Este protocolo explica cómo fabricar y utilizar tecnologías de microfluídica para aprovechar los beneficios experimentales en el rendimiento de muestras, el manejo automatizado y la capacidad de aplicar con precisión la tensión mecánica mientras se visualizan simultáneamente las muestras. Esta técnica minimiza el manejo manual de organismos biológicos multicelulares, como embriones y organoides, para su inmovilización, alineación e imágenes en vivo. También permite la aplicación de compresión mecánica a ellos para estudios de mecanobiología.
La fabricación de moldes con características de alta relación de aspecto para este chip microfluídico puede ser un desafío con las técnicas de microfabricación convencionales. Los consejos explicados en este artículo de video pueden superar estos desafíos. Para comenzar, limpie la oblea de silicio primero con acetona y luego con alcohol isopropílico.
Coloque la oblea de silicio en una placa caliente de 250 grados centígrados durante 30 minutos. para hornear la deshidratación. Cubra la oblea de silicio con hexametildisiloxano en un horno de vapor principal.
Coloque una botella de SU-8 2100 Photoresist en un horno de 60 grados centígrados durante 15 minutos para reducir su viscosidad. Vierta un mililitro de la fotorresistencia calentada por cada pulgada de la oblea de silicio colocada en la placa caliente hasta que la fotorresistencia cubra la mayor parte de la superficie. Aplique primero el pre-giro a 250 rotaciones por minuto durante 30 segundos, y luego a 350 rotaciones por minuto durante otros 30 segundos, ambos con una aceleración de 100 RPM por segundo.
A continuación, aplique un giro primero a 500 rotaciones por minuto durante 15 segundos con una aceleración de 100 RPM por segundo, y luego a 1, 450 rotaciones por minuto durante 30 segundos con una aceleración de 300 RPM por segundo. Retire el cordón del borde con un hisopo de sala limpia y rocíe acetona en la oblea para eliminar las imperfecciones y promover un recubrimiento uniforme. Exponga la oblea de silicona a una luz UV de 350 milijulios por centímetro cuadrado a través de la máscara fotográfica.
Usando el alineador de la máscara de contacto, aplique el horno posterior a la exposición a la oblea de silicio y deje que se enfríe a temperatura ambiente. Coloque el vaso de precipitados dentro de otro vaso de precipitados más grande y llene el vaso de precipitados más grande con una nueva solución de desarrollador. Coloque una malla metálica en el vaso de precipitados.
Coloque la oblea de silicio en la malla metálica boca abajo. Deje la oblea de silicio sumergida en el revelador durante 30 minutos con el agitador encendido. Transfiera la oblea de silicio a un sonicador de baño ultrasónico lleno con el revelador fresco durante una hora a 40 kilohercios.
Luego saque la oblea del vaso de precipitados y lávela con una nueva solución de desarrollador. Prepare la solución PDMS precurada mezclando la base de PDMS con el agente de curado en una proporción de 10 a uno. Desgasifique la mezcla colocándola en una centrífuga durante 500 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Vierta el PDMS precurado en una oblea de silicio y desgasifique nuevamente. Finalmente, coloque el PDMS sin curar en un horno de 60 grados centígrados para curar. Utilice un bisturí para cortar los bordes de la región PDMS curada correspondiente a la geometría del chip microfluídico.
Perfore los orificios de entrada y salida en PDMS usando un punzón de biopsia o una aguja con una punta roma. Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio con su superficie estampada mirando hacia el portaobjetos de vidrio después del tratamiento con plasma para sellar los microcanales a través de la unión covalente. Permita que las moscas adultas de Oregon-R pongan huevos en platos de agar jugo de manzana y recoja los platos en el momento de desarrollo deseado después de la puesta de huevos para el experimento dado.
Inunde el agar con el lavado de huevos de embrión y agite suavemente los embriones con un pincel para desalojarlos del agar. Transfiera los embriones a una solución blanqueadora al 50% durante 90 segundos, revolviendo ocasionalmente. Cuele los embriones a través de un tamiz de tejido y lave bien la solución de lejía con agua.
Transfiera los embriones a una placa de Petri de vidrio de 90 milímetros con suficiente lavado de huevos de embriones para cubrir completamente los embriones. Examine los embriones con transiluminación en un microscopio de disección y seleccione embriones de la etapa de desarrollo deseada para cargarlos en el dispositivo microfluídico. Prepare los siete microcanales embrionarios llenándolos con 0,4 micrómetros de IPA filtrado a través del puerto de entrada principal del embrión.
Reemplace el IPA con 0.4 micrómetros de agua desionizada filtrada. Luego reemplace el agua DI con una solución de lavado de huevos de embrión. Recolectar aproximadamente 100 embriones preseleccionados de la placa de Petri de vidrio usando una pipeta de vidrio.
A continuación, pipetear los embriones en el puerto de entrada del embrión y aplicar aproximadamente tres PSI de presión negativa a la entrada de gas utilizando una bomba de vacío portátil para abrir los microcanales del embrión. Luego incline el chip microfluídico hacia abajo para que los embriones se alineen automáticamente y se asienten en los microcanales embrionarios. Si las entradas del microcanal del embrión se obstruyen por múltiples embriones que entran simultáneamente, incline el chip microfluídico hacia arriba y luego hacia abajo nuevamente para despejar la obstrucción.
Según el rendimiento requerido, introduzca hasta 300 embriones en los microcanales embrionarios. Una vez completada la carga embrionaria, retire el vacío para inmovilizar los embriones. Luego incline el chip microfluídico de nuevo a la posición horizontal.
Conecte una fuente de presión positiva portátil con un manómetro a la entrada de gas para aplicar tres PSI de compresión. Si se van a realizar experimentos de imágenes en vivo en los embriones estimulados mecánicamente, coloque el chip microfluídico en un portaobjetos de vidrio de etapa de microscopio estándar con la entrada de gas conectada a la fuente de presión. Examinar los embriones bajo un microscopio fluorescente dentro de los canales microfluídicos.
Una vez que se completa el experimento de compresión, los embriones se pueden recolectar para el análisis posterior. Para ello, primero, aplica el vacío a la entrada de gas para liberar los embriones. Luego incline el chip microfluídico hacia arriba para que los embriones se muevan hacia abajo hacia el puerto de introducción de embriones.
Recoger los embriones del chip microfluídico utilizando una pipeta de vidrio. La funcionalidad del dispositivo microfluídico se determinó experimentalmente cargando embriones de Drosophila en los canales de compresión y aplicando presión positiva a los canales de gas. Los embriones no experimentan una compresión significativa al vacío, o en estados de presión neutra.
Se comprimen cuando se aplica presión positiva. Las mediciones del ancho decreciente de los embriones bajo un microscopio demuestran cómo se puede utilizar la presión del gas para obtener un nivel de compresión objetivo. Los dispositivos microfluídicos fabricados de esta manera permiten la estimulación química de muestras inmovilizadas.
La estimulación permite imágenes espaciotemporales altas. Una pregunta fundamental en biología del desarrollo es ¿cómo regulan las fuerzas mecánicas la expresión de proteínas y genes durante el desarrollo? Esta tecnología nos permite aplicar estimulación mecánica a un gran número de embriones a la vez, de modo que podamos aislar cantidades suficientes de proteínas y ARN para realizar experimentos comparativos de proteómica o transcriptómica.
Esto permitirá a los investigadores aprender más sobre las proteínas y los genes que son sensibles a las fuerzas mecánicas.
