Bu çalışma Marie Curie Uluslararası Yeniden entegrasyon hibesi ile desteklenmiştir.

1. Cihaz İmalatı <ol><li> Stanford Mikroakiskan Döküm (den DTPA-D SU-8 kontrol kalıp ve SPR220-7 akış kalıp Satın <a href="http://www.stanford.edu/group/foundry" target="_blank">www.stanford.edu / grup / döküm</a> ). </li><li> Pişirme adımları sonra 9 elastomer salınımını teşvik etmek 10 dakika chlorotrimethylsilane (TMCS) buharı silikon kalıplar Açığa. </li><li> İki farklı oranlar sırasıyla 5:1 vermekte kontrolü ve akış kalıpları için 20:1, silikon bazlı elastomer ve sertleştirici (iyice karıştırın) karışımı hazırlayın. Farklı oranlarda çoklu katmanlar için uygun bağların gereklidir. </li><li> Kontrol tabakası (yaklaşık 5 mm yükseklik) 05:01 PDMS dökün. 80 kontrol tabakası ve 30 dakika için fırına Degas ° C. Sonra, Sıkma kat (Laurell, USA) 60 saniye için 2.600 rpm&#39;de akış tabaka üzerinde 20:01 PDMS ve karışım 30 dakika için 80 ° C &#39;de fırında. Spin lak hızı bir basınçta valf harekete için optimize edilmiştir15 psi. Daha hızlı dönen bir alt basınç aktivasyonu ve bunun tersi olan bir ince tabaka ile sonuçlanacaktır. Kullandığımız cihazlar substrattan dekolmanı meydana gelebilecek Yukarıda, akış kontrolü 25 psi ve 10 psi bir sınırı vardır. </li><li> Kalıptan kontrol tabakası ayırın. Yavaş yavaş ve değil SU8 desen soyma dikkat etmeyin. Sonra kontrol kanalları erişmek için kendi çevre ve zımba delikleri çevresinde cihaz kesti. </li><li> Elle stereoskop altında akış ve kontrol tabakaları hizalayın. Sol üst köşesine hizalayarak başlayın; düğmesine vana (kontrol tabakası) reaksiyon odası (akış tabakası) ortasında olmalıdır. Ardından, ilk satır hizalayın ve yavaşça satır tarafından kontrol katmanı satır bırakın. Her düğme valfleri reaksiyon odaları ortasında ve adres ve giriş vanaları doğru konumda akış kanalları çapraz ki olduğundan emin olun. Tüm satırlar hizalanır kadar işlem lokal tekrar edilebilir. Sonunda, PDMS b herhangi bir gerilim serbesty kenar ve köşeler dikkatlice kaldırarak. Çok fazla kaldırmayın veya kayma meydana gelebilir. </li><li> 80 de 2 saat için fırına ° C. </li><li> Cihazın dış kenarı boyunca ve akım kalıp iki tabaka cihaz (çip) soyma kesin. Akış kanalları (Şekil 1) erişmek için delikler. </li></ol> 2. DNA Arraying ve Aygıt Yerleşimi <ol><li> Montaj PCR ile sentetik gen üretin. Sentetik genler T7 promotor, ribozom bağlanma yeri (RBS), iki epitop etiketleri ile ORF (her iki ucunda) ve T7 terminatör 4 beste vardır. Genleri, en azından, en fazla 100 bp uzunluğunda 5000 bp değişebilir. </li><li> Arraying için sentetik genler hazırlayın: poli etilen glikol (% 1.25) ve D-trehaloz dihidrat (125 mg / ml) bir karışımı hazırlandı ve 384 kuyu plakası reaksiyon başına 2 ul dağıtın. Bu çözelti hizalama 10 boyunca görselleştirme için hem de cam DNA tersinmez bağlayıcı azaltacaktır. </li&gt; <li> 384 kuyu plaka sentetik gen aktarın. Genellikle DNA konsantrasyonları 10 ul / ng 100 ng / ul nihai konsantrasyonu değişir. 20 ul (microarrayer ve pin tipi bağlıdır) bir son hacim dH 2 O ekleyin. </li><li> Bir microarrayer kullanılarak epoksi kaplı cam tabanlar üzerinde sentetik bir seri gen Nokta. Biz SMT-S75 silikon işaretçilerine (Paralel Sentez, ABD) ile MicroGrid 610 (Bio Robotik) kullanın. Bu özel pimleri ile, DNA baskı İletişim, cam yüzey üzerinde yaklaşık 100 um çaplı noktalar ile sonuçlanır. Her pim yükü yaklaşık 100 lekeler için yeterlidir. Sütun ve satır sahalar kullanılan belirli bir cihaza uygun olduğundan emin olun. Kullandığımız cihaz 16 sütun ve sırasıyla 320 mikron ile 680 mikron arasında bir adım ile 40 satır içerir. </li><li> Elle stereoskop altında gen dizisine mikroakışkan cihaz hizalayın. DNA nokta DNA odaları ortasında olmalıdır. Noktalar b ilk satırı bularak uyum başlayınDNA odalarının ilk satırı elow. Ardından, satır kalanı tüm cihaz ince ayar ile bitiş çizgisine getirmek. Dizi hizalanmış sonra bakım yerel kaldırarak, PDMS herhangi stresi hafifletmek için alınmalıdır. Bu mikroarray iyi bağ olmayabilir PDMS kalan gerginlik varsa. </li><li> Nihayet, 80 bir sıcak plaka üzerinde gecelik inkübasyon tarafından cam slayt bağ cihaz ° C. </li></ol> 3. Hazırlama ve Cihaz etkinleştirme <ol><li> Kontrol tabakası olarak valf LabVIEW kullanarak bilgisayar kumanda edilir. LabVIEW komut dosyası bir elektronik kontrol kutusu (Stanford Mikroakiskan Döküm satın) ile selenoid mikro vana bir dizi kontrol eder. Solenoid valf manifoldu cihaz üzerinde kontrol valfleri içine hava akımı ve basıncı kontrol basınçlı hava, bağlanır. </li><li> (Tygon &quot;0.02 iç çapı ile esnek plastik boru kullanarak solenoid valfler manifolduna bağlayın) Ve paslanmaz çelik pim (New England Küçük Tüpler Corporation). </li><li> DDW ile tüpler doldurun ve kontrol katmanı erişim deliklere pimi takın. Her bir tüp karşılık gelen kumanda kanalına bağlı olduğundan emin olun. </li><li> Kontrol kanalları etkinleştirmek için bilgisayarda LabVIEW uygulamasını çalıştırın. LabVIEW script valfi devreye sokarak, biz sırayla PDMS kontrol kanalları içine su itecektir hava basıncı, uygulayın. Hava basıncı 5 psi ayarlayın. Bu arızalı cihazların kontrol kanalları arasındaki çapraz-görüşmeler tespit etmek için, ilk olarak &quot;sandviç&quot; ve adres valfleri doldurmak için tavsiye edilir. Çapraz görüşmeler durumunda, &#39;sandviç&#39; kontrol çizgisinin harekete boyun veya düğme kontrol hatları birinin harekete yol açacaktır. Bu, bir elektrik devresi içinde bir kısa benzer. Diyafoniyi olan bir cihaz arızalı ve kullanılamaz. </li><li> Tüm kontrol kanalları ve vanalar DDW dolu sonra, vanalar astarlanmış ve rea vardırAltlarında akış kanalları engellemek için dy. Hava basıncı 15 psi artırın. Valf Etkinleştirme bireysel selenoid vana bağlı kapalı / anahtarları bir dizi aracılığıyla LabVIEW programı tarafından kontrol edilir. Her anahtar karşılık gelen selenoid vana aracılığıyla belirli bir kontrol hattı kontrol eder. Düğmesi (komut) Açma gelen tüp hava basıncı uygulanır. Hava basıncı kontrol hattı içinde DDW itmek ve alt kanal bloke edici, mikroakışkan valf genişlemesi ile sonuçlanır. Bir kontrol vanası kapatılması, hava basıncı serbest bırakmak ve daha sonra ilgili akış kanal engelleme yayınlayacak. </li><li> Tüm valf açık olduğundan emin olmak için, akım girişleri ve 4-5 psi cihaz içine hava akış birine göre bir tüp bağlanır. Bu cam slayt herhangi bir yapışkan vanalar yayınlayacak. </li><li> Son olarak, cihaz, astar ve hazır edilir. Yüzey kimyası başlatmak için tüm giriş ve &#39;boyun&#39; valfleri kapatın. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Yüzey Kimyası <ol><li> Yüzey üzerinde bir protein dizinin kendi montaj kolaylaştırmak ve mikroakışkan cihaz içinde spesifik olmayan adsorpsiyon önlemek için, yüzeyin kimyasal olarak modifiye edilir: </li><li> Aygıt aracılığıyla bir bileşen akıtmak için, cihaz içinde akış kanallarından biri için gerekli çözelti ile yeni bir tüp bağlanır. Kılavuz manifolduna tüpün serbest yan bağlayın ve hava basıncı akımı (5 psi) açın. </li><li> Cihazından 20 dk için yaklaşık yarım yeni bir tüp içinde ve akış biyotinile-BSA (1 ug / ul), 40 ul yerleştirin BSA epoksi yüzeyine bağlanır. </li><li> Farklı yüzey kimyası adımların her biri arasında reaksiyona girmeyen yüzey yıkama için HEPES (50 mM) kullanın. </li><li> Biyotinile-BSA üzerine, 20 dakika boyunca 25 ul akış Strepavidin (0.5 ug / ul). </li><li> 5 dk Hepes ile yıkayın. </li><li> &#39;Butonu&#39; vanasını kapatın ve biyotin-BSA kalanı (anlatıldığı şekilde akardüğme çevreleyen yüzey pasifleştirici yukarıda yatak). </li><li> 5 dk Hepes ile yıkayın. </li><li> 20 dakika penta-His-biotin &#39;düğme&#39; vana ve akış 30 ul (0.16 mikrogram / ul) bırakın. Antikor maruz strepavidin bağlanacaktır; özel bir anti His-etiketi dizi oluşturma &#39;düğme&#39; altındaki alana. </li></ol> 5. Protein Ekspresyonu <ol><li> Tavşan retikülosit hızlı birleştiğinde transkripsiyon ve translasyon reaksiyonu kullanılarak cihaz üzerinde proteinlerin ifade eder. Cihaz üzerinde benekli sentetik genlerden protein ekspresyonu kullanıma hazır proteinler bir dizi oluşturur. Örneğin, böyle bir kullanımı bir protein bağlama ekran içindir. </li><li> &#39;Boyun&#39; valfleri ve akış tavşan retikülosit pratik birleştiğinde transkripsiyon ve DNA odasına cihaz aracılığıyla çeviri reaksiyonu açın. Sonra, &#39;sandviç&#39; vanalarını kapatın ve çevresinin her gen ayırın. 30. az 2.5 saat için bir sıcak levha üzerinde inkübe cihaz ° C. Ifade proteins, C-terminali etiket aracılığıyla protein hareketsizleştirici &quot;butonunu&quot; kapağın altında anti-His antikor için DNA odasından gelen reaksiyon oda kendiliğinden (boyun valf açıktır) ve bağlama için dağılacaktır. </li><li> C-myc antikoru ile Cy3 proteinleri etiketleyin. Antikor proteini N-ucu bulunan karşılık gelen bir epitopa bağlanır. </li><li> Bir 532 nm lazer ve 575 nm emisyon filtresi kullanarak bir mikroarray tarayıcı (LS Reloaded, Tecan) ile protein ekspresyon düzeyleri belirleyin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar 1. Cihaz İmalatı Cihaz için bir grafik tasarım bizim deneysel gereksinimlerine dayalı AutoCAD tarafından oluşturuldu. Tasarım, yüksek çözünürlüklü görüntü ayarlayıcı bir asetata basılmış. Bu şeffaflık temas fotolitografi bir Fotoşablonlarda olarak hizmet vermektedir. Bir yüzey mikroişleme tekniği t üzerinde yazılı desenleri tarafından belirlenen bir silikon yonga üzerine 3-D şablonları oluşturmak için kullanılanO maske kullanılmalıdır. Mikroakışkan cihaz silikon elastomer polidimetilsiloksan (PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, ABD) (Şekil 1) döküm silikon kalıp üzerinde imal edilmiştir. Her cihaz, iki hizalanmış PDMS katmanları, ve akış kontrol tabakasını içermektedir. Kalıp ilk pişirme adımlardan sonra elastomer salınımını teşvik etmek 10 dakika chlorotrimethylsilane (TMCS, Aldrich) buhar maruz kalmıştır. Silikon bazlı elastomer ve sertleştirici bir karışım, iki farklı oranı ise 5:01 ve kontrol ve akış kalıpları için 20:1 içinde hazırlanmıştır. Kontrol tabakası 80 ° C&#39;de gazdan arındırıldı ve 30 dakika süre ile pişmiş Akış tabakası başlangıçta 60 saniye 2,600 rpm&#39;de (Laurell, ABD) kaplamalı spin ° C 30 dakika 80 pişmiş. Kontrol katmanı kendi kalıp ayrıldı ve kontrol kanal erişimi delikler vardı. Daha sonra, akış kontrol tabakaları ve bir stereoskop altında el ile hizalanır ve 80 de 2 saat boyunca pişirilmiştir ° C. İki katman cihazın f soyuldurom akışı kalıp ve akış kanallarına erişim delikler vardı. 2. Aygıt Tanımı Cihaz kapasitesi 500 ila 10,000 birim hücreler (Şekil 2) olabilir. Cihaz iki katmandan oluşur; akım tabakası (gri) ve kontrol katmanı (renk). Kontrol katmanı farklı fonksiyonu ile vanalar çeşitli içerir. Akış tabaka içinde her bir birim hücre, bir DNA ve bir reaksiyon odasına oluşur ve mikro vana üç tipleri tarafından kontrol edilir; &quot;boyun&quot;, &quot;düğme&quot;, ve &quot;sandviç&quot; (Şekil 2A). DNA odasının içindeki yatırılan bir benekli &#39;sentetik gen&#39; &#39;Boyun&#39; vana (yeşil) ile reaksiyon odası engellenir. Reaksiyon oda yüzey bağlı proteinler sıkışması ve mekanik yıkama &quot;butonunu&quot; kapağın (mavi) tarafından gerçekleştirilir. &quot;Sandviç&quot; valf kendi başına birim hücre (kırmızı) meydana geldiği her bir tepki verir. Adresi vanalar differe için, 8 bağımsız bölüm için Aygıtı bölebilirsiniznt durumu tahlil. Buna ek olarak, kontrol tabakası akış tabakası içine seçilmiş akışkan akışını sağlamak giriş valf içerir. PDMS kontrol kanalları DDW ile dolu. PDMS genişleme bir valf basınç artışı devreye girer (15 psi) sonuçları. Membran yeterince ince olduğu yerlerde (örneğin, kontrol ve akış hatlarının kapısı) bu tamamen akış hattı engellemek için yeterlidir. Ortalama birim hücre yüksekliği 10 mikron ve ortalama birim hücre hacmi az 1 nl olduğunu. 3. Proteinler İfade ve Algılama Proteinler tavşan retikülosit pratik birleştiğinde transkripsiyon ve translasyon reaksiyonu (Promega) kullanarak cihaz üzerinde ifade edildi. Proteinlerin ekspresyonu, bir bağlayıcı ekran içinde kullanım için hazır protein (Şekil 3) arasında bir dizi oluşturulur. Bir ifade karışımı (12.5 ul) cihazın içine yüklenen ve daha sonra &#39;Boyun&#39; valfleri açarak DNA odalarına akınına uğradı. Sonra, &#39;sandviç&#39; vanalar vardıkomşu hücreler ve cihazı ayrılmış her bir birim hücrenin 30 2.5 saat için bir sıcak levha üzerinde inkübe edildi bırakarak ° C&#39;de kapatılmış Kendi C-terminali His etiketi anti-His antikoru (Qiagen) yüzeyine protein hareketsizleştirici &#39;düğme&#39; valf altında yer bağlamak olabilir reaksiyon odasına, içine bölme gen tarafından yayılır proteinler. Proteinler protein N-ucu bulunan karşılık gelen bir epitopa bağlanır ve bir etiketli c-myc Cy3 (Sigma) ile işaretlendi. Protein ekspresyon düzeyleri bir 532 nm lazer ve 575 nm filtresini kullanarak bir mikroarray tarayıcı (LS Reloaded, Tecan) ile belirlenmiştir. Elde edilen protein dizisinin proteini ekspresyonu, değişen oluşur. Genellikle, bir gen kütüphanesi yaklaşık% 20, tespit edilebilir seviyelerde ifade etmek başarısız olmaktadır. Protein boyutu ile korelasyon 3 gözlenmiştir. Arka plan seviyeleri DNA ile tespit edilmemiştir odası kullanılarak belirlenmiştir. Böylece, ilgili protein odalarından sinyalleri n ya nedeniyleoise ya da etiketleme antikorların spesifik olmayan adsorpsiyon. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Chip Fabrikasyon. (A) kalıplar 10 dakika TMCS buharlar ile tedavi edildi. (B) PDMS kontrolü ve akış silikon kalıplar üzerine dökülmektedir. (C) her ikisi de kontrol ve akış kalıplar 80 ° C&#39;de 30 dakika boyunca pişirilir. (D) kalıp soyulmuş kontrol katmanı, ebatlarına göre kesilmiş ve kontrol girişlerine açılmıştır. (E) kontrol tabakası bir stereoskop altında akış tabaka ile hizalanır ve daha sonra 80 pişirilir 2 saat ° C. PDMS aygıt yapılmasına paralel olarak, sentetik bir seri gen epoksi kaplı cam yüzeyler (CEL Associates) üzerine microarrayed edilir. (F) aygıtı sonra DNA odaları içinde &#39;Sentetik genler&#39; yakalama DNA mikroarray hizalanır. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. PING Cihaz bir Fotoğraf. (A) Cihaz consiiki bağlantısız PDMS katmanları (kontrol ve akış) st. Akış katman kontrol tabakası olarak mikromekanik valfler (&quot;ayarlamak&quot;, &quot;sandviç&quot; ve &quot;boyun&quot;) tarafından kontrol edilen paralel DNA ve reaksiyon odaları (gri) içerir. (B) katmanları basılı mikroarray, tek bir nokta ile her DNA odasına programlarına hizalanır. Bu herhangi bir potansiyel kontaminasyonu ortadan kaldırır. <img src="/files/ftp_upload/3849/3849fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. Bir Mikroakışkan Chip ile düzenlendi Bir ​​Protein Array Floresan Görüntüleri. Yazdırılan spot genler cihazın içindeki proteinler (DNA odasında) dile getirilmiştir ve onların aracılığıyla (reaksiyon odasında &quot;düğmesi&quot; kapak altında) yüzeye yıktırılmıştır C-terminali Onun etiketi. Protein ifade onların c-myc N-terminali, etiket ve belirli bir floresan antikor kullanılarak tespit edildi. Farklı sinyal şiddetleri farklı protein ekspresyon düzeyleri göstermektedir. Un-benekli odaları arka le için kontrol grubu olarakVELS.

<ol>
	<li>Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+column:+Microfluidic+high-throughput+screening.">Integration column: Microfluidic high-throughput screening.</a> Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).</li><li>Hong, J. W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+nanoliter+systems.">Integrated nanoliter systems.</a> Nature. 21, 1179-1183 (2003).</li><li>Unger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks.">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nature. 6, 71-74 (2009).</li><li>Einav, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+hepatitis+C+target+and+its+pharmacological+inhibitors+by+microfluidic+affinity+analysis.">Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis.</a> Nature. 26, 1019-1027 (2008).</li><li>Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+identification+and+biophysical+characterization+of+transcription-factor+binding+sites+with+microfluidic+affinity+analysis.">De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis.</a> Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).</li><li>Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+analysis+of+protein+activities+using+proteome+chips.">Global analysis of protein activities using proteome chips.</a> Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).</li><li>Ramachandran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+protein+microarrays.">Self-assembling protein microarrays.</a> Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).</li><li>Zhong, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+processor+for+gene+expression+profiling+of+single+human+embryonic+stem+cells.">A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells.</a> Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).</li><li>Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supports+for+microarray+immunoassays.">Solid supports for microarray immunoassays.</a> Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).</li><li>Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topology+of+the+membrane-associated+hepatitis+C+virus+protein+NS4B.">Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B.</a> Journal of virology. 77, 5428 (2003).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu yazıda, bir mikroakışkan platformu kullanarak yüksek throughput nesil protein dizileri için bir yöntem mevcut. Dizi nesil DNA şablonları mikroarray baskı ve mikroakışkan cihaz içinde DNA&#39;nın in vitro protein ekspresyonu dayanır. Bizim roman mikroakışkan platform proteomik için umut verici ve genel bir araç haline anda kullanılan yöntemler üzerinde birçok önemli avantajlara sahiptir. Bir avantaj zar-bağlı proteinler ile. Mikrozomal membran <su...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Ekipman </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> PDMS-Sylgard 184 </td><td> Dow Corning USA </td><td> ESSEX-DC </td></tr><tr><td> Chlorotrimethylsilane (TMCS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C72854 </td></tr><tr><td> Epoksi kaplı cam yüzeyler </td><td> CEL Associates ABD </td><td> VEPO-25C </td></tr><tr><td> Poli etilen glikol (PEG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81260 </td></tr><tr><td> D-trehaloz dihidrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9531 </td></tr><tr><td> Biotinlenmiş-BSA </td><td> Delmek </td><td> PIR-29130 </td></tr><tr><td> Neutravidin </td><td> Delmek </td><td> 31050 </td></tr><tr><td> Penta-His-biotin </td><td> Qiagen </td&gt; <td> 34440 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> <a href="http://www.bioind.com/htmls/article.aspx?c0=741&amp;bsp=13384" target="_blank">Biyolojik Sanayi</a> </td><td> 03-025-1B </td></tr><tr><td> TNT-T7 </td><td> Promega </td><td> L5540 </td></tr><tr><td> C-myc Cy3 antikor </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr><tr><td> Kontrol kutusu </td><td> Stanford Mikroakiskan Döküm </td><td></td></tr><tr><td> Kalıp </td><td> Stanford Mikroakiskan Döküm </td><td></td></tr><tr><td> Pin </td><td> New England Küçük Tüpler Corporation&#39;ın </td><td></td></tr><tr><td> Tygon microbore boru </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Microarrayer </td><td> Bio Robotik </td><td> MicroGrid 610 </td></tr><tr><td> Silikon işaretçilerine </td><td> Paralel Syntez </td><td> SMT-S75 </td></tr></tbody></table>

high-throughput protein expression generator using a microfluidic platform

Bu tür sistemler biyoloji gibi hızla artan alanları, büyük sistemlerde yüksek verimli ve yüksek kalitede ölçüm sağlayan yeni teknolojilerin geliştirilmesi ve uygulanması gerekmektedir. Mikroakiskan, biyokimyasal biyofiziksel ve hücre tabanlı deneyleri 1 kapsayan, bu tür on-chip yüksek çıktılı tarama deneyleri gerçekleştirmek gibi, bu gereksinimleri birçok yerine getirmek için vaat ediyor. Mikroakışkanları cihazların ilk günlerinden bu yana, bu alanda büyük ölçüde mikroakışkan büyük ölçekli entegrasyon 2,3 gelişimine öncülük etmek, gelişti. Bu teknoloji, bir pul büyüklüğünde yer kaplayan (Şekil 1) ile tek bir cihazda mikromekanik vanaları binlerce entegrasyon sağlar. Biz PING (Protein Etkileşim Ağı Generator) adlı proteini diziler (Şekil 2) in vitro ifade oluşturmak için bir high-throughput mikroakışkan platformu geliştirdi. Bu diziler birçok deneyler için bir şablon görevi görebilirgibi protein-protein 4, protein-5 RNA ya da protein-DNA 6 etkileşimleri. Cihaz tek bir microarrayer kullanılarak programlanır reaksiyon odaları binlerce oluşur. Standart mikroarray lekelenme teknikleri kullanarak mikroarrayler üreten Ayrıca potansiyel kontaminasyon veya çapraz reaktivite ortadan kaldırarak, tek bir nokta ile ve arayüz aygıtları programlar için bu baskılı microarrays her odası hizalama, proteinler 7, DNA 8, küçük moleküllerin arraying için izin de çok modüler ve hatta kolloidal süspansiyonlar. Biyolojik bilimler üzerine mikroakışkanları arasında potansiyel etkisi önemlidir. Mikroakışkanları dayalı testler bir dizi zaten biyolojik sistemlerin yapısı ve fonksiyonu yeni bakış açıları sağlamıştır ve mikroakışkanları alanında biyoloji etkilemeye devam edecek.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform at JoVE.com

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

high-throughput-protein-expression-generator-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.6K Görüntüleme.  Bar-Ilan University. Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Video: High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Biyomühendislik

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: İnsan Microarrayed hücrelerde DNA hasarına ölçülmesi için bir Yüksek verim 96 Oyuklu Platformu

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging techniques.
The one-time use packaging technique employs UV-based and temperature curing epoxies to connect microtubes to access holes, wire-bonding for integrated circuit connections, and silver epoxy for electrical connections. This method is based on a robust assembly technique that can support relatively high pressure close to 1 psi and does not need any support to strengthen the microfluidic architecture.
Reusable packaging techniques consist of PDMS-based microtube interconnectors and anisotropic adhesive films for electrical connections. These devices are more sensitive and fragile. Consequently, Plexiglas support is added to the microfluidic structure to improve the electrical contact when anisotropic adhesive films are used, and also to strengthen the microfluidic architecture. In addition, a micromanipulator is needed to maintain tubes while using a thin PDMS layer to connect them to the access holes. Different PDMS layer thicknesses, ranging from 0.45-3 mm, are tested to compare the best adherence versus injection rates. Applied injection rates are varied from 50-300 &#956;l/hr for 0.45-3 mm PDMS layers, respectively. These techniques are mainly applicable for low-pressure applications. However, they can be extended for high-pressure ones through plasma-oxygen process to permanently seal the PDMS to glass substrates. The main advantage of this technique, besides the fact that it is reusable, consists of keeping the device observable when the microchannel length is very short (in the range of 3 mm or lower).

In this article we describe different techniques for microfluidic rapid prototyping platforms. The proposed techniques are based on ultraviolet (UV) sensitive and temperature curing epoxies, polydimethylsiloxane (PDMS) based tubing, wire-bonding, and anisotropic adhesive films. The assembling procedures presented are developed for both one-time use devices as well as reusable microfluidic systems.

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected within in vivo oral biofilms. Furthermore, a system that uses natural human saliva as the nutrient source, instead of artificial media, is particularly desirable in order to support the expression of cellular and biofilm-specific properties that mimic the in vivo communities. We describe a method for the development of multi-species oral biofilms that are comparable, with respect to species composition, to supragingival dental plaque, under conditions similar to the human oral cavity. Specifically, this methods article will describe how a commercially available microfluidic system can be adapted to facilitate the development of multi-species oral biofilms derived from and grown within pooled saliva. Furthermore, a description of how the system can be used in conjunction with a confocal laser scanning microscope to generate 3-D biofilm reconstructions for architectural and viability analyses will be presented. Given the broad diversity of microorganisms that grow within biofilms in the microfluidic system (including Streptococcus, Neisseria, Veillonella, Gemella, and Porphyromonas), a protocol will also be presented describing how to harvest the biofilm cells for further subculture&#160;or DNA extraction and analysis. The limits of both the microfluidic biofilm system and the current state-of-the-art data analyses will be addressed. Ultimately, it is envisioned that this article will provide a baseline technique that will improve the study of oral biofilms and aid in the development of additional technologies that can be integrated with the microfluidic platform.

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

The goal of this methods paper is to describe the use of a microfluidic system for the development of multi-species biofilms that contain species typically identified in human supragingival dental plaque.&#160;Methods to describe biofilm architecture, biofilm viability, and an approach to harvest biofilm for culture-dependent or culture-independent analyses are highlighted.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

Boyuna Imaging'de Caenorhabditis elegans için bir mikrosıvısal Platform

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Uzun Süreli Hücresiz Gen Ekspresyonunun İletimi için Çok Katmanlı Mikroakışkan Platform

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

A Microfluidic Platform for Stimulating Chondrocytes with Dynamic Compression

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth plate cartilage architecture and results in growth modulation of long bones of children. To determine the role of compressive stress in bone growth, we created a microfluidic device actuated by pneumatic pressure, to dynamically (or statically) compress growth plate chondrocytes embedded in alginate hydrogel cylinders. In this article, we describe detailed methods for fabricating and characterizing this device. The advantages of our protocol are: 1) Five different magnitudes of compressive stress can be generated on five technical replicates in a single platform, 2) It is easy to visualize cell morphology via a conventional light microscope, 3) Cells can be rapidly isolated from the device after compression to facilitate downstream assays, and 4) The platform can be applied to study mechanobiology of any cell type that can grow in hydrogels.

This article provides detailed methods for fabricating and characterizing a pneumatically actuating microfluidic device for chondrocyte compression.

Dinamik Sıkıştırma ile Chondrocytes Uyarıcı için Bir Mikroakışkan Platform

Mechanical stimuli are known to modulate biological functions of cells and tissues. Recent studies have suggested that compressive stress alters growth ...