Los autores desean agradecer a Ejército de los EE.UU. de Investigación Médica y Material Command (Grant # W81XWH-10-1-0806) y los Institutos Nacionales de Salud (Grant # U19 AI091031-01 y Grant # 1R01GM090280) para el apoyo financiero. BN reconoce la Cátedra Balloun en Ingeniería Química y Biológica y NLBP reconoce la Cátedra Wilkinson de Ingeniería Interdisciplinaria. Damos las gracias a Julia Vela por su ayuda en la realización de los experimentos de funcionalización de nanopartículas.

1. Hidratos de carbono de alto rendimiento Síntesis <ol><li> Antes de la síntesis automatizada de dimannoside, un donante de azúcar adecuadamente protegido, tricloroacetimidato típicamente, y aceptor, principalmente un alcohol fluorosa alquenilo, se sintetizan en el banco superior. </li><li> Un programa está escrito para la síntesis automatizada de dimannoside. Una representación esquemática del procedimiento automatizado de base se presenta en la Figura 2. En el programa, se asegura que antes de la adición del promotor, la mezcla de donante y aceptor se agita durante al menos 30 minutos. </li><li> Soluciones del donante sintético aceptor, y trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate se hacen en diclorometano. El tolueno y el diclorometano se utilizan con mayor frecuencia para las reacciones de glicosilación. </li><li> También, preparar soluciones de reactivos para la desprotección de los grupos protectores temporales en 80% de metanol y 100% de metanol. </li><li> Antes del comienzo del programa, asegurar que la relaive la humedad en la habitación es de 30% o inferior en la cámara de la automatización. La alta humedad es perjudicial para las reacciones de glicosilación. </li><li> Una vez que se inicia el programa, el brazo robótico transfiere las soluciones de donante y aceptor en el vial de reacción secuencial. Luego la mezcla se agitó durante 30 min. </li><li> A continuación, el brazo robótico transfiere 0,2 a 0,3 equivalentes de trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate en la mezcla, típicamente a temperatura ambiente, aunque las temperaturas más bajas como -20 ° C puede ser alcanzado. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. </li><li> Después de 30 minutos, la reacción se detuvo y una pequeña alícuota eliminado para vigilar el progreso de la reacción. Si no está completa, la reacción puede ser seguido y, finalmente, el tiempo requerido puede ser modificado. </li><li> Una vez que se completa la reacción, la mezcla de reacción se transfiere a los fluorosa extracción en fase sólida (FSPE) cartuchos que contienen C 8 F 17-modificado gel de sílice para su purificación. </li><li> El carrocrestas se lava primero con un 80% de metanol-agua mezcla (8 ml) para deshacerse de la fracción no fluorosa. </li><li> A continuación, los cartuchos se lavó con 100% de metanol para obtener el producto deseado fluorosa-etiquetados. Si purificación adicional se desea, la máquina puede ser parado y el producto de reacción (s) que se retiró para la purificación por medios adicionales. </li><li> Después del ciclo de purificación, el brazo robótico dispensa metóxido sódico en el vial de reacción. La reacción se agitó durante 2 h. Si no está completa, la reacción puede ser de nuevo continuó durante un período más largo y, finalmente, el tiempo programado requiere puede ser modificada. </li><li> Después de la terminación de la reacción, el producto se purifica por FSPE y después se somete a la disolución en tolueno anhidro, seguido por evaporación para eliminar el agua residual. </li><li> A continuación, el ciclo (de la etapa 6 a 13) se repite hasta que la longitud de cadena deseada se obtiene para la molécula diana. </li><li> El producto protegido, obtenido a partir de la automatización es ºes purificado y caracterizado completamente mediante técnicas tales como resonancia magnética nuclear (RMN). Desprotección completa (eliminación de todos los grupos protectores restantes) de la molécula objetivo final se completa entonces fuera de la plataforma de automatización como una regla, ya que generalmente implica el gas de hidrógeno explosivo y el paladio. La etapa de desprotección final se llevó a cabo en banco superior fuera de la plataforma de automatización. El primer paso fue ozonolisis del doble enlace en la etiqueta fluorosa seguido por oxidación del aldehído producido a un ácido carboxílico. El producto se purificó por cromatografía en columna. El paso final fue la desprotección de grupos éter de bencilo por hidrogenación catalizada con paladio. El producto se pasa a través de celita almohadilla para deshacerse de paladio para obtener producto final puro. </li></ol> 2. De alto rendimiento funcionalización superficial de nanopartículas <ol><li> De alto rendimiento de síntesis de polímeros y la fabricación de nanopartículas se lleva a cabo siguiendo el mismo protocol y robótica configurar descrito por Petersen et al 19. Los sistemas de copolímero utilizado para la fabricación de partículas se basa en el ácido sebácico (SA) y 1,6-bis (para-carboxifenoxi) hexano (LPA), y 1,8-bis-( para-carboxifenoxi) -3,6-dioxaoctano (CPTEG) y CPH. Una representación esquemática del aparato de deposición robótica utilizada se presenta en la Figura 1b. </li><li> Después de la fabricación de nanopartículas, el soporte que contiene los tubos con la biblioteca de nanopartículas se vuelve a unir a la etapa de actuador lineal. </li><li> Para la fijación de hidratos de carbono a la superficie de las partículas de polianhídrido, una reacción ácido amino-carboxílico acoplamiento 20 que consta de dos reacciones consecutivas se lleva a cabo. </li><li> Para la primera reacción, la jeringa en la bomba de jeringa programable primero se llena con 10 equivalentes (Ec.) (equivalentes de media concentración molar de ácido carboxílico en la superficie de las partículas) de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-bisrbodiimide clorhidrato (EDC) y la ecuación 10. de etilendiamina en una solución acuosa, mientras que la jeringa en la bomba de jeringa programable segundo está cargado con 12 eq. de N-hidroxisuccinimida (NHS) en solución acuosa. </li><li> Con el programa LabVIEW, las suspensiones de reactivos son depositados en la biblioteca de * nanopartículas. </li><li> A continuación, cada muestra se sometió a sonicación (30 s en 40 Hz) y el soporte del tubo está separado de la plataforma robótica. </li><li> Suspensiones de nanopartículas se incuban durante 9 h ** con rotación constante a 4 ° C. </li><li> Después del tiempo de reacción se ha completado, los tubos se centrifugaron (12.000 xg durante 5 min) y devuelto a la estación de robótica para realizar dos etapas de lavado. </li><li> Para el lavado, una jeringa queda vacío y cargado en la bomba de jeringa programable primero, mientras que la jeringa en la bomba de jeringa segundo se llena con agua fría. El sobrenadante de cada tubo se retira la jeringa vacía y los depósitos de la bomba segundo de agua fría. </li><li> Homogeneización de los nanosuspensión de partículas se realizó como se describió en el paso 2,6. Los tubos se centrifugan (12000 xg durante 5 min) y una segunda etapa de lavado se realizó como se describió en el paso 2,9. </li><li> Para la segunda reacción, dos etapas de deposición se utilizan. En la primera fase de depósito, 12 eq. de EDC se cargan con una bomba y eq 12. NHS de se cargan con la segunda bomba. </li><li> La segunda fase de depósito incluye 10 eq. de un sacárido específica sobre las bombas primera y segunda (es decir, galactosa, lactosa o di manosa-) *** y una tercera bomba con 10 eq. de ácido glicólico (utilizado como control ****). </li><li> Las suspensiones de nanopartículas se homogeneizó como se describe en el paso 2,6 y se incubaron durante 9 horas con rotación constante a 4 ° C. </li><li> Después del tiempo de reacción se ha completado, una etapa de lavado se realiza como se describe en los pasos 2.8, 2.9 y 2.10. </li><li> La biblioteca de nanopartículas funcionalizado se coloca entonces en una cámara de vacío para secar durante al menos 2 horas. </li><li> Las nanopartículas funcionalizadas son entonces de carácterzado por espectroscopía de rayos X de fotoelectrones y un alto rendimiento de fenol-sulfúrico ensayo del ácido para determinar la composición de la superficie y la concentración del sacárido respectivamente. Microscopía electrónica de barrido y dispersión dinámica de luz se utilizan para determinar el tamaño de partícula, distribución de tamaño, y la carga superficial. </li></ol> Notas: * Los volúmenes de deposición varía con la masa de nanopartículas contenidas en cada tubo. Veces ** de reacción para las reacciones primera y segunda se puede cambiar para ajustar la concentración de sacárido final. *** Cada sacárido se deposita en tubos de ensayo en función del grupo que desee. **** Para la reacción específica empleada en este estudio para la unión de los hidratos de carbono, ácido glicólico se utiliza como un control de enlazador desde sacáridos desprotegidos ya tienen esta molécula unida covalentemente, que permite una unión más a la superficie de las nanopartículas. 3. Los resultados representativos El útildimannoside ly protegido se muestra en la Figura 2 se sintetizó utilizando la plataforma de automatización. El compuesto sintetizado se caracterizó por 1 H RMN en un espectrómetro VXR 400 MHz usando CDCl $ 3 como disolvente. El espectro de RMN se muestra en la Figura 3. Utilizando la fabricación de nanopartículas de alto rendimiento y funcionalización de nanopartículas polianhídrido se describe aquí, la unión de lactosa dimannose, y galactosa se ​​ha llevado a cabo con éxito 10, 11. Utilizando esta configuración, las condiciones óptimas de reacción (es decir, temperatura de reacción y el tiempo) se identificaron para lograr funcionalización deseada nanopartículas y morfología. Cuando la reacción se llevó a cabo a 4 ° C en lugar de la temperatura ambiente, una reducción en la agregación de nanopartículas se observó por SEM (datos no presentados). La Tabla 1 muestra los resultados representativos de la caracterización de CPTEG 50:50 funcionalizado CPH: nanopartículas, ya sea con di-manosa olactosa, sintetizado a 4 ° C. Los datos indican un pequeño aumento en el diámetro promedio de nanopartículas, debido a la funcionalización. Mientras que las nanopartículas no funcionalizados tenía un potencial zeta negativo de aprox. -20 MV, las partículas funcionalizadas mostró un valor positivo del potencial zeta, lo que demuestra el éxito de la funcionalización de la superficie de las nanopartículas. La lactosa y di-manosa son azúcares neutros, sin embargo, los grupos amina libres de la etilendiamina enlazador utilizados para unir los sacáridos pueden ser responsables de la potencial zeta positivo. El tiempo de reacción es otra variable que podría afectar tanto a la morfología final de las nanopartículas y el grado de unión del azúcar alcanzado. Al ajustar el tiempo de reacción, la concentración final de azúcar unido a la superficie nanopartículas pueden controlarse como se muestra en la Figura 4A. Como se esperaba, la concentración de dimannose en la superficie de 50:50 CPTEG: CPH nanopartículas aumentó conel tiempo total de reacción y alcanzó un máximo después de 18 h. Las nanopartículas funcionalizadas con el tiempo de reacción total de 24 horas se utilizaron para evaluar la posibilidad de dirigir CLR en el mouse de la médula ósea derivados de las células dendríticas (DC). La citometría de flujo se utilizó para evaluar la expresión de dos receptores CL (es decir, CIRE (CD209, la DC-SIGN) y el receptor de manosa (CD206)) después de la estimulación con no funcionalizado, y la lactosa y di-manosa nanopartículas funcionalizadas (Figura 4B). Una mayor expresión de ambos receptores, que es un indicativo de focalización eficaz, se obtuvo cuando las células se estimularon con ambos lactosa y di-manosa nanopartículas funcionalizados. Sin embargo, di-manosa-funcionalizados partículas mostraron un mayor nivel de expresión que indica una especificidad de este ligando para los receptores que se estudiaron. <table border="1"><tbody><tr><td> Nanopartículas de tipo </td><td> Diámetro medio de partícula (nm) </td><td> Avenidala rabia de partículas ζ-potencial (mV) </td></tr><tr><td> No funcionalizado </td><td> 162 ± 43 </td><td> -20 ± 0,6 </td></tr><tr><td> Lactosa </td><td> 235 ± 34 </td><td> 26 ± 2,4 </td></tr><tr><td> Di-manosa </td><td> 243 ± 32 </td><td> 30 ± 4,2 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Caracterización de las nanopartículas. No funcionalizado y funcionalizado se caracteriza por la dispersión de luz cuasi-elástica y las mediciones de potencial zeta. Los datos del tamaño de partícula representan el valor medio ± desviación estándar (DE) de la dinámica de los datos de dispersión de luz obtenidos en tres experimentos independientes. Datos de potencial zeta representan el valor medio ± desviación estándar de tres mediciones independientes. Cambio en el signo del potencial zeta demuestra que el azúcar era eficiente conjugado con el CPTEG 50:50: superficie de las nanopartículas CPH. <img alt="Figura 1" src<html> = &quot;/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. (A) Representación gráfica de la aproximación a cabo con la funcionalización de las nanopartículas de hidratos de carbono polianhídrido y un ejemplo de las bibliotecas de nanopartículas funcionalizadas que podrían ser diseñadas con el descrito enfoque de alto rendimiento. (B) Representación esquemática del aparato de deposición automatizado utilizado para funcionalización de partículas, que consiste en (i) tres NE 1000 bombas, (ii) una etapa robótico integrado por dos actuadores (Zaber): uno para el movimiento en la dirección x, y el otro para el movimiento en la dirección y, (iii) una segunda etapa robótico con dos bastidores adyacentes (apropiado para tubos y cubetas) que consta de tres actuadores, uno para cada dirección (x, y, z). Las bombas y un total de cinco actuadores están conectados en serie. Los actuadores y bombas son accionadas por un ordenador utilizando el software LabVIEW. Este diagrama no está a escala.arge.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig2.jpg" /> Figura 2. Representación gráfica de la automatizado iterativo síntesis de hidratos de carbono utilizando manosa como un ejemplo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig3.jpg" /> Figura 3. 1 H RMN de la dimannoside protegido. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3967/3967fig4.jpg" /> Figura 4 (A). Efecto del tiempo de reacción sobre la concentración de nanopartículas superficie de sacárido. En los datos mostrados, 50:50 CPTEG: nanopartículas CPH se funcionalizado con dimannose a diferentes tiempos de reacción y la reacción se llevó a cabo a 4 ° C. El error medio y estándar de dos experimentos independientes de funcionalización se muestra. (B) a la lactosa y la di-manosa funcionalizados nanopartículasefectivamente objetivo de la DC-SIGN (CIRE, CD209) y manosa receptor (CD206) en la médula ósea procedentes de células dendríticas como lo demuestra el aumento de expresión de estos dos marcadores tras la estimulación con CPTEG 50:50 funcionalizado: nanopartículas de CPH, en comparación con la expresión obtenida no funcionalizados con partículas.

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NLBP es co-fundador y tiene acciones en la compañía de hidratos de carbono LuCella Biosciences, Inc.

La eficacia de los hidratos de carbono como agentes dirigidos a las interacciones de nanopartículas directos a las células inmunes se ha demostrado anteriormente 10, 11. Investigaciones previas en nuestros laboratorios han mostrado que los azúcares específicos a los que las nanopartículas polianhídrido son capaces de dirigir CLR diferentes en las células presentadoras de antígeno (APC), mejorando así la activación de células inmunes, que puede ser importante para la posterior activación de las cé...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Motorizada XYZ Etapa: 3x T-LSM050A, 50 mm de recorrido por eje </td><td> Zaber Tecnologías </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 bomba de jeringa individual </td><td> Nuevos sistemas de la Era de la bomba </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Al Aire Tubos de vidrio reutilizables Cultura </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> ASW 1000 </td><td> Chemspeed Tecnologías </td><td></td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> SGE Tight Gas Jeringas, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> XL-2000 Sonicator </td><td> Qsonica </td><td> Q55 </td></tr><tr><td> Mini-tubo rotador </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-450-127 </td></tr></tbody></table>

high-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles

Enfoques transdisciplinarios que involucran áreas como el diseño de materiales, la nanotecnología, la química y la inmunología que se utilizarán para diseñar racionalmente los transportistas vacunas eficaces. Basados ​​en nanopartículas plataformas puede prolongar la persistencia de los antígenos de la vacuna, lo que podría mejorar la vacuna contra la inmunogenicidad 1. Varios polímeros biodegradables se han estudiado como vehículos de entrega de vacunas 1; en particular, las partículas de polianhídrido han demostrado la capacidad para proporcionar una liberación sostenida de antígenos proteicos estables y para activar las células presentadoras de antígenos y modular la respuesta inmune 2-12. El diseño molecular de estos portadores de vacunas necesita para integrar la selección racional de las propiedades del polímero, así como la incorporación de agentes adecuados de focalización. De fabricación de alto rendimiento automatizado de los ligandos y partículas funcionalizadas es una potente herramienta que aumentará la capacidad para estudiar una amplia range de las propiedades y se traducirá en el diseño de dispositivos de administración de vacunas reproducibles. La adición de ligandos capaces de ser reconocida por receptores específicos en las células del sistema inmune se ha demostrado que modulan la respuesta inmune y adaptar 10,11,13 C-receptores de tipo lectina (CLR) son los receptores de reconocimiento de patrones (RRP), que reconocen los hidratos de carbono presentes en el superficie de patógenos. La estimulación de células inmunes a través de CLR permite la internalización mejorada de antígeno y posterior presentación para la activación de células T más 14,15. Por lo tanto, las moléculas de hidratos de carbono juegan un papel importante en el estudio de las respuestas inmunes, sin embargo, el uso de estas biomoléculas menudo sufre de la falta de disponibilidad de estructuralmente bien definidos y los hidratos de carbono puro. Una plataforma de automatización basada en un proceso iterativo fase de solución reacciones pueden permitir la síntesis rápida y controlada de estas moléculas sintéticamente desafiantes con b significativamente menoronstruyendo cantidades de bloques que los tradicionales métodos en fase sólida 16,17. Aquí nos presenta un protocolo para la solución automatizada de la síntesis en fase de oligosacáridos como la manosa-basados ​​en ligandos con fluorosa extracción en fase sólida para la purificación intermedia. Después del desarrollo de métodos automatizados para hacer que el agente de carbohidratos selección de base, se describen métodos para su fijación en la superficie de polianhídrido nanopartículas empleando un conjunto robótico automatizado hasta operado por LabVIEW como se ha descrito previamente 10. Funcionalización de superficies con los hidratos de carbono ha demostrado su eficacia en la orientación CLR 10,11 y aumentar el rendimiento del método de fabricación para descubrir las complejidades asociadas con un sistema multi-paramétrico será de gran valor (Figura 1a).

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High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

En este artículo, un método de alto rendimiento se presenta para la síntesis de oligosacáridos y su fijación a la superficie de las nanopartículas polianhídrido para su uso posterior en la orientación de receptores específicos en las células presentadoras de antígenos.

De alto rendimiento de síntesis de carbohidratos y funcionalización de nanopartículas polianhidrido

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

high-throughput-synthesis-carbohydrates-functionalization

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K vistas.  Iowa State University. En este artículo, un método de alto rendimiento se presenta para la síntesis de oligosacáridos y su fijación a la superficie de las nanopartículas polianhídrido para su uso posterior en la orientación de receptores específicos en las células presentadoras de antígenos.

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays de polímeros de alto rendimiento para el descubrimiento de Biomateriales

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Investigación

Bioingeniería

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Síntesis combinatoria y de alto rendimiento liberación de proteínas de película de polímero y nanopartículas Bibliotecas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Activación de los macrófagos alveolares murinos recolección y evaluación de celular inducida por nanopartículas polianhidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement from a bulk fluid environment with applications in high throughput screening, cytometry, and mass spectrometry. We describe a method to not only encapsulate single cells, but to repeatedly capture a set number of cells (here we demonstrate one- and two-cell encapsulation) to study both isolation and the interactions between cells in groups of controlled sizes. By combining drop generation techniques with cell and particle ordering, we demonstrate controlled encapsulation of cell-sized particles for efficient, continuous encapsulation. Using an aqueous particle suspension and immiscible fluorocarbon oil, we generate aqueous drops in oil with a flow focusing nozzle. The aqueous flow rate is sufficiently high to create ordering of particles which reach the nozzle at integer multiple frequencies of the drop generation frequency, encapsulating a controlled number of cells in each drop. For representative results, 9.9 &mu;m polystyrene particles are used as cell surrogates. This study shows a single-particle encapsulation efficiency Pk=1 of 83.7% and a double-particle encapsulation efficiency Pk=2 of 79.5% as compared to their respective Poisson efficiencies of 39.3% and 33.3%, respectively. The effect of consistent cell and particle concentration is demonstrated to be of major importance for efficient encapsulation, and dripping to jetting transitions are also addressed. 
Introduction 
Continuous media aqueous cell suspensions share a common fluid environment which allows cells to interact in parallel and also homogenizes the effects of specific cells in measurements from the media. High-throughput encapsulation of cells into picoliter-scale drops confines the samples to protect drops from cross-contamination, enable a measure of cellular diversity within samples, prevent dilution of reagents and expressed biomarkers, and amplify signals from bioreactor products. Drops also provide the ability to re-merge drops into larger aqueous samples or with other drops for intercellular signaling studies.1,2 The reduction in dilution implies stronger detection signals for higher accuracy measurements as well as the ability to reduce potentially costly sample and reagent volumes.3 Encapsulation of cells in drops has been utilized to improve detection of protein expression,4 antibodies,5,6 enzymes,7 and metabolic activity8 for high throughput screening, and could be used to improve high throughput cytometry.9 Additional studies present applications in bio-electrospraying of cell containing drops for mass spectrometry10 and targeted surface cell coatings.11 Some applications, however, have been limited by the lack of ability to control the number of cells encapsulated in drops. Here we present a method of ordered encapsulation12 which increases the demonstrated encapsulation efficiencies for one and two cells and may be extrapolated for encapsulation of a larger number of cells.
To achieve monodisperse drop generation, microfluidic "flow focusing" enables the creation of controllable-size drops of one fluid (an aqueous cell mixture) within another (a continuous oil phase) by using a nozzle at which the streams converge.13 For a given nozzle geometry, the drop generation frequency f and drop size can be altered by adjusting oil and aqueous flow rates Qoil and Qaq. As the flow rates increase, the flows may transition from drop generation to unstable jetting of aqueous fluid from the nozzle.14 
When the aqueous solution contains suspended particles, particles become encapsulated and isolated from one another at the nozzle. For drop generation using a randomly distributed aqueous cell suspension, the average fraction of drops Dk containing k cells is dictated by Poisson statistics, where Dk = &lambda;k exp(-&lambda;)/(k!) and &lambda; is the average number of cells per drop. The fraction of cells which end up in the "correctly" encapsulated drops is calculated using Pk = (k x Dk)/&Sigma;(k' x Dk'). The subtle difference between the two metrics is that Dk relates to the utilization of aqueous fluid and the amount of drop sorting that must be completed following encapsulation, and Pk relates to the utilization of the cell sample. As an example, one could use a dilute cell suspension (low &lambda;) to encapsulate drops where most drops containing cells would contain just one cell. While the efficiency metric Pk would be high, the majority of drops would be empty (low Dk), thus requiring a sorting mechanism to remove empty drops, also reducing throughput.15
Combining drop generation with inertial ordering provides the ability to encapsulate drops with more predictable numbers of cells per drop and higher throughputs than random encapsulation. Inertial focusing was first discovered by Segre and Silberberg16 and refers to the tendency of finite-sized particles to migrate to lateral equilibrium positions in channel flow. Inertial ordering refers to the tendency of the particles and cells to passively organize into equally spaced, staggered, constant velocity trains. Both focusing and ordering require sufficiently high flow rates (high Reynolds number) and particle sizes (high Particle Reynolds number).17,18 Here, the Reynolds number Re =uDh/&nu; and particle Reynolds number Rep =Re(a/Dh)2, where u is a characteristic flow velocity, Dh [=2wh/(w+h)] is the hydraulic diameter, &nu; is the kinematic viscosity, a is the particle diameter, w is the channel width, and h is the channel height. Empirically, the length required to achieve fully ordered trains decreases as Re and Rep increase. Note that the high Re and Rep requirements (for this study on the order of 5 and 0.5, respectively) may conflict with the need to keep aqueous flow rates low to avoid jetting at the drop generation nozzle. Additionally, high flow rates lead to higher shear stresses on cells, which are not addressed in this protocol. The previous ordered encapsulation study demonstrated that over 90% of singly encapsulated HL60 cells under similar flow conditions to those in this study maintained cell membrane integrity.12 However, the effect of the magnitude and time scales of shear stresses will need to be carefully considered when extrapolating to different cell types and flow parameters. The overlapping of the cell ordering, drop generation, and cell viability aqueous flow rate constraints provides an ideal operational regime for controlled encapsulation of single and multiple cells.
Because very few studies address inter-particle train spacing,19,20 determining the spacing is most easily done empirically and will depend on channel geometry, flow rate, particle size, and particle concentration. Nonetheless, the equal lateral spacing between trains implies that cells arrive at predictable, consistent time intervals. When drop generation occurs at the same rate at which ordered cells arrive at the nozzle, the cells become encapsulated within the drop in a controlled manner. This technique has been utilized to encapsulate single cells with throughputs on the order of 15 kHz,12 a significant improvement over previous studies reporting encapsulation rates on the order of 60-160 Hz.4,15 In the controlled encapsulation work, over 80% of drops contained one and only one cell, a significant efficiency improvement over Poisson (random) statistics, which predicts less than 40% efficiency on average.12
In previous controlled encapsulation work,12 the average number of particles per drop &lambda; was tuned to provide single-cell encapsulation. We hypothesize that through tuning of flow rates, we can efficiently encapsulate any number of cells per drop when &lambda; is equal or close to the number of desired cells per drop. While single-cell encapsulation is valuable in determining individual cell responses from stimuli, multiple-cell encapsulation provides information relating to the interaction of controlled numbers and types of cells. Here we present a protocol, representative results using polystyrene microspheres, and discussion for controlled encapsulation of multiple cells using a passive inertial ordering channel and drop generation nozzle.

Combining monodisperse drop generation with inertial ordering of cells and particles, we describe a method to encapsulate a desired number of cells or particles in a single drop at kHz rates. We demonstrate efficiencies twice exceeding those of unordered encapsulation for single- and double-particle drops.

De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

Microfluidic encapsulation methods have been previously utilized to capture cells in picoliter-scale aqueous, monodisperse drops, providing confinement ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

La evaluación de la administración de genes nanopartículas poliméricas por nanopartículas de análisis de seguimiento y de alto rendimiento Citometría de Flujo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the synthesis of hydrophobic nanoparticles, our method is based on an adaptation from thermal decomposition method to microwave driven synthesis. The new methodology produces a decrease in the reaction times in comparison with traditional procedures. Moreover, the use of the microwave technology increases the reproducibility of the reactions, something important from the point of view of clinical applications. The novelty of this iron oxide nanoparticle is the attachment of Neridronate. The use of this molecule leads a bisphosphonate moiety towards the outside of the nanoparticle that provides Ca2+ binding properties in vitro and selective accumulation in vivo in the atheroma plaque. The protocol allows the synthesis and plaque detection in about 3 hr since the initial synthesis from organic precursors. Their accumulation in the atherosclerotic area in less than 1 hr provides a contrast agent particularly suitable for clinical applications.

Microwave technology enables extremely fast synthesis of iron oxide nanoparticles for atherosclerosis plaque characterization. The use of an aminobisphosphonate in the external side of the nanoparticle provides a fast accumulation in the atherosclerotic area.

Síntesis microondas impulsada de nanopartículas de óxido de hierro para la detección rápida de la aterosclerosis

A fast and reproducible microwave-driven protocol has been developed for the synthesis of neridronate-functionalized nanoparticles. Starting from the ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...