1. Tirando Micropipetas de vidrio Equipamiento: Micropipetas Puller, Microforge. Vidrio: Boroscillicate capilares de vidrio (~ 1,5 mm de diámetro externo, ~ 1,4 mm de diámetro interno). <ol><li> Micropipetas se extraen utilizando el mismo enfoque básico que se utiliza para preparar microelectrodos de vidrio para las grabaciones de electrofisiología. Brevemente, un capilar de vidrio se calienta en el medio y cuando el vidrio comienza a fundirse las dos mitades del capilar se separan generando dos micropipetas. Múltiples extractores comerciales están disponibles para llevar a cabo este proceso van desde extractores verticales relativamente simples que utilizan la gravedad para tirar de las dos pipetas aparte a la altamente sofisticados extractores horizontales que ofrecen múltiples opciones programables para variar la velocidad y otros parámetros de la atracción. Ambos tipos de extractores se usaron en nuestros experimentos. </li><li> Requisitos para la geometría de la punta de la pipeta: Las puntas de las pipetas utilizadas en estos experimentos suelen oscilar entre 2 a 6 m de diámetro externo en función del tamaño de la célula. Otro parámetro importante es la forma de la punta, la cual debe ser aproximadamente un tubo cilíndrico (ver Figura 1). Esto se puede conseguir mediante la optimización de los parámetros de la tracción y la verificación de la forma de la punta bajo el microscopio hasta que la forma deseada. La longitud óptima de la espiga de pipeta depende de la cantidad de deformación esperado: si las deformaciones son pequeñas &lt;10 micras, es suficiente que la parte en forma de cilindro de la pipeta es también relativamente corto (del mismo orden de magnitud), para mayor deformaciones ajustar en consecuencia. En general, al aumentar el calor y / o aumento de la &quot;extracción&quot; disminuye el diámetro de la punta. El aumento de la &quot;atracción&quot; también genera una punta con una puesta a punto más. En nuestros experimentos, utilizando un Sutter P-97 horizontal pipeta extractor, el programa fueoptimizado para los siguientes parámetros: Calor de 473, tire de 22; Velocity 22, Tiempo de presión 200; 500. También es posible crear puntas cilíndricas tirando de un mango muy largo y después de última hora y pulirla. Las instrucciones detalladas de cómo preparar diferentes tipos de las pipetas se indican en el manual de Sutter. </li><li> Microforge: También se recomienda para disparar-pulir la punta de la pipeta para generar una superficie lisa de vidrio que hace un buen sellado a la membrana plasmática. Esto se realiza llevando la punta de la pipeta en la vecindad de una bola de vidrio calentada por un muy una fracción de segundo mediante un microforge. Técnica similar se utiliza rutinariamente para la preparación de microelectrodos para registros electrofisiológicos. </li><li> Llenado de la micropipeta: Micropipetas debe ser llenado con una solución salina fisiológica, tal como PBS o no fluorescentes medio de crecimiento. Es importante destacar que la solución debe ser suplementado con 30% de suero que permitirá la mem célulabrana se mueva suavemente en la pipeta. Dos enfoques se pueden utilizar para deshacerse de las burbujas de aire en la punta de la pipeta de: (i) una punta de la pipeta puede sumergirse en la solución primera para permitir que el líquido a llenar la punta por las fuerzas capilares seguido por el relleno de la pipeta desde el otro extremo o (ii) la pipeta entera puede ser llenado desde el extremo posterior golpeando suavemente sobre el vástago de la pipeta para eliminar las burbujas de la punta. </li><li> Nota: Las pipetas tienen que estar preparados en el día del experimento. </li></ol> 2. Preparación de las células <ol><li> Siembra de las células: microaspiración se realiza en células individuales que están o bien se mantiene en suspensión o se unen al sustrato. Para aspirar las células en suspensión, las células se levantan de sus sustratos y se pipeteó en una cámara poco profunda longitudinal que está montada en el microscopio invertido justo antes del experimento. Para aspirar las células del sustrato adjuntos, célulasSe siembran en pequeñas cubres (~ 10 mm de diámetro) que también se puede colocar en la cámara de microaspiración antes del experimento. La razón para utilizar una cámara longitudinal superficial es permitir una micropipeta para acercarse a las células en un ángulo muy bajo, como cerca de la horizontal como sea posible. Esto se hace para permitir que la membrana se detuvo en la micropipeta para ser visualizada en un solo plano de enfoque (véase la figura 2). </li><li> Visualización de membrana celular: Para observar la proyección membrana en la pipeta, las membranas celulares se tiñen con un colorante lipofílico fluorescente, tal como Dil usando un protocolo de tinción estándar. <ol type="i"><li> Warm solución de PBS. </li><li> Diluir la DII acciones a una concentración de trabajo (5 mM) con la solución de PBS caliente. </li><li> Someter a ultrasonidos durante 5 minutos para romper los agregados de tinte. </li><li> Centrifugue durante 5 minutos y tomar sobrenadante. </li><li> Lavar las células con PBS 3 veces, 5 minutos cada uno. </li><li> Se incuban las células con el tinte de modoción durante 30 minutos en una incubadora a 37 ° C. </li><li> Lavar las células con PBS 3 veces durante 5 min cada uno. </li></ol></li><li> Nota: Es posible sustituir tinción DII de la membrana con la visualización del citoesqueleto de sub-membrana que también está siendo tirado junto con la membrana en la pipeta. Hay que tener en la cuenta, sin embargo, que las interrupciones en el citoesqueleto puede alterar las propiedades biomecánicas de la célula. Por otra parte, cuando se realizan experimentos con células microaspiración sustrato adjuntos, se recomienda utilizar imágenes 3D para estimar la longitud de la proyección de la membrana en la pipeta que se coloca en un ángulo con el plano focal de las células. </li></ol> 3. Microaspiración y adquisición de imágenes Equipo: Microscopio fluorescente invertida, preferiblemente con capacidades deconvolución 3D (Zeiss Axiovert 200M con el ordenador controlado Z-eje de movimiento de la objetividades o un equivalente), cámara de vídeo conectada a un ordenador (AxioCam MRM o su equivalente), transductor de presión (BioTek o su equivalente), sin vibraciones estación (TMD o su equivalente), Micromanipulador (Narishige, Sutter, Burleigh o equivalente; manipuladores puede ser mecánico, hidráulico o piezoeléctrico). También es importante destacar que la microaspiración se puede realizar usando un microscopio sin capacidades 3D para estimar la rigidez de las células en suspensión, tales como sangre roja 1,2 células o neutrófilos 3, orgánulos aislados, tales como los núcleos 4 o liposomas artificiales 5. Imagen de software de adquisición: Zeiss AxioVision o equivalente. <ol><li> Montar las células en una cámara de microaspiración, como se describió anteriormente, en un microscopio de fluorescencia invertido. Colocar las células de elegir una celda para un experimento y lo coloca en el centro del campo visual. Es importante perform estos experimentos en un entorno libre de vibraciones, en particular para los experimentos con células adjuntas sustrato porque las vibraciones minutos que típicamente ocurren en bancos y mesas regulares puedan comprometer totalmente la creación del sello, romper la punta de la micropipeta o resultado en cambios significativos en la posición de la punta que se sesgar el análisis de los resultados. </li><li> Colocar una micropipeta llena con PBS / media w / solución de suero en un soporte de pipetas conectado a un transductor de potencia mediante un tubo flexible con el diámetro ajustado al conector del soporte de pipetas para un ajuste apretado. En el comienzo de cada experimento la presión en la pipeta se equilibra con la presión atmosférica. La pipeta está montada en un micromanipulador que permite un control preciso de los movimientos de la pipeta en un rango de micras. Coloque una pipeta en un ángulo bajo de la parte inferior de la cámara y llevar la punta de la pipeta en el centro del campo visual. The vástago de la pipeta, por una parte cilíndrica de la punta de la pipeta en la que se aspira la membrana, está alineado horizontalmente con el plano focal por (1) el posicionamiento de la pipeta en el ángulo más superficial posible (10-15 °) y por (2) flexionar el vástago de la pipeta contra el fondo de la cámara. Debido a que el vástago es muy delgado que es lo suficientemente flexible como para deslizar sobre la parte inferior de la cámara mientras se aproxima a una célula, como se muestra esquemáticamente en la figura 1. Lentamente bajar la micropipeta al lado de una sola célula usando el manipulador curso hasta cerca del plano de enfoque para la célula. Entonces, usando un manipulador fino mover la micropipeta hasta el borde de la celda hasta que la punta de la pipeta toque ligeramente la membrana. Tome una imagen para observar la posición de la pipeta. Buenos sellos se crean cuando la punta del conjunto de la pipeta esté en contacto completo con la superficie de la célula y el contacto es estable. No existe un criterio objetivo fuerte, sin embargo, acerca de lo bueno que el sello es excEPT para el examen visual. </li><li> Aplicar un paso de presión negativa usando el transductor y mantenerlo hasta proyección membrana se estabiliza. La cantidad de presión necesaria para aspirar la membrana a la pipeta varía dependiendo del tipo de célula y condiciones experimentales específicas. En nuestros experimentos, la deformación inicial que se observa normalmente cuando se aplica presión en el intervalo entre -2 a 15 mm Hg. Cuando se aplica la presión, la membrana se deforma gradualmente en la pipeta hasta que se estabiliza a cierta longitud, un proceso que suele tardar 2-3 min. Durante este tiempo, las imágenes de deformación membrana se adquieren cada 30 segundos para realizar un seguimiento de la progresión de la membrana que se tira en la pipeta. </li><li> Aumentar la presión para el siguiente nivel en pasos 2-5 mm Hg y repetir todo el procedimiento hasta que la proyección de membrana se separa de la celda y se mueve dentro de la pipeta, en cuyo punto se detuvo el experimento. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Análisis Para cuantificar el grado de deformación de membrana, la longitud de aspirado (L) se mide desde la punta de la pipeta al vértice de la circunferencia de la proyección membrana. Es importante señalar, sin embargo, que una pipeta más grande se aplique más fuerza sobre la membrana celular en el mismo nivel de presión. Para tener en cuenta la variabilidad entre los diámetros de las pipetas, por lo tanto, la longitud de aspirado está normalizado para el diámetro de pipeta (D) medido para cada experimento. Los datos pueden ser analizados utilizando un estándar de viscoelástica lineal media modelo en espacio de la célula endotelial, como se ha descrito en los estudios anteriores 6,7. Específicamente, el módulo elástico de las células se estimó usando la ecuación: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> donde E es el módulo de Young, a es el interiorradio de la pipeta, Ap es la diferencia de presión, L es la longitud correspondiente aspirado, y φ (η) es una pared funcionar calculado utilizando el modelo de fuerza, tal como se describe por Theret et al 7. Es importante señalar que varios modelos han sido utilizados para analizar los datos microaspiración incluyendo un modelo de elementos finitos que se supone que una célula es una esfera deformable con propiedades de material isótropo y homogéneo y modelos de líquido de la gota, que asumen que las células forman una forma esférica, puede deformarse continuamente, y recuperar después de la liberación, como se describe en varias revisiones excelentes: 8-10. Microaspiración también se puede utilizar para investigar otros parámetros biomecánicos de células y tejidos, tales como las propiedades viscoelásticas celulares, tensión cortical y la contribución de los diferentes elementos estructurales a la biomecánica de células y tejidos (véase las revisiones mencionadas anteriormente para obtener más información). 5. RepresentanteResultados En estudios anteriores, la aspiración de micropipeta se realizó ya sea en liposomas 5 o en las células que no estaban unidas al sustrato 2,11-13. En nuestros estudios, sin embargo, las células se mantienen típicamente unida al sustrato para evitar cambios en la estructura del citoesqueleto que pueden ocurrir cuando las células separar 14-16. Para validar el uso de la técnica para la microaspiración adjuntos sustrato-células, hemos probado si la muestra interrupción de los resultados de F-actina en la disminución de la rigidez celular de las células endoteliales aórticas bovinas (BAECs), según se estimó por este enfoque. Figura 3 que, como se esperaba , este es realmente el caso. Específicamente, la Figura 3A muestra una típica serie de imágenes fluorescentes de una membrana endotelial experimentar deformación progresiva en respuesta a la presión negativa aplicada a través de una micropipeta. Como era de esperar, la membrana es gradualmente aspirado dentro de la pipeta y el aspiratlongitud ed aumenta como una función de la presión aplicada. Los cursos de tiempo de la serie deformación que la interrupción de F-actina aumenta significativamente las longitudes de aspirados de las proyecciones en todas las condiciones de presión (Figura 3B) 14. Usando este enfoque, hemos descubierto que la rigidez de la célula aumenta cuando se agotan las membranas celulares de colesterol mientras que el enriquecimiento colesterol no tuvo ningún efecto 14. Figura 4 muestra una célula de colesterol enriquecido, una célula de control, y una célula de colesterol-agotada después de alcanzar longitudes máximas de aspiración en -15 mm Hg (4A). Las proyecciones suelen empezar a desarrollarse a-10mmHg y los tiempos de ciclos de deformación membrana se puede medir por las presiones negativas de -10, -15 y -20 mm Hg (4B). La aplicación de presiones por encima de 25 mmHg-resultó en la separación de la proyección aspirada formando una vesícula separado. El nivel de presión que causó el desprendimiento de membrana fue similar bajo diferentes condiciones de colesterol. Esta observación fue sumamente inesperado ya que estudios previos mostraron que en bicapas de lípidos de membrana un aumento en colesterol de la membrana aumenta la rigidez de la membrana de 5,17. Nuestros estudios confirman estas observaciones utilizando varios métodos independientes, incluyendo Microscopía de Fuerza Atómica 18,19 y Microscopía de Fuerza de tracción 20. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> Figura 1. Vista lateral esquemática de una pipeta de grabación. La pipeta se tira para generar un vástago cilíndrico en la punta (vista lateral). Parámetros micropipeta: D = 2a = diámetro interno y 2b = ED = diámetro externo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> Figura 2. Micropipeta se aproxima a una celda sustrato de conexión (A) vista lateral esquemática;. (B) Imagen de contraste brillante de un s micropipetaHank tocar una célula típicamente en forma de utilizarse en los experimentos de aspiración; (C) Imagen de fluorescencia de la misma célula marcada con DIIC 18. La micropipeta todavía está presente pero es invisible (De 14). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> Figura 3. La validación de la medición de la rigidez de células en adjuntas sustrato células utilizando microaspiración. A: imágenes de deformación progresiva de la membrana BAECs bajo condiciones de control y después de la exposición a latrunculin la pipeta es invisible en las imágenes, ya que no fluoresce.. Las células se expusieron a 2 mM latrunculina A durante 10 min, lo que reduce drásticamente la cantidad de F-actina, medido por fluorescencia de rodamina-faloidina (no se muestra), pero no tuvo ningún efecto significativo sobre la forma de la célula. En una célula latrunculin tratada, existe un adelgazamiento de la membrana en el medio de la proyección aspirado pero el saliente está todavía unido a la cells. B. Efecto de la latrunculina A en los cursos de tiempo de deformación membrana donde L es aspirado longitud de la proyección de membrana y D es el diámetro de la pipeta para las células de control (n = 14) y las células expuestas a 2 latrunculin mu M A durante 10 min (n = 5). Las células se aspiraron con -10 mm Hg (diamantes), -15 mm Hg (cuadrados) y -20 mm Hg (triángulos). (De 14). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> Figura 4. Efecto de los niveles de colesterol en la membrana celular de deformación de BAECs. A. Imágenes típicas de deformación de la membrana de colesterol enriquecido, colesterol empobrecido y control de las células (células de control fueron expuestas a MβCD: MβCD-colesterol mezcla en proporción de 1:1 que no tuvo efecto sobre el nivel de colesterol libre en las células (véase recuadro). Las imágenes mostradas representan la deformación máxima a -15 mm Hg. La flecha indica la posición de la proyección aspirado. La barra es de 30 m. B. Promedio de tiempo de ciclos de longitudes de aspiración para las tres poblaciones de células experimentales. C. Máximas longitudes aspirados gráficamente como una función de la presión aplicada. La longitud máxima normalizada en células agotadas fue significativamente menor que la de las células de control para presiones de -15 mm Hg y -20 mm Hg (P &lt;0,05). (De 14).

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Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton.">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li><li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In.">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li><li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+cytoskeletal+prestress.">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties.">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li><li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+fluids:+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers.">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li><li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers.">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Microaspiración proporciona un método simple y altamente reproducible para estimar la rigidez de células / deformabilidad mediante la aplicación de presión negativa a una membrana celular y la medición de la deformabilidad de la membrana en respuesta a la presión bien definida. Fue desarrollado por primera vez por Mitchison y Swann (1954) para caracterizar las propiedades elásticas de los huevos de erizo de mar para proporcionar información sobre los mecanismos de la división celular 21 y luego de v...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo / Número de modelo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sutter pipeta extractor </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforge </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de fluorescencia invertido </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> El microscopio debe ser preferiblemente equipado con capacidades de 3D/deconvolution. </td></tr><tr><td> Videocamera </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRM </td><td></td></tr><tr><td> Adquisición de imágenes de sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> Transductor de presión neumática </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B Tester transductor neumático se pueden encontrar ahora por FLUKE. </td></tr><tr><td> Pipeta de vidrio </td&gt; <td> Richland </td><td> Vidrio personalizada </td><td> Pipetas fueron adaptados con un diámetro interior de 1,2 y 1,6 de diámetro exterior. </td></tr><tr><td> Dil Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Se disuelve bien en DMSO </td></tr></tbody></table>

micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness

Creciente número de estudios muestran que las propiedades biomecánicas de las células individuales desempeñan un papel importante en varias funciones celulares, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, la migración y las interacciones célula-célula. Los dos parámetros clave de la biomecánica celulares son deformabilidad celular o la rigidez y la capacidad de las células para contraerse y generar fuerza. Aquí se describe un método rápido y simple para estimar la rigidez celular mediante la medición del grado de deformación de la membrana en respuesta a la presión negativa aplicada por una micropipeta de vidrio a la superficie celular, una técnica que se denomina aspiración Micropipetas o microaspiración. Microaspiración se realiza tirando de un capilar de vidrio para crear una micropipeta con una punta muy pequeña (2-50 m de diámetro, dependiendo del tamaño de una célula o una muestra de tejido), que luego se conecta a un transductor de presión neumática y llevado a una estrecha vecindad de una célula bajo un microscopio. Cuando elpunta de la pipeta toque una célula, un paso de presión negativa se aplica a la pipeta por el transductor de presión neumática generar presión bien definida en la membrana celular. En respuesta a la presión, la membrana se aspira en la membrana de pipeta y deformación progresiva o &quot;proyección membrana&quot; en la pipeta se mide como una función del tiempo. El principio básico de este enfoque experimental es que el grado de deformación de la membrana en respuesta a una fuerza mecánica definida es una función de la rigidez de la membrana. El más rígida la membrana es, menor es la velocidad de deformación de membrana y la más corta es la técnica de aspiración de estado estacionario longitud.El se puede realizar en células aisladas, tanto en suspensión como adjuntos sustrato, orgánulos grandes, y liposomas. El análisis se realiza mediante la comparación de las deformaciones máximas de membrana obtenidos en virtud de una presión dada para diferentes poblaciones de células o condiciones experimentales. A &quot;coeficiente de rigidez&quot; es esestimada por el trazado de la longitud de la membrana aspirada de deformación como una función de la presión aplicada. Además, los datos pueden ser analizados para estimar el módulo de Young de las células (E), el parámetro más común para caracterizar la rigidez de los materiales. Es importante señalar que las membranas plasmáticas de las células eucarióticas pueden ser vistos como un sistema bi-componente cuando se underlied bicapa lipídica de la membrana por el citoesqueleto de sub-membrana y que es el citoesqueleto que constituye el andamiaje mecánico de la membrana y domina la deformabilidad de la envoltura celular. Este enfoque, por lo tanto, permite inspeccionar las propiedades biomecánicas del citoesqueleto sub-membrana.

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Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Aquí se describe un método sencillo y rápido para medir la rigidez de la célula. El principio general de este enfoque consiste en medir la deformación de la membrana en respuesta a la bien definida la presión negativa aplicada a través de una micropipeta a la superficie celular. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biomecánicas de los adjuntos sustrato células.

Aspiración Micropipeta de células adheridas a sustratos para estimar la rigidez Celular

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K vistas.  University of Illinois. Aquí se describe un método sencillo y rápido para medir la rigidez de la célula. El principio general de este enfoque consiste en medir la deformación de la membrana en respuesta a la bien definida la presión negativa aplicada a través de una micropipeta a la superficie celular. Este método proporciona una poderosa herramienta para estudiar las propiedades biomecánicas de los adjuntos sustrato células.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Diseño de un biorreactor de presión cíclica de la Ex Vivo Estudio de las válvulas aórtica del corazón

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Investigación

Bioingeniería

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Spatio-Temporal Manipulation of Small GTPase Activity at Subcellular Level and on Timescale of Seconds in Living Cells

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular functions and events1, 2. Their spatiotemporally dynamic nature has been revealed by visualization of their activity and localization in real time3. In order to gain deeper understanding of their roles in diverse cellular functions at the molecular level, the next step should be perturbation of protein activities at a precise subcellular location and timing. 
To achieve this goal, we have developed a method for light-induced, spatio-temporally controlled activation of small GTPases by combining two techniques: (1) rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and (2) a photo-caging method of rapamycin. With the use of rapamycin-mediated FKBP-FRB heterodimerization, we have developed a method for rapidly inducible activation or inactivation of small GTPases including Rac4, Cdc424, RhoA4 and Ras5, in which rapamycin induces translocation of FKBP-fused GTPases, or their activators, to the plasma membrane where FRB is anchored. For coupling with this heterodimerization system, we have also developed a photo-caging system of rapamycin analogs. A photo-caged compound is a small molecule whose activity is suppressed with a photocleavable protecting group known as a caging group. To suppress heterodimerization activity completely, we designed a caged rapamycin that is tethered to a macromolecule such that the resulting large complex cannot cross the plasma membrane, leading to virtually no background activity as a chemical dimerizer inside cells6. Figure 1 illustrates a scheme of our system. With the combination of these two systems, we locally recruited a Rac activator to the plasma membrane on a timescale of seconds and achieved light-induced Rac activation at the subcellular level6.

A method for spatio-temporal control of small GTPase activity by light is described. This method is based on rapamycin-induced FKBP-FRB heterodimerization and photo-caging systems. Optimization of light-irradiation enables the spatio-temporally controlled activation of small GTPases at the subcellular level.

Espacio-Temporal de manipulación de la actividad GTPasa pequeña en el nivel subcelular y en escala de tiempo de segundos en las células vivas

Dynamic regulation of the Rho family of small guanosine triphosphatases (GTPases) with great spatiotemporal precision is essential for various cellular ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Multiwell Rigidez Ensayo para el Estudio de las respuestas de las células Rigidez dependientes simple basado poliacrilamida-

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Un método para estimar las cepas Cortical fémur cadavérico durante fractura correlación Digital de imágenes usando la prueba

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Medición de la rigidez de sustratos de silicona blanda mecanobiología estudios utilizando un microscopio de fluorescencia de campo amplio

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...