Work was funded by a Development and Promotion of Science and Technology scholarship from the Thai Ministry for Education to W.W. and grants from Tenovus and the Anonymous Trust to M.P.S.

1. Preparación de Medios NOTA: El protocolo se basa en el uso de una mezcla de dos por separado medios de comunicación: DMEM / F12 suplementado con suplemento N2 modificado y Neurobasal suplementado con suplemento B27, típicamente en una relación 1: 1. <ol><li> Preparar el suplemento N2 modificado por mezcla de los componentes en un tubo de 15 ml. No vórtice o filtrar esto; mezclar invirtiendo el tubo hasta que la solución es clara. <ol><li> Comience con la pipeta 7,2 ml de DMEM / F12, a continuación, añadir 1 ml de 25 mg / ml de insulina (compuesto en HCl 0,01 M) y mezclar bien invirtiendo el tubo. Se tarda un par de minutos hasta que la solución es clara. </li><li> Añadir 1 ml de 100 mg / ml, apo-transferrina (compuesto en agua), 33 l de 0,6 mg / ml progesternone (compuestos en etanol), 100 l de 160 mg / ml (1 M) putrescina (compuesto en el agua ), 10 l de selenito de sodio 3 mM (compuesto en agua) y 666 l de 7,5% de albúmina de suero bovino y mezclar bien el tubo. Alícuota en 2,5 ml y se almacena a -20 °C durante un máximo de 2 meses. </li></ol></li><li> Preparar los medios de comunicación. <ol><li> Para 250 ml de DMEM / F12 añadir 2,5 ml de N2. Mezclar bien pero no sacuda o filtro. </li><li> Para 250 ml de Neurobasal noticias agregar 5 ml de suplemento de B27. Mezclar bien pero no sacuda o filtro. </li><li> Mezclar los medios de comunicación de los pasos 1.2.1 y 1.2.2 en una proporción de 1: 1. En algunos casos una mezcla 1: 3 puede ser necesaria (complementado como la mezcla 1: 1 en el paso 1.2.4). </li><li> Para la mezcla de añadir 0,5 ml de L-glutamina (concentración final 0,2 mM) y 3,5 l de 2-mercaptoetanol (concentración final 0,1 mM) y mezclar bien sin agitación. Almacene el papel a 4 ° C durante un máximo de 3 semanas y evitar la exposición a la luz. Esta mezcla final se llama N2B27. </li></ol></li><li> Preparar la solución de gelatina. <ol><li> Preparar una solución de gelatina al 1% en agua ultrapura y autoclave a 121 ° C, 15 psi, durante 15 min. Es importante que la botella se utiliza para esto es completamente limpio de los detergentes o desinfectantes, por lo que se recomienda que una nueva botella esutilizado para esto y es sólo alguna vez se enjuaga en agua ultrapura entre usos. Alícuota la solución al 1% en 50 ml alícuotas y mantenga a 4 ° C durante meses. </li><li> Calentar una alícuota del 1% de gelatina en un baño de agua a 37 ° C hasta que se disuelva y añadir a 500 ml de solución salina tamponada con fosfato caliente (PBS). Mezclar bien y pipetear suficiente para cubrir el fondo de cada pocillo o placa. Permitir la gelatina para recubrir la superficie de al menos 30 minutos. </li></ol></li></ol> 2. Plating las células NOTA: Este protocolo se aplica igualmente a ESC de ratón cultivadas en 10% de suero con el factor inhibidor de la leucemia (LIF), la sustitución de suero con LIF o medio libre de suero con LIF y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) o inhibidores de MEK y GSK3 (medios 2i) con o sin LIF. Sin embargo, el momento y la eficiencia de la diferenciación pueden variar en función de los medios de comunicación y las células (véase la discusión). Para los experimentos que se muestran aquí utilizamos la línea 46C ratón ESC (que tiene un reportero EGFP noqueó en one de los alelos Sox1 endógenos), que se cultiva en GMEM con 10% de suero y LIF. Para obtener resultados óptimos es importante que las células se disocian y se volvieron a sembrar en los medios N2B27; simplemente cambiando de medios de comunicación de GMEM / suero / LIF a N2B27 siempre resulta en una eficiencia de diferenciación reducida en comparación con resiembra las células. <ol><li> Cultivar las células en GMEM con 10% de suero, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 1x, 0,1 M 2-mercaptoetanol, y 100 unidades / LIF 13 ml. Para conseguir una cultura subconfluente de ratón CES, la placa 1 x 10 6 células en un cultivo en matraz T25 que se llevará a 2-3 días. </li><li> Observar las células bajo el microscopio de campo claro. Cuando las células son subconfluent y listo para pasaje, enjuagarlos dos veces en PBS. Añadir 1 ml de reactivo de disociación de células y volver a la incubadora durante 2 - 5 min. Aunque la tripsina y otras enzimas también pueden ser utilizados para la disociación celular, que pueden tener un impacto negativo en la unión de células de modo que las densidades de chapado tendrán que ser Adjusted. </li><li> Una vez que las células están empezando a levantar de la placa, toque el recipiente para desalojar en una sola suspensión celular. Recoger las células en un total de 10 ml de medios de comunicación y de disociación celular reactivo y pipeta en un tubo de centrífuga de 15 ml. </li><li> Girar las células a 300 xg durante 3 min a TA. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 ml de pre-calentado N2B27 pipeteando arriba y abajo de 3 - 5 veces. Cuando pipeteando la suspensión hacia abajo, pipeta contra el lado del tubo para evitar la creación de burbujas. Contar las células con un contador de células automatizado o un hemocitómetro y registrar la concentración. </li><li> Preparar una suspensión de células que contiene el número deseado de células por unidad de volumen que se plateado por pocillo en pre-calentado N2B27. Una densidad de 10.500 células por cm 2 en una placa de 6 pocillos (es decir, 1 x 10 5 células por pocillo de una placa de 6 pocillos) es óptima. Ver Tabla 1 para sugerido número de células por cm 2 y plavolúmenes de medios ting para una variedad de recipientes de cultivo celular. </li><li> Aspirar la gelatina del recipiente de cultivo y la placa la suspensión celular de acuerdo con la densidad y el volumen sugerido en la Tabla 1. No agitar las placas ya que esto concentrar las células hasta el centro. Coloque las culturas en una incubadora húmeda a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Cambie medios cada 1 - 2 días reemplazando todos los medios de comunicación con N2B27 fresco. Pipeta suavemente como el lavado de las células podría afectar la densidad y disminuir la eficiencia de la diferenciación en los siguientes días. Dónde viabilidad inicial después de la siembra es pobre, la placa de las células en una mezcla 1: 3 de los medios de comunicación N2 y complementados-B27 y cambiarlo a N2B27 después de los dos primeros días. Las células se empiezan a diferenciar y deben mostrar la expresión Sox1 (visible por fluorescencia verde del reportero en la línea celular 46C utilizado aquí) dentro de 4-6 días. </li></ol> 3. La tinción de inmunofluorescencia NOTE: El protocolo se puede aplicar a cualquier tipo de recipiente. El volumen de cada reactivo se describe por pocillo de placa de 6 pocillos y se puede escalar a cualquier superficie. Replating no se recomienda debido a la viabilidad baja después. <ol><li> Quitar medio de diferenciación y fijar las células mediante la adición de 500 l de 4% (v / v) paraformaldehído, dejar durante 15 min. </li><li> Lavar y permeabilizar las células con 2 ml de PBS-T (solución salina tamponada con fosfato con 0,5% (v / v) de Tween-20) dos veces. Las células se pueden mantener en PBS-T para un máximo de 2 meses a 4 ° C. </li><li> Reemplazar PBS-T con 1 ml de PBS-T con 10% (v / v) de suero (de la misma especie que el anticuerpo secundario). Incubar 1 hora en el balancín placa a temperatura ambiente para bloquear cualquier unión no específica. </li><li> Después de 1 hora, se lavan las células dos veces con 2 ml de PBS-T, y se incuban en 500 l de IgG de ratón contra βIII-tubulina (diluido 1: 1000 en PBS-T con 10% de suero). Poner en el plato oscilante, y dejar de O / N a 4 ° C. </li><li> Desde este paso, siempre proteger el buquede la luz. Lavar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia (diluido a 2 g / ml en PBS-T con 10% de suero). Póngalo en la placa oscilante durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Enjuagar las células dos veces con PBS-T, a continuación, añadir 500 l de DAPI (diluido a 0,5 mg / ml en PBS-T) y se deja durante 5 min. </li><li> Lavar las células de nuevo y mantenerlos en PBS-T. Las células están listas para ser fotografiados y se pueden mantener durante un máximo de 2 semanas a 4 ° C. Tenga en cuenta que la señal de las buenas prácticas agrarias se desvanece con el tiempo por lo que es inapropiado comparar la intensidad de las buenas prácticas agrarias de células fijadas y en directo o de células fijadas en diferentes momentos. </li></ol>

<ol>
	<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo-derived+stem+cells:+of+mice+and+men.">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons.">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li><li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons.">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li><li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells.">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture.">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li><li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation.">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li><li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1/2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification.">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li><li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation.">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li><li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition.">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li><li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells:+a+new+ES+cell+regulatory+pathway.">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li><li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice.">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 11836-11841 (2003).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li><li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pluripotency.">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El protocolo de diferenciación neural monocapa ha estado en uso durante más de una década 6. El protocolo es altamente eficiente, compuesto de medio definido, y hecho en un sistema monocapa que hace que el sistema sea más aplicable para preclínica (por ejemplo, detección de drogas) utiliza. Sin embargo, hay algunos factores críticos que determinan la eficiencia de diferenciación. Este artículo señala los factores y la solución para cada obstáculo. Densidad de ...

Las células madre embrionarias son células pluripotentes derivadas de embrión temprano con la capacidad de proliferar indefinidamente in vitro conservando la capacidad de diferenciarse en todos los tipos celulares adulto siguientes reintroducción en un embrión etapa apropiada (mediante la formación de una quimera), la inyección en singénicos o inmunocomprometidos hosts (mediante la formación de un teratoma) o in vitro sujetos a las señales apropiadas 1. La diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en linajes neuronales fue descrita por primera vez en 1995 y consistió en la formación de agregados de suspensión multicelulares (cuerpos embrionarios, EBS) en medios que contienen suero complementado con el ácido retinoico morfógeno 2-4. Desde entonces una variedad de protocolos han sido desarrollados para permitir la diferenciación neural 5. Muchos todavía utilizar la agregación, otros co-cultivo con la inducción de tipos de células y varios implican el uso de medios libres de suero. Todos los protocolos tienen ventajas unasnd desventajas y la naturaleza precisa de neural o células neuronales producidas también varía de acuerdo con el protocolo utilizado. El protocolo ideal sería que robusto, escalable y hacer uso de los medios de comunicación y sustratos completamente definidos, ser susceptibles de monitorización no invasiva del proceso de diferenciación y el resultado en la generación de poblaciones puras de progenitores neurales capaz de ser modelada por las señales externas y para diferenciar en todos los subtipos neuronales y gliales con alta eficiencia y rendimiento en un tiempo relativamente corto. En los últimos doce años hemos estado utilizando un método para generar células progenitoras neuronales y neuronas de ratón CES en una baja densidad, la cultura monocapa adherente sin suero 6-10. Este protocolo cumple muchos de los criterios establecidos anteriormente: en nuestras manos la eficiencia de diferenciación ha sido bastante constante durante muchos años y una variedad de líneas celulares, se puede escalar hacia arriba o hacia abajo (que utilizamos con éxito buques de placas de 96 pocillos a 15 cm de diámetro diella es) y los medios utilizados están bien definidos. El proceso es susceptible de microscopía timelapse para el seguimiento de la diferenciación y una variedad de señales de modelado puede ser añadido para inducir la generación de distintos tipos de subtipos neuronales (por ejemplo, Shh y Fgf8 para las neuronas dopaminérgicas 6). Sin embargo, hay algunos retos para la aplicación exitosa de este protocolo. Uno de los aspectos clave es la preparación cuidadosa de los medios de comunicación. Siempre nos preparamos los medios de comunicación en la empresa a pesar de la disponibilidad de alternativas comerciales. Uno de los suplementos utilizados (N2; véase el Protocolo) tiene modificaciones sobre el estándar versiones disponibles en el mercado. Por último, uno de los pasos más importantes para la aplicación exitosa de este método es la densidad celular óptima en chapado. Esto es principalmente porque mientras que la naturaleza autocrina de una de las señales que inducen (Fgf4 11) requiere que las células están presentes suficientes para permitir viabil óptimadad y la diferenciación, a muy altas densidades de diferenciación se deteriora (posiblemente en parte debido a la producción autocrina de LIF 12). Por ello es importante que la preparación tanto de los medios y chapado celular se realizan con cuidado y consistentemente para asegurar resultados óptimos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11320-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement, serum free</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6634</td>
			<td>Reconstitute with sterile 0.01M HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesterone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8783</td>
			<td>Reconstitute with ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putrescine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium selenite</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5261</td>
			<td>Reconstitute with sterile water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine albumin fraction V</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15260-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>Make sure it is completely dissolved before use as glutamine is usually sedimented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well tissue culture dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential amino acids solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukaemia inhibitory factor</td>
			<td colspan="3">prepared in-house as in Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#8242;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti betaIII tubulin IgG antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>MMS-435P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence-labelled anti-Mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31571</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156367</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture

La capacidad para diferenciar las células madre embrionarias de ratón (ESC) a progenitores neurales permite el estudio de los mecanismos que controlan la especificación neural, así como la generación de tipos de células neuronales maduros para el estudio adicional. En este protocolo se describe un método para la diferenciación de ESC para progenitores neurales utilizando suero libre, la cultura monocapa. El método es escalable, eficaz y resulta en la producción de ~ 70% de células progenitoras neurales dentro de 4 - 6 días. Se puede aplicar a ESC de diversas cepas cultivadas bajo una variedad de condiciones. Progenitores neurales se puede permitir que diferenciar aún más en neuronas funcionales y glía o analizado mediante microscopía, citometría de flujo o técnicas moleculares. El proceso de diferenciación es susceptible de microscopía de lapso de tiempo y se puede combinar con el uso de líneas de reportero para supervisar el proceso de especificación neural. Proporcionamos instrucciones detalladas acerca de la preparación de los medios de comunicación y la optimización de la densidad celular para permitir que el proceso de abe aplica a la mayoría de las líneas de la ESC y una variedad de recipientes de cultivo celular.

En este experimento, se utilizó la línea celular 46C 14, las células madre embrionarias de ratón con un reportero Sox1-GFP endógeno, para rastrear la diferenciación neuronal. Mediante el uso de esta línea celular, la expresión de Sox1, un marcador de progenitor neural, puede ser detectado por fluorescencia verde. Revestimiento de densidad es un factor crítico para lograr la diferenciación neuronal. Las células madre embrionarias de ratón se sembraron en placa de 6 pocillos a diferentes densidades ...

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Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Diferenciación neural de células madre embrionarias de ratón en el suero libre de monocapa Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.0K vistas.  University of Dundee. This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

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Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during embryonic development that also commonly occurs in glioblastoma, the most frequent malignant brain tumor. EMT has also been observed in multiple carcinomas outside the brain including breast cancer, lung cancer, colon cancer, gastric cancer. EMT is centrally linked to malignancy by promoting migration, invasion and metastasis formation. The mechanisms of EMT induction are not fully understood. Here we describe an in vitro system for standardized isolation of cortical neural stem cells (NSCs) and subsequent EMT-induction. This system provides the flexibility to use either single cells or explant culture. In this system, rat or mouse embryonic forebrain NSCs are cultured in a defined medium, devoid of serum and enzymes. The NSCs expressed Olig2 and Sox10, two transcription factors observed in oligodendrocyte precursor cells (OPCs). Using this system, interactions between FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling involving Zeb1, Zeb2, and Twist2 were observed where TGF&#946;-activation significantly enhanced cell migration, suggesting a synergistic BMP-/TGF&#946;-interaction. The results point to a network of FGF-, BMP- and TGF&#946;-signaling to be involved in EMT induction and maintenance. This model system is relevant to investigate EMT in vitro. It is cost-efficient and shows high reproducibility. It also allows for the comparison of different compounds with respect to their migration responses (quantitative distance measurement), and high-throughput screening of compounds to inhibit or enhance EMT (qualitative measurement). The model is therefore well suited to test drug libraries for substances affecting EMT.

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) allows cancers to become invasive. To investigate EMT, a neural stem cell (NSC)-based in vitro model devoid of serum and enzymes is described. This standardized system allows quantitative and qualitative assessment of cell migration, gene and protein expression. The model is suited for drug discovery.

Un modelo enzima y Cultura Neural Stem Cell libre de suero para la EMT Investigación Adecuado para el descubrimiento de fármacos

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Generación de células madre neuronales inducidas a partir de células mononucleares periféricas y diferenciación hacia precursores de neuronas dopaminérgicas para estudios de trasplante

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

Producción libre de suero de heferas humanas tridimensionales a partir de células madre pluripotentes

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...