Damos un agradecimiento especial a Yves Couder útil para muchos debates. Agradecemos a Atef Asnacios para la calibración de los voladizos y discusión. Damos las gracias a Lisa Willis, Elliot Meyerowitz, y Oliver Hamant para la lectura crítica. Este trabajo fue financiado en parte por la Human Frontier Science Program RGP0062/2005-C subvención; la Agence Nationale de la Recherche proyecta&#39;&#39; Growpec&#39;&#39; y&#39;&#39; Mechastem&#39;&#39;.

1. Preparar cristal diapositivas para la Muestra de montaje <ol><li> Preparar imbedding medios de agarosa: 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión en el 10% de manitol (en agua). </li><li> El uso de un instrumento de metal fuerte (por ejemplo, la punta de perforación, cal), grabar un área de 0,5 x 0,5 cm en el centro de un portaobjetos de vidrio microscopía. O en lugar, pegar un pequeño trozo de lámina de vidrio (aproximadamente 20 x 200 m) a la lámina de vidrio con pegamento Araldite. NOTA: Este hace rugosa la superficie a fin de facilitar la adhesión de la agarosa para garantizar que los palos de los medios de comunicación de agarosa o correcciones a la diapositiva. Esta diapositiva se puede reutilizar. </li><li> Coloque una gota de aproximadamente 20 l de imbedding medios de agarosa en la región grabada al agua fuerte de la lámina de vidrio. Esto da una película delgada de agarosa. </li><li> Guarde la placa de vidrio en una caja húmeda y esperar a que los medios de comunicación de agarosa para solidificar. </li></ol> 2. Disecante y montaje Muestras de meristemas <ol><li> Microdissect meristemos para imagi confocalng: quitar las yemas florales, uno por uno desde el tallo tirando hacia abajo con pinzas ultrafinas. Es importante eliminar todas las yemas florales hasta los brotes que no presentan sépalos (es decir, los primordios P1 14). </li><li> Uso de una hoja de afeitar o la punta de las pinzas, cortar el meristemo de distancia desde el vástago. El corte debe ser paralelo a la región de la superficie meristemo que se va a medir con el AFM. El ápice obtenido debe estar entre 300 my 600 m de alto para caber debajo de la punta del AFM. </li><li> Empuje el ápice en la película de los medios de agarosa preparado en el paso 1.1.4. Elija una posición sobre el portaobjetos de vidrio / agarosa y empuje suavemente de forma que el meristemo es tanto directamente en contacto con el portaobjetos de vidrio y sobresale hacia fuera de la agarosa. Es crucial para posicionar el meristemo en la agarosa dentro de los pocos segundos que siguen a su corte del tallo. NOTA: Este es con el fin de evitar que el meristemo de secado. En esta etapa, el meristemo será de pie en un CRACk debido a que la agarosa se fracturó en la aplicación de presión. </li><li> Preparar varios meristemas de esta manera para formación de imágenes por lotes, siempre que sean de la misma altura y están posicionados de menos de 500 micras una de otra en la diapositiva. Mantenga los meristemos preparados en la caja húmeda mientras la disección de más muestras. NOTA: Se limita la variación procedente de la calibración. Idealmente 2 muestras de cada condición se podrían preparar y medidos al azar. Hasta el momento no hay efecto observado de imágenes por lotes en la medición (el estrés inducido por la respuesta). Esto podría ser gracias a la dilución de las moléculas de señalización de estrés en el agar y / o la solución de montaje. Alternativamente, la respuesta de estrés es la misma independientemente de la cantidad de muestra preparada. </li><li> Antes de pasar al siguiente paso, asegúrese de que la frontera entre el meristemo y las yemas florales es seco. Si no es así, retire suavemente el exceso de agua con papel de filtro. Esto debe evitar que en la siguiente etapa de que el derretidoagarosa inunda la muestra debido a las fuerzas de capilaridad. </li><li> Con una pipeta de 20 l, añadir una cantidad suficiente de montaje de agarosa derretida para rellenar la grieta creada en el paso 1.2.3. y para rodear cada meristemo. La agarosa debe alcanzar el nivel de la cicatriz de la yema floral eliminado (primordio). Para lograr esto, puede ser necesario añadir agarosa en cada extremo de la grieta. </li><li> Cuando se añade la agarosa, se inundará de forma rápida dentro de la grieta; con la pipeta, chupar parte del fundido de montaje de agarosa para asegurar que el meristemo es el punto más alto en la diapositiva. Esto fija el meristemo de manera que no se pueda mover durante la exploración. </li></ol> 3. Montaje de raíces o hipocótilo Muestras <ol><li> Para raices e hipocotilos, sin disección es necesario. En la película fina de agarosa en el portaobjetos de vidrio preparado, hacer un surco bien directamente por encima de un grabado en el vidrio oa lo largo de una lámina de vidrio. Coloque la raíz o del hipocotilo en esta ranura asegurándose de que está en contacto con lavidrio a lo largo de toda su longitud. </li><li> Antes de pasar al siguiente paso, asegúrese de que la muestra está seca en su superficie. Si no es así, retire suavemente el exceso de agua con papel de filtro. </li><li> Añadir derretida montaje agarosa alrededor de la muestra como en el paso 1.2.6. </li></ol> 4. Preparación AFM y Calibración de la sensibilidad (para una JPK Nanowizard AFM) <ol><li> Montar un voladizo en el AFM. El voladizo debe ser montado con penetrador de forma redonda. El radio determinará la x, y, z resolución y la profundidad de penetración en el que la medición precisa podría ser archivada. <ol><li> Para tomar mediciones de meso-escala nanométrica en la superficie de la epidermis, use un penetrador redondo de 50 NM de radio; para tomar medidas de mesoescala, use un micras radio penetrador ronda 0.5; para tomar mediciones a microescala (a través de 2-3 células), utilice un penetrador ronda 2,5 m de radio. </li></ol></li><li> Coloque el láser en la punta del cantilever. Alinear el láser para el mediodel captor con el espejo. </li><li> Coloque un vaso limpio bajo el AFM. NOTA: el siguiente está destinada a transformar la señal de la posición del láser en el receptor AFM en una deformación de la palanca y, mediante la evaluación de la constante elástica del cantilever, para traducirlo en una fuerza. </li><li> Enfoque con un &quot;punto de ajuste&quot; fuerza objetivo de 1 V. </li><li> Seleccione &quot;espectroscopia de fuerza&quot;. Haga una muesca estableciendo el &quot;punto de referencia relativo&quot; máxima a 2 V, el &quot;ampliar la velocidad&quot; a 40 m / s, y la &quot;longitud z&quot; a 5 micras. </li><li> En el menú &quot;Calibración de negocios&quot;, seleccionar la parte lineal de la curva forward para adaptarse a la sensibilidad con el botón &quot;seleccionar la cocinar&quot;. El &quot;punto de ajuste relativa&quot; debe transformarse de &quot;V&quot; en &quot;metros&quot;. </li><li> En el menú &quot;Gestor de calibración&quot;, seleccione &quot;constante de resorte&quot; para evaluar la elasticity del cantilever usando las fluctuaciones térmicas. Pulse el botón &quot;Ejecutar&quot; para obtener el diagrama de densidad espectral del cantilever. Encuentre el pico de resonancia con la frecuencia más baja. Ajuste mediante el botón &quot;seleccionar la cocinar&quot;. NOTA 1: Para más detalles sobre la sintonía fluctuaciones térmicas, leer Cook et al 15. NOTA 2: Es preferible utilizar un método directo para evaluar la elasticidad de la viga en voladizo con una referencia (o material con rigidez conocida). El que se utiliza aquí fue amablemente donada por Atef Asnacios 16. </li><li> Añadir 200 l de solución de manitol al 10% debajo de la punta en voladizo. Vuelva a alinear el láser para el medio de la captor usando el espejo. </li><li> Vuelva a calibrar la sensibilidad: en el menú &quot;Calibración gerente&quot;, haga clic en el botón &quot;desconocido&quot;; repita los pasos 2.3 hasta 2.5. </li></ol> . 5 Adquisición de Datos: Aparente Módulo de Young Cartografía <ol&gt; <li> Coloque las muestras montadas debajo de la AFM y añadir una gota de 500 l de solución de manitol al 10% sobre la muestra. La solución de manitol plasmolyzes las células en cuestión de minutos. </li><li> Enfoque con una fuerza de objetivo (&quot;punto&quot;), de 20 nN (&quot;punto de ajuste&quot; no debe ser más de 3 V) </li><li> Sangría con un &quot;punto de referencia relativo&quot; de 200 nN, un &quot;extender velocidad&quot; de 40 m / s, y &quot;longitud z&quot; de 5 micras. </li><li> Ajuste el &quot;punto de referencia relativo&quot; con el fin de obtener una sangría de 100 nm para la 200 nm montado en voladizo o 0,5 m para el montado en voladizo 1 m / 5 m. </li><li> En el modo &quot;mapeo de la fuerza&quot;, seleccione una región a escanear: para meristemos, 70 micras x 70 micras con una resolución (&quot;píxeles&quot;) de 64 x 64; para hipocotilos y raíces, 100 m x 100 m con una resolución de 64 x 64. </li><li> Pulse SCAN para iniciar los experimentos. Guarde la salida. </li&gt; </ol> . 6 Análisis de Datos: Cálculos aparente módulo de Young <ol><li> Abrir el archivo de datos en el software de análisis de datos. </li><li> Seleccione &quot;procesamiento por lotes&quot; para aplicar el mismo análisis a todas las curvas de un solo mapa. </li><li> Seleccionar &quot;corregir la altura de la flexión del voladizo&quot; de modo para extraer la profundidad de penetración. </li><li> Seleccione &quot;módulo en forma de función de Young&quot; que se asume que la fuerza es proporcional al área de sangría. Ajuste la &quot;plena forma&quot; para parabólicos para suponer que la forma de sangría es una parabólica. </li><li> Indique el radio de la punta. </li><li> Seleccionar preferentemente la curva de &quot;retracción&quot; para el análisis, ya que es menos sensible a la topografía de la curva de &quot;extender&quot;. Sin embargo, si hay adherencia significativa de la sonda durante la &quot;retracción,&quot; utilizar la curva de &quot;extender&quot;, que es insensible a pegarse. </li><li> Conjuntola relación de Poisson de 0,5. Presione en analizar y guardar el resultado. </li></ol>

<ol>
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A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En las plantas, el cambio de propiedades mecánicas juegan un papel importante en dirigir el crecimiento y la morfogénesis. Hasta la fecha no ha habido un gran progreso en el descubrimiento de las redes genéticas y químicas que controlan el crecimiento de las plantas, pero nuestro conocimiento de cómo estas redes contribuyen y se ven afectados por los cambios en las propiedades mecánicas es rudimentaria. Este método nos debería permitir a llenar este vacío, y por lo que debe ser de gran interés para los cientí...

El crecimiento de las plantas se logra por la expansión coordinada de las paredes celulares rígidas que rodean a cada célula del organismo. La acumulación de pruebas indica que es a través de la modificación de la química de la pared celular que las plantas locales controlan esta expansión. La expansión se piensa que es impulsado principalmente por la tensión en las paredes de las células, causados ​​por la alta presión de turgencia de la célula; Esta respuesta cepa a la presión de turgencia se rige por las propiedades mecánicas de las paredes celulares 1. Poco se sabe de estas propiedades mecánicas y la forma en que cambia durante el desarrollo. Además, se sabe poco de cómo se controlan estas propiedades mecánicas y si evaluaciones contribuyen a alterar la química de la pared celular de una manera que está aparentemente coordinados a través de un tejido. Si vamos a entender la conexión entre los cambios químicos y mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo, y en última instancia, cómo estas interacciones microscópicas gobiernan una plantaSe requiere &#39;s crecimiento macroscópico, un método que puede controlar las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos en la escala celular o tisular. El método de microscopía de fuerza atómica (AFM) descrito aquí, que se basa en micrómetros o nanómetros compresiones de tejido o indentaciones, fue desarrollado precisamente para medir las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos simultáneamente en resoluciones subcelulares y a través de regiones enteras de tejido. Otros métodos tienen ya sea una resolución que es demasiado bajo o demasiado alto: el extensómetro sólo es capaz de medir las propiedades mecánicas medias de un tejido completo en la escala milimétrica 2-4, una escala que sea, por ejemplo, demasiado grande para medir los primeros eventos en organogénesis; la microindenter puede efectuar mediciones en resolución subcelular en la escala nanométrica, pero se limita a la medición de las células aisladas y no grupos de células u órganos 5-7. Con la AFM, la requierend tejido, celular, y las resoluciones subcelulares se pueden alcanzar 8-10. Recientemente, varios protocolos han sido desarrollados específicamente para medir la mecánica de los tejidos de plantas que también se podrían utilizar 11, 12. Vamos a presentar aquí la forma de evaluar la elasticidad del tejido a través de la medición del módulo de Young de la aparente 13. El módulo de Young se usa comúnmente para describir la rigidez de un material. Durante pequeña deformación la fuerza requerida para deformar un material es proporcional al área de indentación. El módulo de Young es este coeficiente. En el caso de un material homogéneo continua el mismo coeficiente se mide independientemente del tipo de indentación (tamaño y forma), pero va a cambiar con la velocidad de la medición. En el caso de la compleja estructura del tejido de las plantas, hemos observado hasta el momento que la fuerza es proporcional a la deformación que permite la determinación deun coeficiente de proporcionalidad que denominamos &quot;módulo de elasticidad aparente&quot;. En contraste a partir de medios continuos en las plantas, este módulo de Young aparente es sensible al tamaño de la indentación. No corresponde a la joven módulos de una pared celular pura. Es mejor describe la elasticidad del andamiaje de la pared celular del tejido.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

Se describe un método recientemente desarrollado para medir las propiedades mecánicas de las superficies de los tejidos vegetales utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM) micro / nano-indentaciones, para un JPK AFM. En concreto, en este protocolo se mide el módulo aparente de Young de las paredes celulares en resoluciones subcelulares entre regiones de hasta 100 m x 100 m en los meristemos florales, hipocotilos y raices. Esto requiere una cuidadosa preparación de la muestra, la correcta selección de los micro-penetradores y profundidades sangría. Para tener en cuenta las propiedades de la pared celular sólo, las mediciones se realizan en soluciones altamente concentradas de manitol con el fin de plasmolizar las células y por lo tanto eliminar la contribución de la presión de turgencia de la célula. En contraste con otras técnicas existentes, mediante el uso de diferentes penetradores y profundidades de indentación, este método permite mediciones multiescala simultánea, <em&gt; Es decir, en las resoluciones subcelulares ya través de cientos de células que comprende un tejido. Esto significa que ahora es posible caracterizar espacialmente-temporalmente los cambios que tienen lugar en las propiedades mecánicas de las paredes celulares durante el desarrollo, lo que permite que estos cambios sean correlacionados con el crecimiento y la diferenciación. Esto representa un paso clave para entender cómo los cambios celulares microscópicas coordinadas provocar eventos morfogenéticos macroscópicas. Sin embargo, varias limitaciones siguen siendo: el método sólo se puede utilizar en bastante pequeñas muestras (alrededor de 100 m de diámetro) y sólo en los tejidos externos; el método es sensible a la topografía de tejido; mide sólo algunos aspectos de las propiedades mecánicas complejas del tejido. La técnica se está desarrollando rápidamente y es probable que la mayoría de estas limitaciones se resolverán en un futuro próximo.

En la Figura 1 se presenta típicos mapas móduli jóvenes de meristemos florales (Figuras 1A y 1B), hipocotilos jóvenes y mayores (figuras 1C-F), y meristemas de la raíz (Figura 1G y 1H). En todos los experimentos el penetrador es semiesférica, pero su radio es diferente por lo que las diferentes resoluciones espaciales se pueden lograr figuras 1C y 1D muestran resultados típicos p...

Watch this Scientific Journal Video about AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions at JoVE.com

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K vistas.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Video: AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Investigación

Biología

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Aislamiento de las células murinas de la válvula endoteliales

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensión y calcio Dual Channel Mapping óptico de Cultivadas HL-1 auricular miocitos monocapa

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La disección de la Auditivo Bulla en ratones postnatales: Aislamiento de los huesos del oído medio y el análisis histológico

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

Super-Resolución De Imágenes De Células Vivas De Estructuras Subcelulares

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

Cuantificación de las densidades celulares y propiedades antigénicas mediante levitación magnética

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...