Departamento de Defensa (Premio Idea W81XWH-07-0406) - Para Ulus Atasoy NIH RO1 A1080870 - Para Ulus Atasoy NIH R21 A1079341 - Para Ulus Atasoy Universidad de Missouri Fondos Institucionales - Para Ulus Atasoy

Experimento preparación Antes de comenzar el experimento, es crítico tener todos los reactivos, recipientes y utensilios libre de RNasa. Tratar cristalería con inhibidor de RNasa (RNaseZAP, Ambion) seguido de aclarado con agua tratada con DEPC. Asegúrese de que todos los reactivos se confirman como RNasa libre. 1. Preparar mRNP Lysate <ol><li> Cultivar y cosechar las células del tejido que crecen exponencialmente a producir entre 2-5 mg de proteína total de cada RIP. <ol class="lalpha"><li> Dos P150 placas de cultivo suelen ser suficientes. </li><li> Para cada RBP está investigando, el total de las cantidades celulares número y proteína debe ser optimizada para maximizar ARNm diana apropiada y las interacciones PER. </li><li> RIP para QRT-PCR análisis puede requerir lisado celular menos (aproximadamente 400 g de proteína total), debido a su amplificación y método de detección especialmente para las prácticas comerciales restrictivas alta abundancia tales como HuR, AUF1, TIAR. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Precipitar las células mediante centrifugación a 200 xg durante 8-10 min a 4 ° C, luego lavar tres veces con PBS enfriado con hielo. </li><li> Después del lavado final, dé golpecitos en la parte inferior del tubo y se resuspende el sedimento celular en volúmenes iguales de tampón de lisis preparada polisomas (PLB) con inhibidores de proteasa y RNasa. <ol class="lalpha"><li> Se recomienda medir el volumen exacto del sedimento celular. </li></ol></li><li> Suavemente pipeta de mezcla (no vórtex) para separar las matas de células lisado y se incuba en hielo durante 5 min. </li><li> Se centrifuga a 13.000 xg durante 20 min a 4 ° C para eliminar el lisado de los desechos. </li><li> Transferir inmediatamente aclaró sobrenadante a un tubo de microcentrífuga pre-enfriado. </li><li> Mantener en hielo y se almacena a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Inmediatamente la congelación completa la lisis apropiado de las células y previene la unión no deseada. Proceda con deshielo RIP muestra inmediatamente siguiente y mantener las muestras en hielo para evitar la degradación del ARN. &lt;/ Li&gt; <li> Este lisado se puede almacenar durante hasta seis meses a -80 ° C. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación ya que esto puede dar lugar a proteínas y / o degradación del ARNm. </li></ol></li><li> Cuantificar la concentración de proteínas en el lisado utilizando estándar de ensayo de proteínas de Bradford. </li></ol> 2. Proteína de la cubierta A Sepharose bolas con anticuerpos y Wash <ol><li> Pre-oleaje de proteína A Sepharose (PAS) las perlas durante la noche en tampón NT2 (volúmenes 3-4) con 5% de BSA. Almacenar a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> El almacenamiento a largo plazo de hasta varios meses a 4 ° C es posible cuando se suplementa con azida sódica al 0,1%. </li><li> Perlas de Sepharose proteína debe ser elegido sobre la base de isotipo de anticuerpo diana RBP. Las proteínas A y G, y A / G todos tienen objetivos específicos de isotipo y variar en la afinidad de destino. Proteína A Sepharose perlas se utilizaron basa en la especificidad de isotipo y la afinidad por anticuerpo de proteína HuR. </li></ol></li><li> Antes de uso, eliminar el tampón NT2 exceso, por loque las cuentas finales al ratio de amortiguación es de 1:1. </li><li> El uso de 1,5 ml RNasa libre de tubos de microcentrífuga, eliminar el 100 l de suspensión de PAS y añadir 30 g de anticuerpo para cada reacción IP individual (es decir, específica y las prácticas comerciales restrictivas de control de isotipo). </li><li> Añadir 100-200 l de tampón NT2 para anticuerpo mezcla de microesferas. <ol class="lalpha"><li> Mezcla puede conservarse durante varias semanas a 4 ° C cuando se suplementa con azida sódica al 0,1%. </li><li> Un anticuerpo isotipo o suero normal de las mismas especies conjunto se debe utilizar en paralelo como un control de anticuerpo contra ARN fondo. </li></ol></li><li> Añadir anticuerpo apropiado para mezcla de microesferas y se incuba durante la noche, dando tumbos extremo sobre extremo a 4 ° C. <ol class="lalpha"><li> Optimizar el título de anticuerpos para la proteína específica que se está investigando (g 1, 5, 10 o 30 de anticuerpo es generalmente suficiente). </li></ol></li><li> Preparar perlas recubiertas con anticuerpo inmediatamente antes de su uso mediante lavado con 1 ml deenfriado con hielo NT2 tampón 5 veces. <ol class="lalpha"><li> Lavar mezcla de perlas por centrifugación a 13.000 xg durante 1-2 min a 4 ° C. </li><li> Retire con cuidado la cantidad máxima de sobrenadante con pipeta o aspirador de mano, pero tenga cuidado de no perturbar pellet. </li><li> Lavar ayuda a eliminar el anticuerpo no unido, así como contaminantes de RNasa mezcla de anticuerpos. </li></ol></li><li> Una vez que el lavado final se ha completado, resuspender las perlas en 700 l de tampón enfriado con hielo NT2 seguido de tratamiento con diversos inhibidores de RNasa para proteger a los ARNm diana, incluyendo 10 l de RNasa a cabo a 40 U / l, 10 l de 100 mM DTT y 15 l de EDTA (15 mM). Se ajusta el volumen a 1.000 ml con tampón NT2. <ol class="lalpha"><li> Complejos de vanadilo ribonucleósidos no se utilizan debido a un efecto inhibidor de EDTA. </li></ol></li></ol> 3. Inmunoprecipitación y precipitación del ARN <ol><li> Paso preclaro Opcional:<ol class="lalpha"><li> Para reducir el fondo, las perlas y el anticuerpo de control puede ser usado para pre-lisado claro. Esto puede reducir la señal en la salida. </li><li> Este paso puede ser necesario para reducir el fondo cuando se hace IP seguido por microarray. Generalmente, no es necesario que IP seguida por QRT-PCR. </li><li> Preclear con 15 g de isotipo de control durante 30 min / 4 º C final cayendo sobre el extremo. </li><li> Añadir 50 l de perlas preswollen PAS no recubiertas con anticuerpos del paso 2.1. </li><li> Incubar 30 min / 4 º C con rotación sobre el extremo final </li><li> Centrifugar a 10.000 xg a 4 ° C. Guardar el sobrenadante por IP. </li></ol></li><li> Añadir 100 l de lisado aclarado aislado (aproximadamente 2-5 mg) a la mezcla de anticuerpos preparada. <ol class="lalpha"><li> La dilución de lisado ayudará a reducir el fondo y la unión no específica. </li><li> Cantidad de entrada de lisado puede variar dependiendo del método de detección y la abundancia de RBP or eficiencia de anticuerpo RBP como se indica en el paso 1.1.c. </li></ol></li><li> (Opcional) Añadir inmediatamente tubo suavemente agitando varias veces seguidas por breve centrifugación a 10.000 xg a 4 ° C con perlas de pellets y retirar inmediatamente 100 l de sobrenadante como una representación de entrada total de ARNm para el análisis de qPCR utilizando técnicas estándar de aislamiento de ARN. <ol class="lalpha"><li> Este paso es confirmar que la entrada de lisado de ARN es óptimo para IP y sólo debe realizarse como un paso de verificación o como un paso de solución de problemas siguiendo RIP con pobres resultados de ARN. </li></ol></li><li> Wrap tubo en parafilm para asegurar el cierre hermético y se incuba a 4 ° C durante 2 a 4 horas, cayendo de punta a punta. <ol class="lalpha"><li> Timing en incubación debe ser optimizado basado en la abundancia de destino y debe reducirse al mínimo para evitar reordenamiento complejo o degradación. Para algunas prácticas comerciales restrictivas incubaciones más cortos pueden ser más óptima. </li></ol></li><li> Pellet cuentas a 5.000 XGFo 5 min a 4 ° C y guardar el sobrenadante para el análisis del potencial por Western blot. Tienda de alícuotas a -80 ° C. <ol class="lalpha"><li> Las alícuotas de sobrenadante con altas cantidades de proteína diana residual puede indicar un fallo de la proteína a ser precipitada por perlas de sefarosa. </li></ol></li><li> Como se ha descrito anteriormente, lavar perlas de 5 veces con 1 ml de tampón enfriado con hielo NT2 y centrifugación (5.000 xg durante 5 min a 4 ° C) y luego eliminar el sobrenadante con pipeta de mano o un aspirador. <ol class="lalpha"><li> Métodos de lavado más rigurosas pueden ser utilizados con el fin de reducir el fondo, completándolo NT2 tampón con desoxicolato de sodio, urea o SDS. </li><li> Mantener las muestras en hielo tanto como sea posible y trabajar con rapidez para minimizar la degradación de ARNm diana. </li></ol></li><li> Opcional: Guardar una pequeña alícuota (10%) de mezcla de perlas o ejecutar una muestra adicional en paralelo para comprobar la eficacia de IP proteína diana usando análisis de transferencia Western.</li></ol> 4. DNasa y Tratamientos proteinasa K <ol><li> Después del lavado, se resuspenden las perlas con 100 l de tampón NT2 suplementado con 5 l de RNasa libre de DNasa 1 (2 U / l). </li><li> Mantener a 37 ° C durante 5-10 minutos. Añadir 1 ml de tampón NT2 y centrifugar a 5.000 xg durante 1 min a temperatura ambiente. <ol class="lalpha"><li> Un pequeño (~ 10%) alícuota de perlas se puede utilizar para comprobar la eficiencia de IP por análisis de SDS-PAGE. </li></ol></li><li> Resuspender el pellet en 100 PAS l tampón NT2, 5 l de proteinasa K (10 mg / ml), y 1 l 10% de SDS. </li><li> Incubar la mezcla resuspendida de cuentas durante 30 min a 55 ° C en un baño de agua, agitando suavemente en cada 10 min. <ol class="lalpha"><li> Proteinasa K ayudará en la liberación de los componentes RNP. </li></ol></li><li> Pellets perlas a 5.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y recoger el sobrenadante (~ 100 l). </li><li> Añadir 200 l NT2 tampón a las perlas, centrifuge 5.000 xg durante 2 min a TA, recoger el líquido sobrenadante (~ 200 l), y perlas de descarte. </li><li> Combine sobrenadantes (100 l y l 200) y añadir 300 l capa inferior de ácido fenol-CHCl 3. </li><li> Vortex, 1 min RT (o 37 ° C en agitador) y se centrifuga a 16.000 xg a TA durante 1 min. </li><li> Tomar 250 l de capa superior (NO interrumpir interface), se añaden 25 l de acetato de sodio a pH 5,2, 625 l 100% ETOH y 5 glycoblue l, y mezclar bien. </li><li> Almacenar durante la noche a -20 ° C. <ol class="lalpha"><li> Para asegurar la recuperación adecuada de ARN, la adición de glycoblue aumentará la visibilidad de la ARN precipitado al actuar como una molécula portadora. </li></ol></li><li> El día siguiente, los tubos se mezcla por inversión 3-5 veces, centrifugado a 12.000 xg a 4 ° C durante 30 min y descartar el sobrenadante. </li><li> Añadir 1 ml de EtOH al 70% a la pastilla azul y mezclar por inversión o agitación con vórtex. </li><li> Centrifugar 12.000 xg a 4 ° C durante 2 min. </li><li> Discard sobrenadante y centrifugar 12.000 xg durante 1 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar cualquier ETOH residual 70% con una pipeta y el aire de gránulo seco a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Resuspender en 20-40 l de RNasa / DNasa libre de agua o de otro volumen apropiado según sea necesario. <ol class="lalpha"><li> Muestra está ahora lista para otras aplicaciones posteriores tales como QRT-PCR o microarrays. </li><li> Espectrofotometría Nanodrop se puede utilizar en la evaluación de la concentración de la muestra, sin embargo, con preciosas muestras, puede ser beneficioso para evitar muestras nanodropping como puede ser un desperdicio y relativamente inexacta. Sugerimos a normalizar las muestras transcripciones de genes de limpieza para evaluar la pureza y la eficiencia de rendimiento IP para muestras preciosas o baja. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos Si el procedimiento se optimiza y se realiza correctamente, la inmunoprecipitación debe producir enriquecimiento significativo de mRNA objetivos. Típicamente, Dependiendo de la RBP y su ARNm objetivo (s), vemos enriquecimiento de aproximadamente 10 - a 50-veces cuando se evaluó mediante qRT-PCR. Muchos objetivos de las prácticas comerciales restrictivas pueden ser descubiertos de forma masiva mediante el análisis de microarrays. Sin embargo, este método es más sensible a la degradación en comparación con QRT-PCR. Dependiendo de la RBP, el número de objetivos y la eficiencia de la reacción, microarray puede revelar cientos de nuevas dianas, o sólo puede descubrir unos pocos, si los hay. Por ejemplo, uno de los mejor caracterizados ARN proteínas de unión HuR, post-transcriptionally regula la expresión y traducción de muchos genes fisiológicos importantes 1, 2. Aislamiento de la HuR-ribonucleo-complejo a través de RIP-Chip mama en las líneas celulares de cáncer, por ejemplo, reveló el enriquecimiento de varios objetivos importantes Hur conocidos, incluyendo β-actina utilizando QRT-PCR como se muestra en la figura 1. En ambas líneas celulares de cáncer de β-actina se enriquece 12 - a 15-veces. Por lo general, cuando se realiza correctamente, vemos un significativo enrichment de β-actina en una variedad de líneas celulares. Sin embargo, si el RIP no revela ningún enriquecimiento significativo para la β-actina esto indica un problema con el PIR y el procedimiento puede ser necesario repetir. Por otra parte, el análisis de microarrays de muestras inmunoprecipitadas de estas líneas celulares reveló subconjuntos distintos de expresión de los objetivos de Hur en el receptor de estrógeno (ER diferente) de células positivas MCF-7 de cáncer en comparación con ER negativos MB-231 líneas celulares de cáncer de mama como se muestra en la Figura 2 1. Estos objetivos se dividen en varias categorías: objetivos Hur conocidos y desconocidos que estaban asociados ya sea o no relacionado con el cáncer. Por ejemplo, CALM2 y CD9 son ambos genes del cáncer que no habían sido identificados como objetivos Hur. Uso del microarray y confirmar con QRT-PCR, CALM2 y CD9 se encontró que 5 - a 180-veces enriquecido en el sedimento HuR indicando una interacción entre la proteína prominente HuR y estos genes objetivo. <img src = &quot;/ files/ftp_upload/3851/3851fig1.jpg&quot; alt = &quot;Figura 1&quot; /&gt; Figura 1. Inmunoprecipitación y RIP en MB-231 (ER-) y MCF-7 (ER +) células de cáncer de mama. Inmunoprecipitaciones se realizaron a partir de MB-231 o MCF-7 lisados ​​celulares usando anticuerpos anti-Hur anticuerpo monoclonal (3A2) y de control de isotipo IgG1. A. propiedad intelectual occidental de Hur reveló banda esperaba tamaño detectado por 3A2. Panel de la derecha revela cantidades de HuR en lisados ​​de entrada utilizado de ambas líneas celulares, con β-tubulina como control de carga. B. Verificación por cuantitativos RT-PCR mostró quince y once veces enriquecimiento de β-actina, un objetivo Hur conocido, en los proyectos de investigación 3A2 de MB-231 y MCF-7, respectivamente. Todos los valores se normalizaron a ΔΔCT GAPDH. Los experimentos se realizaron por duplicado (n = 2). <img src="/files/ftp_upload/3851/3851fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Hur RIP-CHIP identifica distintos perfiles genéticos en ER + y ER-células de cáncer de mama.Hur inmunoprecipitaciones se realizaron a partir de MB-231 o MCF-7 de células lisados ​​utilizando anticuerpo HuR y control de isotipo IgG1 hibridó a Illumina matrices Sentrix (47.000 genes). Las señales de control se restaron. Los resultados representan los datos acumulados de 12 conjuntos diferentes. Los experimentos se realizaron por triplicado (n = 3) para cada línea celular con los controles correspondientes. Las escalas son log2.

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	<li>Calaluce, R., Gubin, M. M., Davis, J. W., Magee, J. D., Chen, J., Kuwano, Y., Gorospe, M., Atasoy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+binding+protein+HuR+differentially+regulates+unique+subsets+of+mRNAs+in+estrogen+receptor+negative+and+estrogen+receptor+positive+breast+cancer.">The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.</a> BMC Cancer. 10, 126-140 (2010).</li><li>Gubin, M. M., Calaluce, R., Davis, J. W., Magee, J. D., Strouse, C. S., Shaw, D. P., Ma, L., Brown, A., Hoffman, T., Rold, T. 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Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Debido a la naturaleza de este experimento, la optimización y la experiencia serán las únicas maneras garantizadas para adquirir satisfactoriamente los resultados previstos. En muchas etapas de este procedimiento, la temperatura y el manejo eficiente de los reactivos y los productos son de importancia crítica. La correcta planificación y ejecución de la técnica ayudará a asegurar que el experimento se llevó a cabo en un plazo adecuado a las temperaturas óptimas recomendadas. Un problema importante con los experimentos de aislamiento de ARN es la sensibilidad del ARN a la degradación por RNasas. Todos los reactivos deben estar libre de RNasa y almacenarse o usarse en RNasa libre de contenedores. Este es un paso crítico para asegurar la integridad de la muestra de ARNm. Incluso cuando el experimento se lleva a cabo correctamente, sin embargo, el resultado deseado no se puede lograr debido a la naturaleza de la interacción entre el RBP y sus mRNAs diana. Un problema potencial es que tiene una baja o incluso ninguna señal desde el ARN aislado por RIP-Chip.Aunque puede haber señal partir de ARN total, esto puede ser el resultado de la inadecuada de proteínas de unión está empujado hacia abajo por las perlas. La etapa de resolución de problemas primero es para confirmar que el lisado celular que se utiliza tiene una expresión adecuada de la RBP específico. Tras la confirmación, la proteína puede aislarse después de la última NT2 lavado y se resuspendieron en tampón de Laemmli u otro tampón apropiado de desnaturalización y se calentó a 95 º C durante 5 min. El análisis Western blot se pueden utilizar en estas muestras en coordinación con lisado de entrada, así como controles negativos para asegurar suficiente tirar hacia abajo de la proteína asociada. Además, debido a lisis de la célula es necesaria para acceder a estos componentes, el potencial para las interacciones anormales y no deseados entre las proteínas normalmente separados y el ARNm se puede introducir. Estas interacciones podrían unirse y &quot;disfrutar&quot; de sus mRNAs diana o proteínas de unión a través de interacciones no específicas. Además, las proteínas en estos co variandonditions puede doblar en múltiples variaciones y sus motivos de unión puede llegar a ser inaccesible para sus mRNAs diana, prevenir sus interacciones. Ambos reforzar la importancia de trabajar de manera eficiente así como la utilización de las temperaturas óptimas enumerados para limitar estas interacciones no deseadas. Adicionalmente, la optimización de las condiciones de lavado para cada proteína diana específica será crítico para maximizar la pureza de la interacción. Condiciones de lavado más rigurosas pueden ser necesarios. Por ejemplo, el tampón de lavado puede ser suplementado con SDS o una cantidad apropiada de urea para reducir las interacciones no específicas y de fondo en la señal de salida. Esto será completamente dependiente de RBP objetivo del experimentador, así como el ARNm diana en sus condiciones fisiológicas únicas. Algunas condiciones no será adecuado para ciertas herramientas de análisis de ARNm, que deben tenerse en cuenta en la preparación de muestras. Por último, aunque RIP tiene éxito en el enriquecimiento de ARN-RBP interacciones, un problema bien conocido con RIP (CHIP) método es la incapacidad para identificar los dominios de unión específica del RBP sobre los objetivos de mRNA transitorios. Varios enlazan transversal técnicas se pueden utilizar seguido de RIP para aislar objetivos únicos de secuencia, sin embargo, el uso de UV de onda corta tiende a conducir a daño por ácido nucleico. Un nuevo método conocido como PAR-CLIP, o ribonucleósido reticulación fotoactivable y immuoprecipitation, emplea UV de onda larga para incorporar tiouridina en ARN naciente que permiten la identificación de los únicos sitios de unión de las interacciones ARN tanto estables y transitorios. En general, RIP-Chip se ha establecido como una excelente herramienta para aislar y estudiar las interacciones entre proteínas de unión al ARN y sus objetivos de mRNA por nuestro grupo, así como muchos otros grupos de investigación. Aunque de naturaleza sensible y práctica, la correcta ejecución de este procedimiento producirá el aislamiento de estos complejos RNP, que hasta hace poco, han sido INACCessible para el descubrimiento y el análisis.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 1 M de ditiotreitol </td><td> Pescador </td><td> BP172-5 </td><td> TDT </td></tr><tr><td> DNasa 1 </td><td> Ambion </td><td> 2235 </td><td> RNasa libre </td></tr><tr><td> Ácido etilendiamina Tetraccetic </td><td> Pescador </td><td> BP118-500 </td><td> EDTA </td></tr><tr><td> El glucógeno </td><td> Ambion </td><td> 9516 </td><td></td></tr><tr><td> 1 HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td><td> pH 7,0 </td></tr><tr><td> Igepal Nonidet P-40 </td><td> USB </td><td> 78641 </td><td> NP40 </td></tr><tr><td> 1 M KCl </td><td> Pescador </td><td> BP366-500 </td><td></td></tr><tr><td> 1 M MgCl 2 </td><td> Pescador </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td><td> * Ver más abajo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampón de Lisis polisomas </td><td> * Ver más abajo </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Proteasa comprimidos cóctel inhibidor </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td></td></tr><tr><td> Proteína A Sefarosa </td><td> Sigma </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinasa K </td><td> Pescador </td><td> BP1700-100 </td><td></td></tr><tr><td> Fuera RNasa inhibidor de RNasa </td><td> Invitrogen </td><td> 10777-019 </td><td> 40 U / l </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> Pescador </td><td> BP358-212 </td><td></td></tr><tr><td> Dodecil sulfato de sodio </td><td> Pescador </td><td> BP166-500 </td><td> SDS </td></tr><tr><td> 1 M Tris-HCl </td><td> Pescador </td><td&gt; BP153-500 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596-026 </td><td></td></tr><tr><td> Complejos ribonucleósido vanadilo </td><td> New England Labs </td><td> S1402S </td><td> VRC </td></tr></tbody></table> <table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo Workup </td></tr><tr><td> Preparar los reactivos en RNasa / DNasa libre, tratada con DEPC cristalería </td></tr><tr><td> Tampón de lisis polisomas </td></tr><tr><td> 100 mM KCl </td></tr><tr><td> 5 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM de HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 0,5% de NP40 </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr><tr><td> 100 unidades / ml de RNasa Salida </td></tr><tr><td> 400 mM VRC </td></tr><tr><td> Inhibidor de proteasa cóctel comprimidos </td></tr><tr><td> 5 ml de tampón de lisis polisomas </td></tr><tr><td> Añadir 50 l de 1 M de HEPES (pH 7,0) </td></tr><tr><td> 500 l de 1 M KCL </td></tr><tr><td> 25 l de 1 M de MgCl 2 </td></tr><tr><td> 25 l de NP40 </td></tr><tr><td> 4,7 ml de RNasa libre de DNasa H 2 O </td></tr><tr><td> 50 l de 1 M DTT </td></tr><tr><td> 12,5 l de 100 U / ml de RNasa Salida </td></tr><tr><td> 200 l cóctel inhibidor de la proteasa (disuelto según fabricante) </td></tr><tr><td> 10 l 200 mM VRC (en el momento de uso) </td></tr><tr><td> NT2 Buffer </td></tr><tr><td> 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 150 mM NaCl </td></tr><tr><td> 1 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 0,05% de NP40 </td></tr><tr><td> 1 L de tampón NT2 </td></tr><tr><td> 50 ml de Tris (pH 7,4) </td></tr><tr><td> 30 ml de NaCl 5 M </td></tr><tr><td> 1 ml 1 M MgCl <sub&gt; 2 </td></tr><tr><td> 500 l NP40 </td></tr><tr><td> 820 ml de RNasa libre de DNasa H 2 O </td></tr></tbody></table>

method for the isolation and identification of mrnas, micrornas and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts using rip-chip

Como resultado del desarrollo de la secuenciación de alto rendimiento y análisis de microarrays eficiente, el análisis global de la expresión génica se ha convertido en una forma fácil y fácilmente disponible de recogida de datos. En la investigación de muchos modelos de enfermedad y sin embargo, los niveles de estado estacionario de ARNm del gen diana no siempre se correlacionan directamente con equilibrio los niveles estatales de proteínas. Regulación post-transcripcional de genes es una probable explicación de la divergencia entre los dos. Impulsada por la unión de las proteínas de unión a ARN (RBP), post-transcripcional regulación afecta a la localización del mRNA, la estabilidad y la traducción mediante la formación de una ribonucleoproteína (RNP) con complejo ARNm diana. La identificación de estos desconocidos objetivos de mRNA de novo a partir de extractos celulares en el complejo de RNP es fundamental para comprender los mecanismos y funciones de la RBP y su efecto resultante en la producción de proteínas. Este protocolo describe un método denominado RNP inmunoprecipitación-microarray (RIP-Chip), que permite la identificación de smRNAs ESPECÍFICAS asociado en el complejo ribonucleoprotein, bajo las cambiantes condiciones experimentales, junto con las opciones para optimizar aún más un experimento para el investigador individual. Con esta herramienta experimental importante, los investigadores pueden explorar los intrincados mecanismos asociados con la regulación post-transcripcional de genes, así como otras interacciones ribonucleoprotein.

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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Método para el aislamiento e identificación de mRNAs, microRNAs y componentes proteicos de ribonucleoprotein complejos de extractos celulares usando RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

method-for-isolation-identification-mrnas-micrornas-protein

Research

JoVE Journal

Biology

27.4K vistas.  University of Missouri. Un paso a paso el protocolo para aislar e identificar los complejos de ARN asociados a través de RIP-Chip.

Video: Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical analysis. Egg lysis and differential centrifugation are used to prepare the crude extract which in turn in used to prepare fractionated extracts and light membrane preparations.

Preparación y fraccionamiento de los extractos de huevo Xenopus laevis

Crude and fractionated Xenopus egg extracts can be used to provide ingredients for reconstituting cellular processes for morphological and biochemical ...

Investigación

Biología

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Utilizando el sistema de fraccionamiento GELFREE 8100 de peso molecular basado en Fraccionamiento con la recuperación de la fase líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Aislamiento de Vaso sanguíneo derivado Multipotentes Precursores de músculo esquelético humano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Estudiar el Sistema de Control de Calidad de la Proteína<em&gt; D. discoideum</em&gt; Uso de imágenes de células vivas con temperatura controlada

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...