장소 12 mm 원형 coverslips (워너 인 스트 루먼트). 10X 주식 솔루션 (1 밀리그램 / ML)을 구하는 25 MG 25 ML의 폴리-DL-ornithine (시그마 - 올드 리치) 멸균, 이중 증류수 (D 2 H 2 O)를 해산. 때 사용할 준비 concent를 얻을 D 2 H 2 O와 폴리-DL-ornithine의 10분의 1 희석하다100 μg / ML의 배급. 하룻밤 동안 4에 24 잘 판과 부화 각각 잘 ° C에서 0.5 ML을 추가합니다. </li><li> 다음날 (차별화의 날 6), 기음 폴리-DL-ornithine하고 조직 문화 후드에 접시와 건조 커버 전표 공기 봅시다. D 2 H 2 O를 세 번 같이 판 우물을 씻어. 한 시간 동안 공기 건조 구. </li><li> 100x 주식 용액 (200 μg / ML)를 만들기 위해 아이스처럼 차가운 1X PBS의 5 ML에 1 밀리그램 마우스 laminin (Millipore)를 해산. 때 사용할 준비 아이스처럼 차가운 1X PBS (2 μg laminin / ML)의 100분의 1 희석을합니다. 0.5 ML 추가 / 음 4 24 잘 판과 부화에 ° C에서 하룻밤을위한. 시딩 세포하기 전에 과잉 laminin은 제거하고 우​​물은 1X PBS로 두 번 씻어서해야합니다. Coverslips은 국방부 중형 (0.5 ML / 음)에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 5. 5 단계 : 축삭의 신장 (타이밍 : 2 일) <ol><li> 차별화의 날 7 일에 15 ML 관으로 EBS를 수집하고 EBS가 (약 3 분) 정착하실 수 있습니다. 기음 미디어와 다시의PBS의 uspend EBS. EBS가 정착 후 PBS를 대기음하도록 허용합니다. 이 단계를 3 번​​씩 반복합니다. 부드럽게 믹스 앤 실온에서 5 분 동안 품어, EBS에 Accumax (Millipore) 1 ML을 추가합니다. 그렇다면 EBS를 덮고 초과 Accumax을 기음. </li><li> EBS를 떼어 놓다하려면 국방부 매체 3 ML을 추가합니다. EBS를 방해하는 한 ML Eppendorf micropipette (파란색 팁)을 사용 Pipet 위아래로 20 회. 상온에서 2 분 동안 품어. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 셀 스트레이너 뚜껑 (BD 팔콘)로 12x75 mm 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 단일 세포의 수율을 풍요롭게하는만큼 필터에 의해 보관 남은 대단히 짧은 시간과 세포이 분리 단계를 반복합니다. 최종 단일 세포 현탁액 6 ML 될 것입니다. </li><li> 살살이 단일 세포 현탁액을 혼합하고 hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. ML 당 2x10 5 세포 밀도에 국방부 매체 (10 각 BDNF의 NG / ML, GDNF, CNTF, 및 NT-3과 보충)로 세포를 희석. PO를 포함하는 24도 접시에 세포 현탁액을 (0.5 ML / 잘) 추가ly-DL-ornithine/laminin 코팅 coverslips (위에서 설명한대로 이전 준비). 차별화된 세포는 문화 2 일 (그림 1D) 이후 오랜 neurites을 확장. </li></ol> 6. 대표 결과 그림 1A는 프로토콜의 개요를 보여줍니다. 1 단계에서 MES 전지 PMEF에서 재배되며 자발적인 차별을 방지하기 위해 난생으로 보충. 일반적으로 undifferentiated MES의 식민지는 원형 및 소형이고, 명확하게 가장자리를 정의했습니다. 식민지는 서로 연락을하지 않습니다. 일반적으로, MES 세포는 매 2 ~ 3 일 1시 4분 비율로 분할해야합니다. 그러나 각 개별 셀 라인은 서로 다른 속도로 성장할 것이며, 분할 비율은 경험적으로 결정되어야합니다. 그림 1B에있는 화살표는 3 일 동안 PMEF 피더 계층에 culturing 후 MES 세포의 전형적인 모양을 나타냅니다. 이러한 식민지가 큰 (직경 50-100 μm의)하지만, 여전히 원형과 정의 우위를 유지의. 이 단계에서는 식민지는 차별이나 subculture에 대한 준비가되어 있습니다. 그림 1B의 화살촉은 일반적으로 도금 후 24 H를 찾을 수있는 작은 MES들의 서식지를 보여줍니다. 도금 후 4 일이, MES 전지는 크게 자란된다. 그들은 차별화하기 시작되었는지 나타내는 평평 외관 및 정의된 경계의 손실을 보여줍니다. 이러한 세포의 연결을 세포로 분화에는 최적화되어 있지 않습니다. 모터 뉴런으로 MES 세포를 차별화하기 위해 MES 전지 EB 형성을 허용하도록 서스펜션 조건에서 재배해야합니다. 2 단계에서 ES 세포는 EB 형성을 촉진하기위한 피더 레이어없이 문화 표면에 전송됩니다. 이 단계에서 그들은 신경 혈통에 대한 직접적인 세포 ~ 2 일 동안 소량, bFGF, 그리고 FGF-8과 보충 신경 분화 매체에 incubated됩니다. 작은 EBS는 차별화의 일 1시 현미경으로 관찰할 수있다. 그들은 중간에 떠 있어야합니다. Carryover PMEF는 1 일에서 찾을 수 있습니다분화 및 제거해야합니다. 이러한 세포는 EBS가 새로운 세균 접시에 passaged 때 이렇게 제거되는 세균 요리에 충실. 따라서 분화의 일 2에 의해 몇 없거나 전혀 PMEF가 문화 접시에 볼 수 있습니다. 3 단계에서 새로운 요리에 대한 EBS의 양도 어느 남아 PMEF의 제거를 보장해야 계속했다. EBS가 RA로 보충 모터 신경 세포의 분화 (국방부) 미디어 배양해 및 모터 뉴런으로 세포를 차별화하는 데 5 일째 처짐됩니다. 문화 동안 EBS 크기가 계속해서 성장과 분화의 날 3시 육안으로 볼 수 있습니다 ~ 4. 그림 1C는 차별화 당일 7 EBS의 미세한 모양을 보여줍니다. undifferentiated 세포와는 달리, EBS는 GFP의 표현으로 인해 강한 형광을 보여줍니다. 이러한 EBS는 최적 차별하고 분열을위한 준비가되어 있습니다. 유동세포계측법 51 % ± dissociated EBS에서 세포의 0.8 %는 세포에게 5 표현 GFP로 구분 것을 보여주었다. 단계 5 회 문화에GDNF, CNTF, BDNF, 그리고 긴 axonal 계획안의 확장 NT3 결과의 앞에서 ESE 모터 뉴런 있습니다. 그림 1D 2 일 dissociated EBS의 도금 후 차별화된 세포의 모양을 보여줍니다. 도금 세포 세포 기관에서 연장 긴 neurites를 적어 둡니다. Immunofluorescent 염색법은 GFP + 세포가 팬 -의 연결 마커 (neurofilament - 중간 체인) 두 개의 모터 뉴런 특정 마커 (섬-1과 콜린 acetyltransferase, 그림 2)을 표현하는 것을 보여줍니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> 그림 1. 모터 뉴런 (사진 우 외에서 수정했습니다. 5)으로 MES 세포의 분화. MES 세포에서 모터 뉴런으로 분화 프로토콜의) 제도. B) Undifferentiated MES 세포는 fibroblast 피더 레이어의 상단에 둥근 식민지를 형성하고 있습니다. 그들은 약한 GFP 식을 있습니다. C) MES 전지는 피더 레이어와 cultu에서 분리되었다EBS를 형성 낮은 첨부 요리에 빨강. 분화 과정의 첫 두 일 동안 세포 50 NG / ML의 소량, 20 NG / ML bFGF, 20 NG / ML FGF-8에 노출되었다. 그 후, 그들은 1 μm의 retinoic 산성, 5 일 동안 1 μm의 소닉 고슴도치 작용제의 처지와 차별화하는 유도했다. 차별화된 MES 전지는 강한 GFP의 형광을 표명했다. D) 7 일간 분화 후, EBS는 poly-DL-ornithine/laminin 코팅 접시에 dissociated 및 도금했다. 차별화된 세포는 문화의 2 일 후에 긴 신경 프로세스를 확장. 스케일 막대 = 200 μm의. 미네소타 = 모터 신경 세포. B, C와 D는 명시야 이미지이며, B &#39;, C&#39;와 D &#39;에 해당하는 형광 이미지입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> 그림 2. MES 셀 - 파생 모터 뉴런의 특성화. neurofilament 매체 체인 (NF-M, 빨강), 채팅 (적색), 그리고 섬-1 (빨간색)에 대한 Immunofluorescence 염색법은 GFP (녹색) expr과 일치했습니다ession. DAPI는 (파란색) 핵을 식별하는 데 사용되었다. 스케일 막대 = 50 μm의.

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관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

MES 세포의 품질은 모터 뉴런의 효율적인 생성을위한 가장 중요한 매개 변수입니다. MES 전지는 자발적인 차별을 방지하기 위해 PMEF에서 재배되어야한다. 난생의 추가가 undifferentiated 상태에서 MES 세포를 유지하는 데 도움이됩니다. MES 세포마다 12-15 H를, 분열적으로 문화 매체가 급속히 고갈되고 매일 교체해야합니다. 쉬 경로의 효율적인 활성화 운동 신경 세포 사양을 유발하?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell 기술 </td><td> 36,250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES 세포 - 공인 FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> Nucleosides </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 난생 </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 신경 분화 매체 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell 기술 </td><td> 36,250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES 컬트 FBS </td><td> StemCell 기술 </td><td> 06,905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> 비 필수 아미노산 </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 모노-thio의 글리세롤 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> 소량 </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 NG / ML </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 NG / ML </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 국방부 매체 (차별) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-컬트 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 마네 혈청 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> ITS 보충-B </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,155 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,157 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O의 0.15 % </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,159 </td><td> 5 μg / ML </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H3149 </td><td> D 2 20 μg / ML H 2 O </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> Retinoic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> R-2625 </td><td> 1 μm의 </td></tr><tr><td> 처짐 </td><td> EMD 화학 </td><td> 566,660 </td><td> 1 μm의 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 국방부 매체 (모터 뉴런의 문화) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-컬트 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 마네 혈청 교체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 보충 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> ITS 보충-B </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,155 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,157 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> GlutaMax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1퍼센트 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 O의 0.15 % </td></tr><tr><td> Fibronectin </td><td> StemC내말이 맞지 기술 </td><td> 07,159 </td><td> 5 μg / ML </td></tr><tr><td> 헤파린 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> H3149 </td><td> D 2 20 μg / ML H 2 O </td></tr><tr><td> β-메르 캅 토 에탄올 </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0.1 MM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D 시스템 </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 NG / ML </td></tr></tbody></table> NA = 비 적용됩니다. 표 1. MES의 세포 배양이나 차별에 대한 PMEF와 미디어. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;시약의 강력한&gt; 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 최종 농도 </td></tr><tr><td> 젤라틴 0.1 % </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> 폴리-DL-ornithine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P0421 </td><td> D에 0.1 밀리그램 / ML 2 H 2 O </td></tr><tr><td> 마우스 laminin </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 μg / PBS에서 ML </td></tr><tr><td> 0.25 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> StemCell 기술 </td><td> 07,901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = 비 적용됩니다. 표 2. 코팅 및 분리를위한 시약.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

기능성 모터 뉴런으로 배아 줄기 (ES) 세포의 직접 분화는 질병 메커니즘을 공부하는 신약 화합물을 선별, 그러한 척수 근육 위축증 (SMA)과 루게릭병 (같은 운동 신경 세포 질환에 대한 새로운 치료법을 개발 유망 자원을 나타냅니다 ALS). 많은 현재의 프로토콜은 모터 뉴런 1-4로 마우스 배아 줄기 (MES) 세포를 차별화하는 retinoic 산성 (RA)와 소닉 고슴도치 (쉬)의 조합을 사용합니다. 그러나, 모터 뉴런에 MES 세포의 분화 효율은 어느 정도 성공을 만났다있다. 우리는 크게 현재 설립 프로토콜에 비해 분화 효율을 향상시키는 두 단계의 분화 프로토콜 5 개발했습니다. 첫 번째 단계는 머리와 fibroblast의 성장 요인 (FGFs)를 추가하여 neuralization 과정을 강화하는 것입니다. 소량은 뼈 morphogenetic 단백질 (BMP) 길항제이며 신경 유도에 연루되어neurogenesis와 앞부분은 신경 patterning 6 형성의 결과의 기본 모델 ccording. FGF 신호는 사후 신경 정체성 7-9를 홍보하여 신경 조직 형성을 유도에서 소량으로 synergistically 역할을합니다. 이 단계에서는 MES 세포는 신경 lineages쪽으로 분화를 촉진하기 위해 이틀 동안 소량, bFGF, 그리고 FGF-8로 끝났다되었다. 두 번째 단계는 모터 신경 세포 명세를 유도하는 것입니다. 소량 / MES 세포를 노출 FGFs는 모터 신경 세포 생성을 촉진하기 위하여 앞으로 5 일 동안 RA와 쉬 작용제, Smoothened 작용제 (처짐)로 incubated했다. 모터 뉴런으로 혼란의 분화를 모니터링하기 위해, 우리는 모터 신경 세포 특정 발기인 Hb9 1의 제어하에 유전자 변형 마우스를 표현 eGFP에서 파생 ES 세포주를 사용했습니다. 이 강력한 프로토콜을 사용하여, 우리는 ± 분화 효율 0.8 %를 51 달성 (N = 3, P &lt;0.01, 학생의 T-테스트) 5. immunofluorescent의 결과염색법은 GFP + 세포가 운동 신경 세포 특정 마커, 섬-1과 acetyltransferase 콜린을 (채팅) 표현하는 것으로 나타났다. 우리 두 단계의 차별화 프로토콜은 척추 운동 뉴런으로 MES 세포를 차별화하기위한 효율적인 방법을 제공합니다.

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.1K 조회수.  Alfred I. duPont Hospital for Children. 우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murine 배아 줄기 세포로부터 조혈 줄기 세포의 유도

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

연구

생물학

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

공중 드롭 방법을 사용하여 마우스 배아 줄기 (MES) 세포의 체외 차별에

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

절연 및 마우스 배아 새싹 세포의 유도

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Multititre 판 형식으로 인간 만능의 줄기 세포에서 뉴런의 신속하고 효율적인 생성

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...