Este método se puede utilizar para detectar Salmonella a partir de muestras de alimentos e identificar el patógeno al nivel de cepa a través de la toma de huellas genéticas. La principal ventaja de esta técnica es que combina la detección y subtipado de Salmonella en un solo flujo de trabajo y reduce sustancialmente el tiempo de respuesta de la muestra de alimentos contaminados con Salmonella hasta la huella dactilar del patógeno. Para empezar, coloque asépticamente una muestra de 25 gramos de alimentos dentro de una bolsa de licuadora de laboratorio estéril con un filtro incorporado o, opcionalmente, prepare un hisopo ambiental humedeciendo asépticamente una esponja con caldo de enriquecimiento, arrastrándola a través de una superficie predeterminada y colocándola dentro de una bolsa de licuadora.
Usando una licuadora de laboratorio, mezcle a fondo cada muestra con 225 mililitros de caldo de enriquecimiento RV. Luego incubar la mezcla a 42 grados Celsius durante cuatro a 21 horas. Después de esto, recoja una submuestra de 50 mililitros de caldo de enriquecimiento del lado filtrado de la bolsa.
A continuación, centrifugar la submuestra a 100 g durante 10 minutos. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga de 50 mililitros y centrífuga a 3.000 a 6.000 veces g durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet en cinco mililitros de BPW.
Resuspender el pellet en cinco mililitros de BPW. En primer lugar, descongele el búfer de muestra y el búfer de reacción del kit MDA sobre hielo. Coloque un mililitro de células resuspendidas en BPW y 20 microlitros de perlas anti-Salmonella en un tubo de microcentrífuga.
Coloque el tubo de microcentrífuga en un mezclador giratorio durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de esto, coloque el tubo en un soporte magnético durante tres minutos. Invierta el bastidor magnético varias veces para concentrar las perlas en un pellet.
Manteniendo el tubo en el bastidor magnético, aspirar y desechar el sobrenadante. A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado al tubo. Retire el soporte del tubo del bastidor e invierta el soporte del tubo varias veces para eliminar cualquier bacteria no específicamente vinculante del complejo.
Después del tercer lavado, aspirar el sobrenadante del tubo y desecharlo. A continuación, retire el tubo del bastidor magnético y centrifugarlo durante un segundo. A continuación, coloque el tubo en el bastidor magnético durante tres minutos antes de retirar cualquier tampón de lavado residual.
Resuspender los complejos de Salmonella de cuentas en nueve microlitros de tampón de muestra e incubar el tubo a 95 grados Centígrados durante tres minutos. Después de enfriar los complejos sobre hielo, agregue nueve microlitros de tampón de reacción y un microlitro de mezcla enzimática. Incubar el tubo en un ciclor térmico de acuerdo con el protocolo de texto y enfriar el tubo en hielo.
A continuación, utilice un instrumento de fluorospectrometrome para medir la concentración de ADN y la pureza de la muestra. Almacene los productos finales en 20 grados Celsius negativos para futuros experimentos. Preparar 18 microlitros de mezcla de PCR por muestra de acuerdo con el protocolo de texto.
A continuación, mezcle el producto MDA pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Agregue dos microlitros de la suspensión del producto MDA a la mezcla de PCR. Usando un protocolo PCR optimizado en tiempo real, ejecute el PCR en tiempo real de acuerdo con el protocolo de texto.
Agregue soluciones de tampón y reactivos al producto MDA según lo especificado en el protocolo de texto y transfiera los 40 microlitros resultantes del producto MDA preparado por secuenciación a una nueva placa y agregue 20 microlitros de perlas de purificación de PCR a cada pozo. A continuación, incubar la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego lave las cuentas con 80% de etanol y séquelas durante 12 minutos.
Resuspender las perlas secas en 53 microlitros de tampón de resuspensión e incubar las cuentas durante dos minutos a temperatura ambiente. Por último, diluya y acose las bibliotecas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En este protocolo, la evaluación de cantidad específica del ADN de Salmonella se realizó mediante PCR en tiempo real.
Los resultados representativos de dos marcas de pechuga de pollo contaminada con Salmonella oscilaron entre 701,54 y 945,86 nanogramos por microlitro, lo que indica que el ADN de la muestra se amplificó eficazmente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lavar y manejar cuidadosamente las cuentas de IMS, mantener los reactivos y productos MDA libres de contaminantes y mantener una campana limpia. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la seguridad alimentaria y la salud pública exploraran el seguimiento rápido y de alta resolución de los contaminantes de Salmonella en muestras de alimentos, entornos de productos y cadenas de suministro.
No olvide que trabajar con patógenos transmitidos por alimentos puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como usar equipos de protección personal y seguir buenas prácticas de laboratorio, siempre deben tomarse durante la realización de este procedimiento.
