DIY criogénico dispositivo de recuperación ha sido probado en el curso de los proyectos &quot;prenilación modelado de proteínas bacterianas en las células eucariotas uso de la bioinformática y los enfoques moleculares&quot;, patrocinado por Mary Louise Andrews Premio para el programa de Investigación del Cáncer, la Academia de Ciencias de Virginia, &quot;significado fisiológico de la edición del ARN en el plasma Las células dendríticas &quot;patrocinado por la Jeffress Thomas F. Miller y Kate Jeffress Memorial Trust y el Contrato 16.740.11.0364 Estado (Ministerio de Educación y Ciencia, Rusia). Nos gustaría dar las gracias a Bet Eom para obtener ayuda con el experimento de la integridad del RNA.

1. Asamblea de dispositivos Cryotolerant para la recuperación de Cajas criogénicas <ol><li> Usando los alicates, enderezar un lado de 3 caras fuerte de corbata (Figura 1A) para hacer una forma de L-fuerte lazo Nota se muestra en la Figura 1B. Las dimensiones de fuerte lazo se puede seleccionar en función del diámetro del cuello de Dewar . </li><li> Asegure dos tan fuertes los lazos con una correa de Strong-Tie T (Figura 2) con la Corona tuerca del perno, arandela y el tornillo para formar la base Cryoscoop como se muestra en la Figura 3 (AB). Nota: Dos fuertes lazos se utilizan para permitir la recuperación de 5 ½ pulgadas x 5 ½ pulgadas criocajas. </li><li> Usando una placa ranurada (Figura 4), ​​alinear las ranuras de la correa T-fuerte lazo con las ranuras en un extremo de la placa ranurada y asegurar los dos juntos con ayuda de tuerca Hillman y pernos (Figura 5). Nota: Si el placa de ranurado y fuerte lazo de no cooperarmí con agujeros previamente perforados, se le tiene que tener agujeros perforados con broca de carburo. </li><li> Doble el otro extremo de la placa ranurada con la ayuda de pinzas como se muestra en la Figura 6. (Este paso es opcional). </li><li> Envolver el mango con espuma para comprender mejor el dispositivo en nitrógeno líquido, como se muestra en la Figura 6. (Opcional) Nota: Quite la espuma antes de la esterilización en autoclave. </li></ol> 2. Asamblea de dispositivos Cryotolerant para la recuperación de crioviales El dispositivo Cryotolerant bricolaje recuperación también se puede adaptar para la recuperación de crioviales. Esto implica la sustitución de la base plana con un filtro de acero inoxidable como se muestra alterada para sacando viales de nitrógeno líquido (Figura 7). <ol><li> Desenroscar la corona tuercas y los tornillos que sujetan la correa de Strong-Tie T a la placa ranurada. </li><li> Antes de fijar el filtro de acero inoxidable a la placa ranurada, doble suavemente el cuello delel filtro con la ayuda de pinzas para orientar la base en un ángulo para asemejarse a una cuchara (Figura 8) Nota: Si el filtro viene con un labio, utilizar pinzas para doblar el labio hacia abajo, lo que hará que las maniobras con el dispositivo de fácil.. </li><li> Alinee el agujero en el mango del filtro, junto con los orificios de la placa ranurada y asegurar el colador con la ayuda de las tuercas y los pernos de Hillman, como se muestra en la Figura 8. Nota: Si el filtro no viene con agujeros previamente perforados, tendrá que hacer arreglos para que los agujeros perforados con una broca de metal duro. </li></ol> 3. Recuperación de Cajas criogénicas y crioviales de Dewar <ol><li> Para empezar, se puso los guantes criogénicos y eliminar 1 o 2 bastidores del congelador de la Dewar para dejar espacio para maniobrar. </li><li> Raspe suavemente en la parte inferior de la Dewar con la posición vertical del dispositivo de recuperación de bricolaje Cryotolerant equipado con Strong-Tie base de la tira T (Figura 5) y recoger el cuadro de Fallen hasta el fondo del tanque de Dewar. Nota: hierve de nitrógeno líquido inmediatamente en contacto con un objeto más caliente, envolviendo el objeto en el aislamiento de gas nitrógeno (efecto Leidenfrost). Para enfriar el dispositivo antes de la recuperación de muestras, lentamente sumergir el dispositivo en el Dewar y permitir nitrógeno líquido para enfriar el dispositivo suficientemente antes de proceder con la etapa anterior. </li><li> Extraiga el dispositivo en posición vertical a lo largo de las paredes de la Dewar para sacar la caja del congelador fuera del tanque. </li><li> Agarra el cuadro extraído de la parte inferior del Dewar. </li><li> Para recuperar los crioviales, raspar suavemente el fondo de la Dewar con la cryoscoop equipado con un filtro (Figura 9). </li><li> Al igual que en Caja criogénica de recuperación, tire del dispositivo en posición vertical y apoderarse de los viales recogidos en el colador. </li></ol> 4. Los resultados representativos Un problema importante en los estudios de expresión génica es que la calidad de ARN depende de las condiciones de almacenamientopara ambas muestras de tejido congeladas y la Figura 4 se extrajo el ARN. 10 muestra el efecto del manejo de la muestra en la integridad del ARN total. ARN total de la fuente mismo tejido (adiposo humano) se sometió a la manipulación de la muestra diferente. Antes de experimentar, intacta total de ARN preparate muestra claras 28S y 18S rRNA con las bandas de la banda 28S rRNA aproximadamente dos veces más intensa que la banda 18S rRNA (Figura 10, carril 1). Esta relación de 2:1 (28S: 18S) es una indicación de que el ARN está intacta, mientras que parcialmente degradado ARN aparece como una mancha, o su 28S: relación 18S intensidad se aparta de 02:01 5. Los carriles 3-4 representa muestras de ARN con una degradación significativa. Estas muestras de ARN se sometieron a descongelación repetidos parcial a corto plazo consultas en el Dewar (Método A), por lo tanto el modelado de almacenamiento a largo plazo con periódico decantación debido a la necesidad de la recuperación de los viales de caída y cajas (Figura 10, el carril 3-4 ). Sin embargo, las muestras almacenadas en Dewar serviciousando un dispositivo de bricolaje (Método B) y, por tanto, ninguna descongelación parcial, contienen ARN intacto (Figura 10, calle 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig1.jpg" /> Figura 1. A) La base se compone de dos caras 3 Strong-Tie de dimensiones que se muestran. Cada lazo fuerte contiene un gran orificio perforado (flecha sólida) y múltiples orificios más pequeños (flecha pequeña) en cada cara. Esto proporciona una opción para permitir fijar con la tuerca y los tornillos. También los agujeros más pequeños permitir el drenaje rápido de nitrógeno líquido durante la recuperación de la muestra. B) Un lado de cada una de la corbata fuerte se endereza con la ayuda de pinzas para hacer en forma de L-fuerte lazo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig2.jpg" /> Figura 2. Strong-Tie correa T se utiliza para proteger los fuertes lazos de juntas. Al igual que Strong-Tie, T-correa tiene un gran agujero previamente taladrado (flecha sólida) y dos orificios más pequeños (Small flecha) en cada esquina. Esto permite asegurar fuerte de los lazos a lo largo de la longitud de la T - correa por medio de tuercas y pernos. También permite sujeción de T-correa a la placa ranurada. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig3.jpg" /> Figura 3. A) Cada lazo fuerte-se fija en una esquina de la T-correa, a lo largo de su longitud usando las tuercas de los pernos de la corona, pernos y arandelas. B) Dos fuertes-dades se fijan al lado de la otra para ayudar a recuperar 5 ½ x 5 ½ pulgadas in criocajas. Para los más pequeños criocajas como 2 pulgadas x 2 pulgadas, un solo Strong-Tie se puede fijar directamente a la placa con ranuras en T, sin correa. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig4.jpg" /> Figura 4. Ranurado placa plana se utiliza como el mango. Longitud de la placa ranurada depende de la profundidad del Dewar. En este caso, 4 pies de placa ranurada fue utilizado. El espesor de la placa ranurada es crítico sesde delgadas placas ranuradas (&lt;14 indicadores) que el dispositivo débil, mientras que la recuperación de muestras de nitrógeno líquido, lleno de Dewar. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig5.jpg" /> Figura 5. La base plana que consta de fuertes los lazos y la correa T se asegura entonces en un extremo de la placa ranurada. El agujero más grande en la esquina restante de la correa T está alineada con la ranura en la placa plana y se fija usando un perno y una tuerca hexagonal. Este dispositivo puede ser ahora usado para recuperar criocajas de Dewar. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig6.jpg" /> Figura 6. Un extremo de la placa ranurada plana se dobla con unos alicates y se cubre con espuma para proporcionar un mejor agarre especialmente para Dewars profundas, como se muestra en este caso. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig7.jpg" /> Figura 7. Filtro con una malla metálica y mango de acero inoxidablese utiliza para recuperar crioviales de Dewar. Si el mango no está provisto de una ranura, perfore con poco carburo se requiere para la perforación de un agujero. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig8.jpg" /> Figura 8. Para facilitar la recuperación de los crioviales, el filtro se dobla a lo largo del cuello con unos alicates para obtener filtro en forma de cuchara. Si colador está provista de labios como en este caso, alicates se puede utilizar para doblarla. Esto asegura colador de no quedar atrapados en el Dewar. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig9.jpg" /> Figura 9. El filtro está fijado a la placa ranurada plana en un extremo mediante una tuerca hexagonal y perno. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3903/3903fig10.jpg" /> Figura 10. Integridad de la muestra de ARN total sometidos a diferentes condiciones de manejo de muestra. Para explorar cómo la calidad del ARN de la muestra se ve afectada por el manejo de condiciones, un conjunto de muestras de ARN de la misma fuente se sometió a dos métodos de manejos. Método A constaba de almacenamiento de ARN en Dewar sometido a recuperaciones de ejemplo utilizando el dispositivo de bricolaje, por lo tanto no descongelación parcial. Método B consistió en almacenamiento de ARN en Dewar sometido a descongelación repetidos parcial a corto plazo consultas en el Dewar, por lo tanto el modelado de almacenamiento a largo plazo con periódico decantación para recuperar muestras caídas. Total integridad del ARN se analizó luego por electroforesis en gel. Lane1: Muestra antes de su almacenamiento en el Dewar, Carril 2: Muestra de Dewar objeto de recuperación por el método A, Calle 3, 4: Muestra de Dewar objeto de recuperación por el método B, M: escalera de 100 pb.

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	<li>Kittel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Cryogenic Engineering. , 41 (1996).</li><li>Edeskuty, F. J., Walter, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Stewart Safety in the handling of cryogenic fluids. , (1996).</li><li>Council, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prudent Practices in the Laboratory: Handling and Management of Chemical Hazards. , (2011).</li><li>Muyal, J., Muyal, V., Kaistha, B., Seifart, C., Fehrenbach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+RNA+extraction+techniques+from+frozen+and+fresh+lung+tissues:+checkpoint+towards+gene+expression+studies.">Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies.</a> Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2001).</li><li>Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+sample+collection+and+processing+for+molecular+epidemiological+studies.">Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies.</a> Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 543, 217-234 (2003).</li><li>Lynch, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CELL,+TISSUE+AND+ORGAN+CULTURE+|+Storage+and+Cryopreservation.">CELL, TISSUE AND ORGAN CULTURE | Storage and Cryopreservation.</a> Encyclopedia of Rose Science. , 106-111 (2003).</li><li>Crawford, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Plastics Engineering. , (1998).</li><li>Gorenc, B., Tinyou, R., Syam, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Steel designers' handbook. , (1996).</li><li>Harper, C. A., Petrie, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastics+materials+and+processes:+a+concise+encyclopedia.">Plastics materials and processes: a concise encyclopedia.</a> Wiley-Interscience. , (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Uno de los métodos más comunes de recuperar criocajas y crioviales desde el fondo del tanque Dewar es decantar nitrógeno líquido en un recipiente de repuesto y extraer las muestras restantes en el matraz o flotando en el nitrógeno líquido se decantó. Esta es, sin embargo, una práctica insegura que puede causar quemaduras criogénicas o asfixia debido a la exposición prolongada a vapores de nitrógeno líquido 2. Otra forma común de recuperación de los crioviales caídos implica el uso de pinzas cri...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Hillman Group bañados con ranuras planas 1-3/8 x 4 pies, calibre 14 </td><td> Tienda de hardware local </td><td> N / A </td><td> 1 unidad requiere </td></tr><tr><td> Corona del perno de acero inoxidable # 6 - 32 x 3/8 pulgadas de cabeza ovalada tornillo de la máquina Phillips Drive </td><td> Tienda de hardware local </td><td> Modelo # 42281 </td><td> 4 unidades requeridas </td></tr><tr><td> Corona del perno 3/8 pulgadas x 1-1/2 pulgadas zincado Arandelas de acero Fender </td><td> Tienda de hardware local </td><td> Modelo # 20122 </td><td> 4 unidades requeridas </td></tr><tr><td> Corona Tornillo galvanizada # 8-32 Tuerca Tornillo para metales </td><td> Tienda de hardware local </td><td> Modelo # 18512 </td><td> 4 unidades requeridas </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie BC40Z 4 In.x4 in Media Base </td><td> Hardware Localir de compras </td><td> Modelo # BC40Z </td><td> 2 unidades requeridas </td></tr><tr><td> Simpson Strong-Tie 6 x 6 pulgadas Correa T </td><td> Tienda de hardware local </td><td> Modelo # 66T </td><td> 1 unidad requiere </td></tr><tr><td> Oneida 6 &quot;colador </td><td> Supermercados local </td><td> Modelo # 7859W </td><td> 1 unidad requiere </td></tr><tr><td> El Grupo de Hillman galvanizado tuercas hexagonales de 3/8-16 </td><td> Tienda de hardware local </td><td> Modelo #: 810509 </td><td> 6 unidades requeridas </td></tr><tr><td> El Grupo de Hillman galvanizado tornillos de cabeza hexagonal 3/8- 16 </td><td> Tienda de hardware local </td><td></td><td> 4 unidades requeridas </td></tr><tr><td> Espuma para el aislamiento </td><td> Tienda de hardware local </td><td></td><td> 1 unidad requiere </td></tr><tr><td> Destornillador </td><td> Tienda de hardware local </td><td></td><td> 1 unidad requiere </td></tr><tr><td> Alicates </td><td> Tienda de hardware local </td><td></td><td> 1 unidad requiere </td></tr></tbody></table>

do-it-yourself device for recovery of cryopreserved samples accidentally dropped into cryogenic storage tanks

El nitrógeno líquido es incoloro, inodoro, muy frío (-196 ° C) de líquido mantiene bajo presión. Se utiliza comúnmente como un fluido criogénico para el almacenamiento a largo plazo de los materiales biológicos tales como sangre, células y tejidos 1,2. La naturaleza criogénica de nitrógeno líquido, mientras ideal para la preservación de la muestra, puede causar una rápida congelación de los tejidos vivos en contacto - conocido como &quot;quemadura criogénica &#39;2, que puede conducir a la congelación severa en personas estrechamente implicados en el almacenamiento y recuperación de muestras de Dewars. Además, como el nitrógeno líquido se evapora, se reduce la concentración de oxígeno en el aire y pueden causar asfixia, especialmente en espacios confinados 2. En los laboratorios, las muestras biológicas a menudo se almacenan en crioviales o criocajas apilados en bastidores de acero inoxidable dentro de los tanques de Dewar 1. Estos bastidores de almacenamiento se proporcionan con un eje largo para evitar que las cajas se deslice fuera de los bastidores y en la parte inferior deDewars durante el manejo de rutina. Con demasiada frecuencia, sin embargo, las cajas o frascos con muestras preciosas salirse y se hunden hasta el fondo del tanque de nitrógeno líquido llena. En tales casos, las muestras pueden ser tediosamente recuperado después de transferir el nitrógeno líquido en un recipiente de repuesto o desecharlo. Las cajas y los viales a continuación, puede ser relativamente segura recuperado de vaciado Dewar. Sin embargo, la naturaleza criogénica de nitrógeno líquido y su tasa de expansión hace peligrosos hundida recuperación de la muestra. Se recomienda con frecuencia por las oficinas de seguridad que la recuperación de la muestra no se llevará a cabo por una sola persona. Otra alternativa es el uso de tarjetas de adquisición de frescos disponibles en el mercado o tenazas para sacar los 3 viales. Sin embargo, la visibilidad limitada en la oscuridad Dewars llenos de líquido representa una importante limitación en su uso. En este artículo se describe la construcción de un dispositivo de recuperación de Cryotolerant bricolaje, lo que hace que la recuperación de la muestra de Dewar que contiene líquidos criogénicos, tanto de caja fuerteª fáciles.

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Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Aquí se presenta un bajo coste, duradero dispositivo de cryotolerant para la recuperación de la muestra de los tanques de Dewar lleno de nitrógeno líquido. La facilidad de construcción y el diseño modular del dispositivo hace que el proceso de recuperación de muestras de los tanques criogénicos seguro y fácil.

Do-It-Yourself de dispositivos para la recuperación de las muestras criopreservadas de caída accidental en los tanques de almacenamiento criogénicos

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

do-it-yourself-device-for-recovery-cryopreserved-samples-accidentally

Research

JoVE Journal

Biology

25.0K vistas.  George Mason University. Aquí se presenta un bajo coste, duradero dispositivo de cryotolerant para la recuperación de la muestra de los tanques de Dewar lleno de nitrógeno líquido. La facilidad de construcción y el diseño modular del dispositivo hace que el proceso de recuperación de muestras de los tanques criogénicos seguro y fácil.

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Fabrication of a Microfluidic Device for the Compartmentalization of Neuron Soma and Axons

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for culturing neurons. Previously, a silicon wafer was patterned with the design for the neuron microfluidic device using SU-8 and photolithography to create a master mold, or what we simply refer to as a "master". Next, we pour the silicon polymer PDMS on top of the master which is then cured by heating the PDMS to 80&deg;C for 1 hour. The PDMS forms a negative mold of the device. The PDMS is then carefully cut and lifted away from the master. Holes are punched where the reservoirs will be and the excess PDMS trimmed away from the device. Nitrogen is used to blow away any excess debris from the device. At this point the devices are now ready for use and can either bonded to corning No. 1 cover glass with a plasma sterilizer/cleaner or can be reversibly bound to the cover glass by simply placing the device on top of the cover glass. The reversible bonding of the device to glass is covered in a separate video and requires first that the device be sterilized either with 70% ethanol or by autoclaving. Plasma treating sterilizes the devices so no further treatment is necessary. It is, however, important, when plasma-treating the devices, to add liquid to the devices within 10 minutes of the plasma treatment while the surfaces are still hydrophilic. Waiting longer than 10 minutes to add liquid to the device makes it difficult for the liquid to enter the device. The neuron devices are typically plasma-bound to cover glass and 0.5 mg/ml poly-L-lysine (PLL) in pH 8.5 borate buffer is immediately added to the device. After a minimum of 3 hours incubating with PLL, the devices are washed with dH2O water a minimum of 3 times with at least 15 minutes between each wash. Next, the water is removed and fresh media is added to the device. At this point the device is ready for use. It is important to remember at this point to never remove all the media from the device. Always leave media in the main channel.

In this video we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to farbricate a microfluidic device for culturing neurons.

Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma

In this video, we demonstrate the technique of soft lithography with polydimethyl siloxane (PDMS) which we use to fabricate a microfluidic device for ...

Investigación

Biología

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

Un dispositivo de microfluidos gradiente de generación de Biología Celular

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

La instilación directa traqueal de solutos en pulmón de ratón

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Las muestras de prueba para optimizar STORM Super-Resolución de Microscopía

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recuperación de adultos de pez cebra Corazones para aplicaciones de alto rendimiento

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, microbiome modification is designed to concentrate genomic DNA of a target foodborne pathogen contaminant to facilitate the detection and subtyping of the pathogen in a single workflow. Here, we explain and demonstrate the sample preparation steps for the quasi-metagenomics analysis of Salmonella enterica from representative food and environmental samples including alfalfa sprouts, ground black pepper, ground beef, chicken breast and environmental swabs. Samples are first subjected to the culture enrichment of Salmonella for a shortened and adjustable duration (4&#8211;24 h). Salmonella cells are then selectively captured from the enrichment culture by immunomagnetic separation (IMS). Finally, multiple displacement amplification (MDA) is performed to amplify DNA from IMS-captured cells. The DNA output of this protocol can be sequenced by high throughput sequencing platforms. An optional quantitative PCR analysis can be performed to replace sequencing for Salmonella detection or assess the concentration of Salmonella DNA before sequencing.

Quasi-metagenomic Analysis of Salmonella from Food and Environmental Samples

Here, we present a protocol to prepare DNA samples from food and environmental microbiomes for concerted detection and subtyping of Salmonella through quasimetagenomic sequencing. The combined use of culture enrichment, immunomagnetic separation (IMS), and multiple displacement amplification (MDA) allows effective concentration of Salmonella genomic DNA from food and environmental samples.&#160;

Análisis de metagenómica cuasi de Salmonella de muestras alimentarias y ambientales

Quasi-metagenomics sequencing refers to the sequencing-based analysis of modified microbiomes of food and environmental samples. In this protocol, ...

Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive behaviors and the acquisition of gametes and embryos for physiological or molecular research. Amphibians contribute to one-quarter to one-third of vertebrate research, and of interest in this context is their contribution to the scientific community&#39;s knowledge of reproductive processes and embryological development. However, most of this knowledge is derived from a small number of species. In recent times, the decimation of amphibians across the globe has required increasing intervention by conservationists. The captive recovery and assurance colonies that continue to emerge in response to the extinction risk make existing research and clinical applications invaluable to the survival and reproduction of amphibians held under human care. The success of any captive population is founded on its health and reproduction and the ability to develop viable offspring that carry forward the most diverse genetic representation of their species. For researchers and veterinarians, the ability to monitor and control ovarian development and health is, therefore, imperative. The focus of this article is to highlight the different assisted reproductive techniques that can be used to monitor and, where appropriate or necessary, control ovarian function in amphibians. Ideally, any reproductive and health issues should be reduced through proper captive husbandry, but, as with any animal, issues of health and reproductive pathologies are inevitable. Non-invasive techniques include behavioral assessments, visual inspection and palpation and morphometric measurements for the calculation of body condition indices and ultrasound. Invasive techniques include hormonal injections, blood sampling, and surgery. Ovarian control can be exercised in a number of ways depending on the application required and species of interest.

The study of amphibian biology provides valuable information on the reproductive, physiological, embryological and developmental processes that drive organisms of many taxonomic groups. Here, we present a comprehensive guide on different methodologies that can be used to study ovarian control and monitoring in amphibians.

Técnicas Reproductivas para el Monitoreo y Control de La Ovacada en Anfibios

Ovarian control and monitoring in amphibians require a multi-faceted approach. There are several applications that can successfully induce reproductive ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

Carga criogénica de muestras en un espectrómetro de resonancia magnética nuclear de ángulo mágico que preserva la viabilidad celular

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits obesity and many associated diseases including cardiovascular disorders, type II diabetes, and cancer. To advance the current understanding of lipid metabolic regulation, quantitative methods to precisely measure in vivo lipid storage levels in time and space have become increasingly important and useful. Traditional approaches to analyze lipid storage are semi-quantitative for microscopic assessment or lacking spatio-temporal information for biochemical measurement. Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology that enables rapid and quantitative detection of lipids in live cells with a subcellular resolution. As the contrast is exploited from intrinsic molecular vibrations, SRS microscopy also permits four-dimensional tracking of lipids in live animals. In the last decade, SRS microscopy has been widely used for small molecule imaging in biomedical research and overcome the major limitations of conventional fluorescent staining and lipid extraction methods. In the laboratory, we have combined SRS microscopy with the genetic and biochemical tools available to the powerful model organism, Caenorhabditis elegans, to investigate the distribution and heterogeneity of lipid droplets across different cells and tissues and ultimately to discover novel conserved signaling pathways that modulate lipid metabolism. Here, we present the working principles and the detailed setup of the SRS microscope and provide methods for its use in quantifying lipid storage at distinct developmental timepoints of wild-type and insulin signaling deficient mutant C. elegans.

Label-Free Imaging of Lipid Storage Dynamics in Caenorhabditis elegans using Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows selective, label-free imaging of specific chemical moieties and it has been effectively employed to image lipid molecules in vivo. Here, we provide a brief introduction to the principle of SRS microscopy and describe methods for its use in imaging lipid storage in Caenorhabditis elegans.

Imágenes Libres De Etiquetas De La Dinámica De Almacenamiento De Lípidos En Caenorhabditis elegans Usando Microscopía De Dispersión Raman Estimulada

Lipid metabolism is a fundamental physiological process necessary for cellular and organism health. Dysregulation of lipid metabolism often elicits ...