1. Anfitrión de la transfección de células <ol><li> Semillas de 2 x 10 6 células CHO-DXB11 en T75 frasco de cultivo celular Corning en 15 ml de medio de cultivo (MEMA con nucleótidos y nucleósidos (Gibco, número de catálogo 12.571), complementado con un 10% γ-irradiados caracteriza suero fetal bovino (CFB) (HyClone, número de catálogo SH30071.03) y 10 ml / L de solución de glucosa al 45% (Sigma, número de catálogo G8769)) un día antes de la transfección. </li><li> En el momento de la transfección, preparar complejos de transfección de la siguiente manera: <ol class="lalpha"><li> Diluir 8 ug de ADN en 800 l de medio de cultivo sin suero en un tubo estéril de microcentrífuga. Mezclar suavemente. </li><li> Diluir 40 l Lipofectamine ™ (Invitrogen 18.324.012) en 800 l de medio de cultivo sin suero en un tubo de poliestireno. </li><li> Añadir el ADN diluido a la Lipofectamine ™ diluido. Mezclar suavemente e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Retire el medio de crecimiento de las células en T75 y reemplazar con 6,4 ml de medio de cultivo sin suero. Añadir 1,6 ml de la de los complejos de transfección en el matraz. Mezclar suavemente por balanceo de la placa. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 6 horas. </li><li> Añadir 8 ml de medio de cultivo en el matraz y se incuba a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante la noche. </li><li> Quitar medio por aspiración y se añade medio de cultivo fresco en el matraz. Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante la noche. </li><li> Vuelva a colocar el medio de cultivo con medio de selección (MEMA medio sin nucleótidos o nucleósidos (Gibco, número de catálogo 12561), complementado con un 10% γ-irradiados dializado de suero fetal bovino (DFB) (HyClone, número de catálogo SH30079.03) y 10 45 mL / L % de solución de glucosa (Sigma, número de catálogo G8769)). </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO 2 durante 2-3 semanas. </li></ol> 2. La clonación por citometría de flujo clasificación de células activadas <ol><li> Separar las células del frasco y se centrifuga a 800 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células en un medio de selección de bovinos suplementados con 2% de albúmina sérica y la etiqueta fluorescente anti-IgG humana a las 1:20 de la dilución. </li><li> Incubar en hielo durante 15-30 minutos y luego lavar dos veces con PBS frío. Resuspender las células en 1x PBS en un tubo de polipropileno. </li><li> Prepararse para la clase aséptica en un BD ™ FACSAria. Prepare 96 y placa de cultivo celular que contiene 200 l medio de selección en cada pozo. </li><li> Asépticamente cargar el tubo con las células y analizar en BD FACSAria ™, registrar los resultados de las células teñidas y sin teñir, respectivamente. </li><li> Establecer las puertas y los ajustes para ordenar las células individuales del perfil de fluorescencia de tinción deseado en placa de 96 pocillos (s). <ol class="lalpha"><li> Las células transfectadas se analizó en primer lugar sobre la base de dispersión frontal versus dispersión lateral. Una puerta de las células vivas se hace sobre la base de dispersión hacia adelante, que mide el tamaño de una célula, y la dispersión lateral, que mide la complejidad de una célula o una granularidad. </li><li> Las células que se encuentran dentro de esta puerta son examinados para la tinción de PE. Puerta PE negativa está listo para teñir las células transfectadas o células teñidas de acogida. Como las células teñidas transfectadas son examinados por FACS, el &quot;High PE&quot; la puerta es entonces delineada para abarcar el 5% de todas las células que son positivas para la tinción de PE. </li></ol></li><li> Las placas se incuban en la incubadora a 37 ° C durante dos semanas. </li></ol> 3. La documentación de la formación de colonias por CloneSelect ™ Imager Documento de la formación de colonias en placas de 96 pozos en CloneSelect Imager ™ en el día 0, día 3, día 7 y 13 días después de la FACS de clasificación. La documentación de la imagen se asegurará la selección de clones derivados de una sola célula. Un paso crítico en este documento es conseguir que el plano focal ajustada correctamente para el día 0 de medición, ya que sólo hay una célula en cada pozo en ese momento. Es muy importante que las imágenes de las células individuales se encuentran en el enfoque y tratar de ajustar el enfoque en ellos puede ser engañoso en el mejor. El plano focal puede variar significativamente entre las marcas de las placas y, posiblemente, incluso de un lote a otro de la misma marca. Así, un plano focal predeterminada debe ser utilizado. Esto puede ser logrado, centrándose en la prueba de micro-gotas o células de alta densidad depositados en las placas del mismo lote que se utiliza. Por otra parte, las placas completamente crecido del mismo lote puede ser usado para este propósito. Después de FACS clasificación, también es importante para que las células se conforme con un mínimo de 2 horas antes de la imagen, de modo que se &quot;fija&quot; en la posición en la placa. 4. Evaluación y selección de clones de alta productividad <ol><li> Documento de posición de la muestra en las placas de ensayo que reciben de 96 pozos. </li><li> Alícuotas de transferencia de 20 l sobrenadante (diluir si es necesario) en placas de 96 pozos de ensayo por el EVO TECAN Freedom ® sistema de manejo de líquidos. Este robot flexible y capazplataforma de IC ha sido adaptado para este y otros trabajos automatizados de cultivo celular. Programas especiales fueron escritos para utilizar mejor y mejorar las capacidades de la Libertad EVO robótica para el desarrollo de líneas celulares. Un ejemplo de esto es establecer el TECAN para interpretar CloneSelect ™ de datos de imágenes de la toma de muestras de pozos con colonias aisladas. Otros programas están obligados a realizar tareas adicionales de cultivo celular, como para hacer las diluciones adecuadas de las muestras tomadas, de interpretar, el catálogo y las placas de la muestra manualmente marcados, si es necesario, para ampliar los clones de alta producción, etc Muchos de estos programas pueden ser fácilmente aplicada a 384 placas, así como el original formato de 96 también. </li><li> Producción de anticuerpos en las muestras se analizaron por un sándwich de detección ELISA IgG humana (Pierce, Rockford, IL) en el EVO TECAN Freedom ® sistema de manejo de líquidos. <ol><li> Muestras y estándar (IgG1 humana mieloma, kappa) (Sigma, St. Louis, MO) fueron cargados en la pre-recubierto Bio Escudo Anti-Human placas de ensayo IgG (BD Biosciences, San Jose, CA). </li><li> Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas, seguida de tres lavados con PBS. </li><li> Cabra ImmunoPure anti-IgG humana (Fc-gamma)-HRP (Pierce, Rockford, IL) se añadió a la placa a una dilución 1:2000 y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. </li><li> Las placas fueron lavadas tres veces con PBS antes de añadir el sustrato ABTS (Pierce, Rockford, IL) y se leyeron en un lector de placas con la absorbencia a 405 nm para la detección. </li></ol></li><li> Seleccionar clones de alta productividad y evaluar la productividad en el cultivo en suspensión. Por lote alimentado la cultura, las células fueron inoculadas en 0.3X106 células / ml en medio libre de proteínas VENTAJAS INMEDIATAS JRH 65578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con 5 hidrolizado g / L de soja (DMV International, número de catálogo SE50MAF-UF, mucho número) y se incuba a 37 ° C con 7,5% de CO 2. La cultura continúa y se complementaron con 2 g / L de glucosa (Sigma, número de catálogo G8769, número de lote 098K2329) cuando la glucosa más la concentración de lactato en la cultura llegó a menos de 2 g / L, y se les dieron 2 mM de glutamina (Gibco, número de catálogo 25030, número de lote 568177), cuando llegó a los niveles de glutamina por debajo de 200 mg / L (metabolitos medidos por YSI Bioanalyzer). Fed-batch culturas se concluyó el día 14 y la producción de anticuerpos se midió por HPLC de fase. </li><li> La caracterización genética de clones candidatos por hibridación in situ fluorescente (FISH) 5. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Un ejemplo de anticuerpos en desarrollo que producen clones con el método de alto rendimiento se muestra en la Figura 1 y Figura 2. Reserva de las células transfectadas se tiñó con la etiqueta fluorescente anti-IgG humana (fig. 1A), analizados y ordenados en la BD FACSAria ™ (fig. 1B). La formación de colonias en placas de 96 y fue fotografiada en CloneSelect Imager ™ (fig. 1C). Sobrenadante de cultivo celular se tomaron muestras de los pozos que contienen una sola colonia y ensayados por ELISA en el sistema de TECAN Freedom EVO ® de manejo de líquido (Figura 1D). Clones de alta productividad se encontraron a partir de células que mostraron mayor nivel de anticuerpos de superficie reflejada por la tinción fluorescente con anticuerpos anti-IgG humana. Al comparar los clones generados a partir de dos poblaciones de la reserva de las células transfectadas inicial, una gran diferencia en la productividad en fed-batch cultura se observó (Figura 2). Para los dos primeros clones generados por la población de células con alta expresión de anticuerpos de superficie (PE de alta), la productividad específica varió desde 50 hasta 70 pg / célula / día. Mientras que la productividad de anticuerpos fue de ~ 20 pg / célula / día durante los dos primeros clones generados por la población de células con baja expresión de anticuerpos de superficie (PE de baja). Además, las líneas celulares desarrolladas por FACS clasificación son más estables con respecto a la producción de anticuerpos que los que fueron clonados por dilución encalado manual (Figura 3). La productividad específica del clon de la parte superior, cayó &quot;Clon 1&quot;, generados por la dilución encalado manual de ~ 30 ~ 10 pcd de pcd después de un cultivo de 80 duplicaciones celulares. Por otro lado, la parte superior subclon generado por FACS clasificación, &quot;Clone 2&quot;, fue capaz de mantener la productividad específica en torno al 20 pcd por lo menos 100 duplicaciones celulares. Por hibridación in situ fluorescente (FISH), hemos demostrado un clon mostró como una población mixta de fenotipo A (85%) y el fenotipo B (15%). Por el contrario, FACS ordenados clon (clon 2) demostró ser una población más homogénea, con un 99,5% de las células resultó ser un fenotipo. (Figura 3B) <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Desarrollo de las líneas de fabricación de células para la producción de anticuerpos monoclonales a partir de células CHO. A) tinción de la superficie del grupo inicial de células transfectadas con la etiqueta fluorescente anti-IgG humana. B) Clasificación de la población de células con una alta intensidad de fluorescencia (PE de alta) y la intensidad de fluorescencia baja (PE de baja) en placa de 96 pocillos. C) Documentación de la coloniaformación desde el día 0 al día 13 después de la siembra en CloneSelect Imager ™. D) clones de detección por ELISA. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Superficiales asociadas nivel de anticuerpos se correlaciona con la productividad de anticuerpos de la célula. Los clones con tinción fluorescente de alta y baja fueron desarrollados en las líneas celulares y evaluados en fed-batch cultura. Volumétrica título y la productividad específica fueron comparados entre los 2 primeros clones de cada población. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Clones generados a partir de la clasificación FACS muestran una mayor homogeneidad genética y la estabilidad de clon. A) estabilidad de la producción de anticuerpos en la cultura de lotes para ~ 80 duplicaciones celulares del tiempo de cultivo transcurrir. Δ, el clon se generó mediante dilución límite, donde las células se sembraron a 2000 células / pocillo, 1000 células / pocillo y 500 células /. <img src="/files/ftp_upload/3010/3010triangle.jpg" alt="Triángulo negro" /> , El clon se ha generado a través de la FACS en una celda / bien. B) Lugar integración del transgén en el cromosoma de células CHO se identifica por hibridación fluorescente in situ.

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	<li>Hung, F., Deng, L., Ravnikar, P., Condon, R., Li, B., Do, L., Saha, D., Tsao, Y. S., Merchant, A., Liu, Z., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+stability+and+antibody+production+in+CHO+cells:+improvement+through+gene+optimization.">mRNA stability and antibody production in CHO cells: improvement through gene optimization.</a> Biotechnol. J. 5, 393-401 (2010).</li><li>Brezinsky, S. C., Chiang, G. G., Szilvasi, A., Mohan, S., Shapiro, R. I., MacLean, A., Sisk, W., Thill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+enriching+populations+of+transfected+CHO+cells+for+cells+of+higher+specific+productivity.">A simple method for enriching populations of transfected CHO cells for cells of higher specific productivity.</a> J. Immunol. Methods. 277, 141-155 (2003).</li><li>Kromenaker, S. J., Srienc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+producer+hybridoma+cell+lines+after+cell+sorting:+a+case+study.">Stability of producer hybridoma cell lines after cell sorting: a case study.</a> Biotechnol. Prog. 10, 299-307 (1994).</li><li>Marder, P., Maciak, R. S., Fouts, R. L., Baker, R. S., Starling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cloning+of+hybridoma+cells+for+enhanced+immunoglobulin+production+using+flow+cytometric+cell+sorting+and+automated+laser+nephelometry.">Selective cloning of hybridoma cells for enhanced immunoglobulin production using flow cytometric cell sorting and automated laser nephelometry.</a> Cytometry. 11, 498-505 (1990).</li><li>Henegariu, O., Heerema, N., Wright, L. L., Bray-Ward, P., Ward, D. C., Vance, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cytogenetic+slide+preparation:+controlled+chromosome+spreading+chemical+aging+and+gradual+denaturing.">Improvements in cytogenetic slide preparation: controlled chromosome spreading chemical aging and gradual denaturing.</a> Cytomery. 43, 101-109 (2001).</li><li>Meng, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Grenn+fluorescent+protein+(GFP)+as+a+second+selectable+marker+for+selection+of+high+producing+clones+from+transfected+CHO+cells.">Grenn fluorescent protein (GFP) as a second selectable marker for selection of high producing clones from transfected CHO cells.</a> Gene. 242, 201-207 (2000).</li><li>DeMaria, C. T., Cairns, V., Schwarz, C., Zhang, J., Guerin, M., Zuena, E., Estes, S., Karey, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+clone+selection+for+recombinant+CHO+cells+using+a+FACS-based+high-throughput+screen.">Accelerated clone selection for recombinant CHO cells using a FACS-based high-throughput screen.</a> Biotechnol. Prog. 23, 465-472 (2007).</li><li>Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+microdrop+technology+for+rapid+isolation+of+rare+an+high+producer+cells.">Gel microdrop technology for rapid isolation of rare an high producer cells.</a> Nat. Med. 3, 583-585 (1997).</li></ol>

Los autores de este artículo son empleados de Merck &amp; Co., Inc., que usan este método para la producción a gran escala de proteínas terapéuticas a partir de líneas celulares de mamíferos.

Hemos presentado una célula de fabricación automatizados línea plataforma de desarrollo que permite el aislamiento de clones de alta productividad, y en la media, mientras que asegura la estabilidad y la clonalidad clon. El compromiso de la tinción de la superficie del anticuerpo seguida de una selección de células FACSAria ™ es la clave para la obtención de clones individuales de productividad altos de anticuerpos. Nuestros resultados y otros informes 4.2 sugieren que el nivel de anticuerpos de forma transitoria que aparece en la superficie celular una buena correlación con la productividad de la célula. Por lo tanto, un anticuerpo conjugado con fluoresceína se puede utilizar para reconocer el producto asociado a la membrana y ayuda al aislamiento de los productores de alta. Por otra parte, co-expresión de genes reporteros y la tecnología de microgotas de gel se han utilizado para facilitar la selección de clones de alta producción por FACS 6-8. Además de aislar clones de alta producción a través de la FACS, otras tecnologías se han desarrollado para lograr el mismo objetivo. Estos incluyen la tecnología de enrejado CellSpot Bioscience que utiliza microspere sistemas de detección de anticuerpos y la tecnología de detección láser para identificar los clones de alta productividad y eliminar las células no deseadas, Genetix ClonePix FL y StemCell tecnologías de plataforma ClonaCell EasyPick que realizan cribado de alto rendimiento de las líneas celulares de producción mediante un sistema de detección de anticuerpos fluorescentes . Optamos por implementar el método de clonación FACS basado en el nivel de anticuerpos de superficie asociados, ya que combina la facilidad de operación, la selectividad en la productividad y clonalidad. El empleo de sistema de TECAN Freedom EVO ® de manejo de líquido aumentó significativamente el rendimiento de detección, que proporcionan la oportunidad de seleccionar clones de alto rendimiento de un grupo de células mucho más grandes. Otros instrumentos para el ensayo como HTRF, Bioforte Octeto, HPLC, etc, son todos los medios posibles de la selección de los productores de alta y descartar a los productores de baja. Mediante el seguimiento de la formación de clonar con CloneSelect Imager ™, que genera la documentación necesaria para probar la clonalidad de historia digitalizada línea celular. Clonalidad se ve confirmado por caracterizar genéticamente solo sitio la integración del transgen en el cromosoma. Un paso subclonación, que suele ser adoptadas para garantizar la clonalidad, por lo tanto puede ser eliminado. Esto le ahorrará de 4-8 semanas de tiempo para el desarrollo de líneas celulares. En resumen, las líneas celulares de calidad generados por la plataforma automatizada de alto rendimiento mostraron una alta productividad, la estabilidad de la producción y la historia documentada de la línea celular que debe satisfacer la demanda de producción a gran escala y los requisitos normativos vigentes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> BD FACS Aria ™ clasificador de células </td><td> BD Bioscience </td></tr><tr><td> CloneSelect ™ Imager </td><td> Genetix </td></tr><tr><td> TECAN Freedom EVO ® sistema de manejo de líquidos </td><td> Tecan Group </td></tr></tbody></table>

a high-throughput automated platform for the development of manufacturing cell lines for protein therapeutics

La industria biofarmacéutica de rápido crecimiento exige un rápido desarrollo de los sistemas de producción altamente eficiente y confiable para satisfacer la creciente necesidad de suministros de medicamentos. La generación de líneas celulares de producción tradicionalmente ha involucrado el manual de operaciones que requieren mucha mano de obra, de bajo rendimiento y vulnerable a errores humanos. Presentamos aquí una plataforma integrada de alto rendimiento y automatizado para el desarrollo de líneas celulares de fabricación para la producción de proteínas terapéuticas. La combinación de BD FACS Aria ™ clasificador de células, CloneSelect ™ Imager y TECAN Freedom EVO ® sistema de manejo de líquidos se ha habilitado una línea de alto rendimiento y más eficiente proceso de desarrollo celular. En esta operación, las células la producción de acogida son los primeros transfectadas con un vector de expresión que lleva el gen de interés 1, seguido por el tratamiento con un agente de selección. Las células establemente transfectadas se tiñen con fluorescencia marcado anti-IgG humana, y, posteriormente, sometido a un análisis de citometría de flujo 2.4. Células altamente productivo son seleccionados en base a la intensidad de fluorescencia y se encuentran aisladas por una sola célula de clasificación en una BD ™ FACSAria. La formación de colonias de una sola célula etapa se detectó al microscopio y una serie de vueltas del tiempo las imágenes digitales son tomadas por CloneSelect ™ Imager para la documentación de la historia de la línea celular. Después de clones individuales se han formado, estos clones fueron seleccionados para la productividad por medio de ELISA realizada en un EVO TECAN Freedom ® sistema de manejo de líquidos. Aproximadamente 2.000 - 10.000 clones pueden ser examinados por cada ciclo de funcionamiento con la configuración actual del sistema. Este enfoque integrado ha sido utilizado para generar alta producción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares para la producción de anticuerpos terapéuticos monoclonales (mAb), así como sus proteínas de fusión. Con la ayuda de diferentes tipos de sondas de detección, el método puede ser utilizado para el desarrollo de otros productos terapéuticos de proteínas o ser aplicados a otros sistemas de producción de acogida. En comparación con el procedimiento manual tradicional, esta plataforma automatizada han demostrado las ventajas de la capacidad aumentó significativamente, clonalidad asegurado, la trazabilidad en la historia de la línea celular con la documentación electrónica y la oportunidad mucho más reducida en los errores del operador.

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A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

Una plataforma automatizada de alto rendimiento para el desarrollo de líneas celulares de fabricación de proteínas terapéuticas

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K vistas.  Merck & Co., Inc. Un alto rendimiento, la plataforma automatizada de desarrollo de la fabricación línea celular para la producción de proteínas terapéuticas se describe. Implementación de BD clasificador de células FACS Aria, CloneSelect Imager y Libertad TECAN EVO sistema de manejo de líquidos se ha demostrado la capacidad de procesamiento aumentó significativamente en el desarrollo de líneas celulares con mejor calidad de línea celular y una alta reproducibilidad.

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Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Ratón enucleación del ojo por remoto de alto rendimiento fenotipificación

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Investigación

Medicina

The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation

The lower urinary tract (LUT) functions as a dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a convenient time. While storing urine, however, the bladder is exposed for prolonged periods to waste products. By acting as a tight barrier, the epithelial lining of the LUT, the urothelium, avoids re-absorption of harmful substances. Moreover, noxious chemicals stimulate the bladder's nociceptive innervation and initiate voiding contractions that expel the bladder's contents. Interestingly, the bladder's sensitivity to noxious chemicals has been used successfully in clinical practice, by intravesically infusing the TRPV1 agonist capsaicin to treat neurogenic bladder overactivity1. This underscores the advantage of viewing the bladder as a chemosensory organ and prompts for further clinical research. However, ethical issues severely limit the possibilities to perform, in human subjects, the invasive measurements that are necessary to unravel the molecular bases of LUT clinical pharmacology. A way to overcome this limitation is the use of several animal models2. Here we describe the implementation of cystometry in mice and rats, a technique that allows measuring the intravesical pressure in conditions of controlled bladder perfusion.
	After laparotomy, a catheter is implanted in the bladder dome and tunneled subcutaneously to the interscapular region. Then the bladder can be filled at a controlled rate, while the urethra is left free for micturition. During the repetitive cycles of filling and voiding, intravesical pressure can be measured via the implanted catheter. As such, the pressure changes can be quantified and analyzed. Moreover, simultaneous measurement of the voided volume allows distinguishing voiding contractions from non-voiding contractions3.
	Importantly, due to the differences in micturition control between rodents and humans, cystometric measurements in these animals have only limited translational value4. Nevertheless, they are quite instrumental in the study of bladder pathophysiology and pharmacology in experimental pre-clinical settings. Recent research using this technique has revealed the key role of novel molecular players in the mechano- and chemo-sensory properties of the bladder.

Cystometry is an efficient technique to measure bladder function of small animals in vivo. The bladder is continuously infused at rates controlled through an intravesical catheter, whereas the urethra is left free for micturition. This allows for repetitive filling and emptying of the bladder, while intravesical pressure and voided volume are recorded.

El uso de la cistometría en pequeños roedores: un estudio de la vejiga chemosensation

	The lower urinary tract (LUT) functions as a  dynamic reservoir that is able to store urine and to efficiently expel it at a  convenient time. While ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.1 Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.
To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO2, 37 &deg;C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3rd or 4th day. The spheroids become more spherical by the 6th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques. 
This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug's effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

We present a simple agarose overlay platform to grow 3D multicellular spheroids using neuroendocrine cancer cell lines. This method provides a very convenient way to examine the effect of therapeutic drugs on the neuroendocrine tumor cells. It could also help us establish human neuroendocrine tumor spheroids for cancer therapy.

Humanos neuroendocrinos líneas de células tumorales como un modelo tridimensional para el estudio de la terapia humana tumor neuroendocrino

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Administración intranasal de la terapéutica del SNC para Ratones Awake

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

Ensayo de alto rendimiento basado en células citometría de flujo para detectar anticuerpos a la N-metil-D-aspartato receptor o dopamina-2 del receptor en suero humano

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both direct and rapid analysis of therapeutic sensitivity and resistance. However, recent evidence suggests that therapeutic response is not exclusive to the inherent molecular composition of cancer cells but rather is greatly influenced by the tumor cell microenvironment, a feature that cannot be recapitulated by traditional culturing methods. Even implementation of tumor xenografts, though providing a wealth of information on drug delivery/efficacy, cannot capture the tumor cell/microenvironment crosstalk (i.e., soluble factors) that occurs within human tumors and greatly impacts tumor response. To this extent, we have developed an ex vivo (fresh tissue sectioning) technique which allows for the direct assessment of treatment response for preclinical and clinical therapeutics development. This technique maintains tissue integrity and cellular architecture within the tumor cell/microenvironment context throughout treatment response providing a more precise means to assess drug efficacy.

Ex Vivo Treatment Response of Primary Tumors and/or Associated Metastases for Preclinical and Clinical Development of Therapeutics

Established cancer cell lines and xenografts have been the mainstay of cancer research for the past several decades. However, recent evidence suggests that therapeutic response is greatly influenced by the tumor cell microenvironment. Therefore, we have developed an ex vivo analysis of primary tumor specimens for drug development purposes.

Ex Vivo respuesta al tratamiento de los tumores primarios y / o Asociados Metástasis de Preclínica y Desarrollo Clínico de Terapéutica

The molecular analysis of established cancer cell lines has been the mainstay of cancer research for the past several decades. Cell culture provides both ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ​​ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Análisis de alto rendimiento de datos de asignación óptica mediante electromap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...