Este trabajo fue apoyado por NSF HRD-0630456, un programa de CREST NSF y NSF es DMR-0934142.

1. Síntesis de α, ω-dihidroxilo Polímero [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] <ol><li> Montar reactor de polimerización, como se muestra en la figura 1. El reactor de este experimento son una parte inferior 100 ml redondo de 2 bocas que tiene un conjunto estándar de conicidad exterior (ChemGlass), dos adaptadores de control de flujo con llaves de paso (ChemGlass), y una varilla de agitación de teflón. Adaptador A (Figura 1) se utiliza para mantener de ultra alta pureza (UHP) de nitrógeno que fluye a través del sistema con el fin de evitar que el aire y la humedad entren en el sistema inerte. Adaptador B (Figura 1) se utiliza para inyectar el monómero de disolvente, y el iniciador en el matraz de reacción. </li><li> Secar 200 ml de tetrahidrofurano (THF) sobre el metal Na, usando benzofenona como indicador, durante un mínimo de 6 h bajo gas nitrógeno seco. </li><li> Secar 10 ml de 2-metoxiestireno sobre hidruro de calcio durante 24 horas. </li><li> Preparar un baño de temperatura fría mantenida a -78 ° C utilizando una suspensión de isopropanol unand nitrógeno líquido. </li><li> Añadir 25 ml de THF en el matraz de reacción de polimerización (véase la Figura 1) en gas nitrógeno y mantener reactor bajo gas nitrógeno durante toda la polimerización. </li><li> Colocar 100 ml matraz de fondo redondo en suspensión. </li><li> Añadir 2 ml (0,27 mmol / ml) de la solución de iniciador en el matraz de reacción. </li><li> Inyectar el primer monómero, 2-metoxiestireno (4 ml) al matraz de reacción. </li><li> La reacción se deja proceder durante 40 min. </li><li> Añadir 1 ml del segundo monómero, óxido de etileno. </li><li> Permitir la polimerización para continuar a temperatura ambiente durante dos días. </li><li> Terminar el polímero con HCl (6 M) / metanol (1/20, vol / vol). </li><li> Se purifica el polímero por precipitación en hexanos y el polímero seco en un horno de vacío. </li><li> Caracterizar el polímero mediante RMN. </li></ol> 2. La funcionalización de α, ω-dihidroxilo polímero con ácido caproico N-2 ,4-DNP-Ε-amino para obtener el Polym Functionaler, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP <ol><li> En un matraz de tres bocas, colocar el α, ω-dihidroxilo polímero (0,05 mmol), el ácido caproico N-2 ,4-DNP-E-amino (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) y DMAP (0,005 mmol) y secar en línea de vacío durante 4 horas. </li><li> Destilar diclorometano seco (10 ml) en el matraz. </li><li> Liberar el vacío en atmósfera de nitrógeno y se agita la reacción durante 12 horas a temperatura ambiente. </li><li> Filtrar mezcla de reacción y recuperar polímero por precipitación dos veces en hexanos y metanol. </li><li> Dry precipitó polímero en un horno de vacío a 40 ° C. </li><li> Determinar la estructura del polímero y la funcionalidad por FT-IR y 1 H RMN. </li></ol> 3. Preparación de la solución para CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT Electrospinning <ol><li> Disolver 20% w de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP en clorobenceno. </li><li> Disolver 20% y el 40% w w de poliestireno (MW 800.000) en clorobenceno para preparar dos soluciones. El poliestireno molecular más alto se utiliza para cada veze polímero de cadena de cadena de enredado y obtener la viscosidad óptima requerida para electrospinning. </li><li> Mezclar las soluciones poliméricas preparadas en 3,1 y 3,2 para formar 1:1 y 1:2 proporciones de los polímeros y añadir 1% en peso nanotubos de carbono (SWCNT) a la mezcla y se agita durante la noche para la distribución uniforme de los CNT. </li></ol> 4. Electrospinning de Polymer-CNT compuesto <ol><li> Montar el electrospinning configura como se muestra en la Figura 2. En el lado derecho de la figura es la fuente de alto voltaje Glassman. Junto a él es un soporte de retorta en la que se adjunta la oblea de silicio. A la izquierda hay otro soporte vertical sobre el que se monta la jeringa y detrás de ella es la lámpara para visualizar el procedimiento de medida que avanza. </li><li> Usando una jeringa hipodérmica, retirar una pequeña cantidad de la mezcla CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT (aproximadamente 1 ml) y montar la jeringa hipodérmica en el soporte de retorta. </li><li> Una oblea de silicio es el monteed a través de la jeringa de forma segura a una distancia de 10 cm, y el clip de tierra de la fuente de alta tensión está unida a él. </li><li> Coloque el clip teniendo la alta tensión que se aplica a la aguja en la jeringa, el émbolo un poco (para suspender una gota en la punta de la aguja) y en este punto, electrospinning está listo. </li><li> Alimentación de la fuente de alta tensión y ajustar la tensión de metro a 10 kV. Dependiendo de la naturaleza de los polímeros en el material compuesto, voltajes más altos puede ser necesario, especialmente si nanofibras de menos de cien nanómetros de diámetro se desea. </li><li> Oblea de silicio Desmontar y colocar en un desecador durante la noche se seque por completo. </li></ol> 5. Caracterización de nanofibras <ol><li> La imagen inicial de nanofibras se realiza con microscopio óptico para observar la perspectiva global de las fibras. </li><li> Utilizar microscopio electrónico de barrido para observar detalles finos, como morfología, diámetro, tamaño de poro medio, etc </li><li> Llevarcabo de imágenes aún más con un Microscopio de Fuerza Atómica para observar 3-D topografía de fibras, etc </li></ol> 6. Especificidad de unión de nanofibras con anti-IgE DNP Protein <ol><li> Preparar una solución de 4 ug / l marcada con fluorescencia, FITC-IgE (fluoresceína Isothio-cianato-Inmunoglobulina E) en PBS-BSA (tampón fosfato salino-Albúmina de Suero Bovino) solución. </li><li> Colocar un pequeño trozo de oblea de silicio sobre los que hay nanofibras sobre un cubreobjetos de MatTek bien. Incubar las nanofibras en esta solución durante una hora. La incubación es efectuada pipeteando suavemente hacia fuera, 10 ul solución IgE sobre la oblea de silicio. </li><li> Después de la incubación, retirar IgE no unido mediante lavado de la muestra tres veces con la solución tampón PBS-BSA. La solución de PBS se dispensa suavemente en la pared de la cápsula MatTek, a fin de evitar el tampón de chorros directamente sobre las nanofibras. Agitar la placa suavemente con la mano, para distribuir la solución tampón en nanofibras. Retire cuidadosamente tampón con una pipeta y reTurba esto dos veces más. </li><li> Para el control, se incuba nanofibras en marcado con fluorescencia IgG (no específico para DNP) en las mismas condiciones. </li><li> Visualizar las fibras unidas con un microscopio confocal para observar la unión con la IgE. Para nuestro estudio, el microscopio confocal Leica utilizado fue TCS SP2 con 63x lente. </li></ol> 7. Corriente-tensión Comportamiento de nanofibras <ol><li class="jove_content"> Conecte dos posicionadores micro a una fuente de corriente muy baja, como el Keithley 6430 SourceMeter sensible. El establecido para la determinación del comportamiento de la tensión actual se muestra en la Figura 3. Esta figura muestra la estación de la sonda utilizada para determinar las características iniciales IV de las nanofibras. Se compone de la Bausch and Lomb Microscopio MicroZoom, una etapa de vacío Chuck, y cuatro Micropositioners utilizados en el sondeo. En la parte superior derecha está el Agilent 34405A Multímetro digital utilizado en la medición de la tensión y por debajo es que la<html> Keithley 6430 Sub-Femtoamp Meter Fuente remoto utilizado para la fuente de las bajas corrientes de entrada que eran en las fibras. </li><li class="jove_content"> Montar los brazos de la sonda de los posicionadores micro sobre la estera de fibra en lados opuestos con las puntas que tocan las fibras. </li><li class="jove_content"> Conecte otros dos posicionadores micro a un multímetro digital, montar los brazos de la sonda en el medio de los otros dos y aterrizar los consejos sobre la estera de fibra. Asegúrese de que las cuatro extremidades son colineales como posible. </li><li class="jove_content"> Entrada de cantidades variables de corriente a partir de la Keithley (típicamente en el intervalo nanoamps). </li><li class="jove_content"> Medir la caída de voltaje a través de las puntas exteriores, para cada magnitud de corriente suministrada. </li><li class="jove_content"> Trazado de estos valores indican el tipo de dispositivo de la estera de fibra actúa como. </li></ol> 8. Los resultados representativos Polímero con funcionalidad &quot;&gt; El método para la síntesis de α, ω-bi [2,4-dinitrofenilo caproico] [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) se muestra en la Figura 4. 1 La estructura del polímero funcional fue confirmada por FT-IR (Figura 5) y 500 MHz 1 H espectroscopía de RMN (Figura 6). El FT-IR muestra la desaparición completa de los el-OH de absorción ancha que alrededor de 3.500 cm -1 indicando funcionalización cuantitativa con el grupo CDNP. Esto también se confirma por el espectro de RMN muestra en la Figura 6. Uso de la integración de los picos en el espectro de RMN, se determinó que la CDNP-PEO polímeros-P2MS-PEO-CDNP están cuantitativamente funcionalizado. Nanofibras En la Figura 7, una estera de nanofibras conductoras obtenidas por electrohilado CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT de clorobenceno es shpropia. Confocal de imágenes obtenidos mostraron que la proteína IgE se une con el DNP en la superficie de la fibra. 3 Esta es una indicación de la especificidad de la unión de electrohiladas DNP-polímeros hacia anticuerpo IgE. La intensidad de la luz es un indicador de la presencia de IgE en las nanofibras como la proteína está marcado con fluorescencia. La Figura 8a es un AFM (microscopio de fuerza atómica) imagen de una de las nanofibras obtenidas por este proceso y la Figura 8b muestra la dimensión de este nanofibras particular, es de alrededor de 150 nm de diámetro. Mediante este proceso las fibras entre 100-700 nm se obtienen. En esta época actual es un reto para preparar fibras con una dimensión específica. Esto es consistente con lo observado por otros grupos. 4 La Figura 9 muestra imágenes de SEM de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT nanofibras y el diámetro de las nanofibras eran entre 200 nm a 300 nm. Hay tres SEM imágenes de nanofibers muestra a diferentes aumentos. Estudio de las tres imágenes muestra la morfología de las fibras son lineales y en perlas. El objetivo general es preparar fibras que son en su mayoría lineal. Figura 10 muestra el gráfico IV de esteras de nanofibras preparados a partir de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT. La gráfica muestra el comportamiento de una resistencia (óhmica). Cuando el antígeno se une a las nanofibras, se espera ver un cambio en el comportamiento IV de la estera de fibra que este cambio de resistencia es una característica que sugiere que las fibras funcionales tienen aplicación potencial como el componente activo en sensores para detección de moléculas individuales . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig1.jpg" /> Figura 1. Reactor de polimerización para la síntesis de la α, ω-dihidroxilo polímero. A) El punto de inyección para el flujo de gas nitrógeno UHP. B.) del punto de inyección para el disolvente, el monómero y el iniciador. C) El recipiente de reacción. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig2.jpg" /> Figura 2. Configuración utilizada para electrospinning usando una fuente de alta tensión Glassman. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig3.jpg" /> Figura 3. Configuración utilizada para medir parcelas IV utilizando una Sub-femtoamp remoto SourceMeter (Keithley). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig4.jpg" /> Figura 4. Un enfoque). Sintético para la preparación de los OH-PEO-P2MS-PEO-OH polímeros. B) La funcionalización de α, ω-dihidroxi [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)]. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig5.jpg" /> Figura 5. Espectros FT-IR de (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, precursor de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP y (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP. <img alt="La figura 6"src = &quot;/ files/ftp_upload/4135/4135fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. 500 MHz RMN de protón de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig7.jpg" /> Figura 7. Una imagen) La unión de FITC-IgE con CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP fibras electrospun de clorobenceno. B) Imagen de microscopia confocal del control (nanofibras con IgG). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig8.jpg" /> Figura 8. A) Imagen AFM de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP fibras electrohiladas de clorobenceno y B) AFM perfil dimensión es decir, de una fibra se muestra en la Figura 5a. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig9.jpg" /> Figura 9. Imágenes de SEM de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT nanofibras. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/4135/4135fig10.jpg"/&gt; Figura 10. Complot IV de esteras de nanofibras preparados a partir de CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / poliestireno / SWCNT.

<ol>
	<li>Sannigrahi, B., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+Characterization+of+&#945;,&#969;-bi[2,4-dinitrophenyl+(DNP)]+poly(2-methoxystyrene)+Functional+Polymers.+Preliminary+Evaluation+of+the+Interaction+of+the+Functional+Polymers+with+RBL+Mast+Cells.">Synthesis and Characterization of &#945;,&#969;-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells.</a> Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).</li><li>Gordon, K., Sannigrahi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Optically+Active+Helical+Poly(2-methoxystyrene).+Enhancement+of+HeLa+and+Osteoblast+Cell+Growth+on+Optically+Active+Helical+Poly(2-methoxystyrene)+Surfaces.">Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).</li><li>Baird, E. J., Holowka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Effective+Poly(Ethylene+Glycol)+Architectures+for+Specific+Inhibition+of+Immune+Receptor+Activation.">Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation.</a> Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).</li><li>Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -. E., Ma, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , (2005).</li><li>Kameoka, J., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+Oriented+Polymeric+Nanofibers+on+Planar+Surfaces+by+Electrospinning.">Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning.</a> Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).</li><li>Ramakrishna, S., Lala, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Nanofibers+for+Biosensor+Applications.">Polymer Nanofibers for Biosensor Applications.</a> Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).</li><li>Reuven, D., Sil, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Archetypical+Conductive+Polymer+Structure+for+Specific+Interaction+with+Proteins.">Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins.</a> Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , (2012).</li><li>Ogunro, O., Karunwi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chiral+Asymmetry+of+Helical+Polymer+Nanowire.">Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire.</a> The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este informe, hemos presentado un enfoque poderoso para la preparación de nanofibras biofuncionales. Las nanofibras están decoradas con un grupo funcional que es específico de una proteína modelo. El procedimiento y el enfoque reportada en esta comunicación es de naturaleza general y puede ser utilizado para preparar nanofibras decoradas con cualquier grupo funcional deseado. La polimerización aniónica viviente es poderoso método para sintetizar estructuras poliméricas controladas covalentemente conectados a...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Sodio metálico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 282065 </td></tr><tr><td> Benzofenona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239852 </td></tr><tr><td> 2-metoxiestireno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 563064 </td></tr><tr><td> Tetrahidrofurano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 178810 </td></tr><tr><td> El clorobenceno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 319996 </td></tr><tr><td> Single CNT paredes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 704113 </td></tr><tr><td> Poliestireno </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 81416 </td></tr><tr><td> Obleas de silicio </td><td> Silicio Misión Internacional </td><td> 720200 </td></tr><tr><td> Zeiss FESEM </td><td> Carl Zeiss Inc. </td><td> Ultra 60 </td></tr><tr><td> Probestation con Bausch &amp; Lomb MicroZoom II Microscopio de Alto Rendimiento </td><td> Bausch y Lomb </td><td></td></tr><tr><td> De exploración confocal Leica System </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP2 </td></tr><tr><td> Sub-femtoamp SourceMeter remoto </td><td> Keithley Instruments </td><td> 6430 </td></tr><tr><td> Multímetro digital de rango automático </td><td> Keithley Instruments </td><td> 175A </td></tr><tr><td> Syringe Pump </td><td> Chemyx Inc. </td><td> Fusion 200 </td></tr><tr><td> Zeiss Microscopio Óptico </td><td> Carl Zeiss Inc. </td><td> Zeiss / Axiotech </td></tr></tbody></table>

procedure for fabricating biofunctional nanofibers

Electrospinning es un método de tratamiento eficaz para la preparación de nanofibras decoradas con grupos funcionales. Nanofibras decoradas con grupos funcionales pueden ser utilizados para estudiar las interacciones de biomarcadores material-es decir, actúan como biosensores con potencial como detectores de una sola molécula. Hemos desarrollado un método eficaz para preparar polímeros funcionales donde la funcionalidad tiene la capacidad de unirse específicamente con una proteína modelo. En nuestro sistema de modelo, el grupo funcional es 2,4-dinitrofenilo (DNP) y la proteína es anti-DNP IgE (inmunoglobulina E). El polímero funcional, α, ω-bi [2,4-dinitrofenilo caproico] [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), se prepara por polimerización aniónica viviente. El iniciador difuncional utilizado en la polimerización se preparó por reacción de transferencia de electrones de α-metilestireno y metal de potasio (espejo). El monómero 2-metoxiestireno se añadióprimero al iniciador, seguido de la adición del segundo monómero, óxido de etileno, y finalmente el polímero vivo se terminó por metanol. La α, ω-dihidroxilo polímero [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] se hizo reaccionar con ácido caproico N-2 ,4-DNP-∈-amino, por acoplamiento de DCC, resultando en la formación de α, ω-bi [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poli (óxido de etileno)-b-poli (2-metoxiestireno)-b-poli (óxido de etileno)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Los polímeros se caracterizaron por FT-IR, 1 H RMN y cromatografía de permeación en gel (GPC). Las distribuciones de pesos moleculares de los polímeros eran estrechas (01.01 a 01.02) y los polímeros con pesos moleculares mayores que 50.000 se utilizó en este estudio. Los polímeros fueron polvo de color amarillo y soluble en tetrahidrofurano. A soluble en agua CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (glicol dimetoxietileno) complejo se une y alcanza el estado de equilibrio de unión con una solución de IgE en unos pocos segundos. Mayor peso molecular (es decir, insoluble en agua, alrededor de 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polímeros, que contienen 1% nanotubos de carbono de pared única (SWCNT) se procesaron en nanofibras electroactivos (100 nm a 500 nm de diámetro) sobre el sustrato de silicio. Espectroscopia de fluorescencia muestra que el anti-DNP IgE interactúa con las nanofibras mediante la unión con los grupos funcionales DNP decoración de las fibras. Estas observaciones sugieren que las nanofibras adecuadamente funcionalizados mantienen la promesa para el desarrollo de dispositivo de detección de biomarcadores.

Watch this Scientific Journal Video about Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers at JoVE.com

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Un enfoque eficaz para la preparación de nanofibras decoradas con grupos funcionales capaces de interactuar específicamente con proteínas se describe. El primer enfoque requiere la preparación de un polímero funcionalizado con el grupo funcional apropiado. El polímero funcional se fabrica en nanofibras por electrohilado. La eficacia de la unión de las nanofibras con una proteína se estudió por microscopía confocal.

Procedimiento para la fabricación de nanofibras Biofuncionales

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...

procedure-for-fabricating-biofunctional-nanofibers

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K vistas.  Clark Atlanta University. Un enfoque eficaz para la preparación de nanofibras decoradas con grupos funcionales capaces de interactuar específicamente con proteínas se describe. El primer enfoque requiere la preparación de un polímero funcionalizado con el grupo funcional apropiado. El polímero funcional se fabrica en nanofibras por electrohilado. La eficacia de la unión de las nanofibras con una proteína se estudió por microscopía confocal.

Video: Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an extremely useful method, because it allows the study of the live intact brain. With appropriate preparations, this technique allows the observation of the same cortical area chronically, from minutes to months. In this video, we show a preparation for chronic in vivo imaging of the brain using two-photon microscopy. This technique was initially pioneered by Dr. Karel Svoboda, who is now a Howard Hughes Medical Institute Investigator at Janelia Farm. Preparations like the one shown here can be used for imaging of neocortical structure (e.g., dendritic and axonal dynamics),  to record neuronal activity using calcium-sensitive dyes, to image cortical blood flow dynamics, or for intrinsic optical imaging studies. Deep imaging of the neocortex is possible with optimal cranial window surgeries. Operating under the most sterile conditions possible to avoid infections, together with using extreme care to do not damage the dura mater during the surgery, will result in successful and long-lasting glass-covered cranial windows.


This video and protocol demonstrate how to implant a glass-covered cranial window in rodents. These preparations can be used for chronic in vivo two-photon imaging of the neocortex over time scales of months. It may also be used for other types of imaging, including optical intrinsic signal imaging.

Un procedimiento de cirugía craneotomía para imágenes cerebrales crónicas

Imaging techniques are becoming increasingly important in the study brain function. Among them, two-photon laser scanning microscopy has emerged as an ...

Investigación

Biología

Murine Renal Transplantation Procedure

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell et al over 30 years ago (1) and refined by Zhang et al years later (2), few people in the world have mastered this procedure. In our laboratory we have successfully performed 1200 orthotopic kidney transplantations with &gt; 90% survival rate. The key points for success include stringent control of reperfusion injury, bleeding and thrombosis, both during the procedure and post-transplantation, and use of 10-0 instead of 11-0 suture for anastomoses.
Post-operative care and treatment of the recipient is extremely important to transplant success and evaluation. All renal graft recipients receive antibiotics in the form of an injection of penicillin immediately post-transplant and sulfatrim in the drinking water continually. Overall animal health is evaluated daily and whole blood creatinine analyses are performed routinely with a portable I-STAT machine to assess graft function.

Renal transplantation in mice is a technically challenging procedure that requires careful post-operative care and treatment for success.

Procedimiento murino Trasplante Renal

Renal orthotopic transplantation in mice is a technically challenging procedure. Although the first kidney transplants in mice were performed by Russell ...

Bioluminescence Imaging of Heme Oxygenase-1 Upregulation in the Gua Sha Procedure

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol for bioluminescent optical imaging of HO-1-luciferase transgenic mice reported in this manuscript provides a rapid in vivo assay of the upregulation of the heme oxygenase-1 (HO-1) gene expression in response to the Gua Sha procedure. HO-1 has long been known to provide cytoprotection against oxidative stress. The upregulation of HO-1, assessed by the bioluminescence output, is thought to represent an antioxidative response to circulating hemoglobin products released by Gua Sha. Gua Sha was administered by repeated strokes of a smooth spoon edge over lubricated skin on the back or other targeted body part of the transgenic mouse until petechiae (splinter hemorrhages) or ecchymosis (bruises) indicative of extravasation of blood from subcutaneous capillaries was observed. After Gua Sha, bioluminescence imaging sessions were carried out daily for several days to follow the dynamics of HO-1 expression in multiple internal organs.

Gua Sha, traditional Chinese therapeutic skin scraping, causes subcutaneous microvascular blood extravasation. We report a protocol of bioluminescence imaging of HO-1-luciferase transgenic mice to demonstrate that Gua Sha upregulates heme oxygenase-1 (HO-1) in multiple organs.

Bioluminiscencia de imágenes de hemo oxigenasa-1 Upregulation en el procedimiento de Gua Sha

Gua Sha is a traditional Chinese folk therapy that employs skin scraping to cause subcutaneous microvascular blood extravasation and bruises. The protocol ...

Mammary Epithelial Transplant Procedure

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, followed by the mammary epithelial transplant procedure. The mammary transplant procedure is widely used by mammary biologists because it takes advantage of the fact that significant development of the mammary epithelium doesn't occur until after puberty. At 3 weeks of age, growth of the mammary epithelial tree is confined to the vicinity of the nipple and the fat pad is largely devoid of mammary epithelium, but by 7 weeks of age the epithelial ductal tree extends throughout the entire fat pad. Therefore, if this small portion of the fat pad containing epithelium, the region between the nipple and the lymph node, is removed at 3 weeks of age, the endogenous epithelium will never populate the mammary fat pad and the fat pad is described as "cleared". At this time, mammary epithelium from another source can be transplanted in the cleared fat pad where it has the potential to extend mammary ductal trees through out the fat pad. This procedure has been utilized in many experimental models including the examination of tumor phenotype in transgenic mammary epithelial tissue without the confounding effects of genotype on the entire animal3, in the identification of mammary stem cells by transplanting cells in limited dilution4,5, determining if hyperplastic nodules proceed to mammary tumors6, and to assess the effect of prior hormone exposure on the behavior of the mammary epithelium7,8.
Three week old host mice are anesthetized, cleaned and restrained on a surgical stage. A mid-sagittal incision is made through the skin, but not the peritoneum, extending from the pubis to the sternum. Oblique cuts are made through the skin from the mid-sagittal incision across the pelvis toward each leg. The skin is pulled away from the peritoneum to expose the 4th inguinal mammary gland. The fat pad is cleared by removing the fat pad tissue anterior to the lymph node. Epithelium fragments or epithelial cells are transplanted into the remaining cleared fat pad and the mouse is closed.

This article demonstrates the procedure developed by DeOme KB et al. (1959) and the sparing procedure developed by Brill B et al. (2008) for clearing the 4th inguinal mammary fat pad of a pubescent mouse in preparation for transplantation of mammary fragments, mammary epithelial cells, or mammary tumor cells.

Procedimiento de mama epiteliales de Trasplantes

This article describes and compares the fat pad clearance procedure developed by DeOme KB et al.1 and the sparing procedure developed by Brill B et al.2, ...

A Chemical Screening Procedure for Glucocorticoid Signaling with a Zebrafish Larva Luciferase Reporter System

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids can lead to severe side effects. Test systems are needed to search for novel compounds influencing glucocorticoid signaling in vivo or to determine unwanted effects of compounds on the glucocorticoid signaling pathway. We have established a transgenic zebrafish assay which allows the measurement of glucocorticoid signaling activity in vivo and in real-time, the GRIZLY assay (Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY). The luciferase-based assay detects effects on glucocorticoid signaling with high sensitivity and specificity, including effects by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production. We present here a detailed protocol for conducting chemical screens with this assay. We describe data acquisition, normalization, and analysis, placing a focus on quality control and data visualization. The assay provides a simple, time-resolved, and quantitative readout. It can be operated as a stand-alone platform, but is also easily integrated into high-throughput screening workflows. It furthermore allows for many applications beyond chemical screening, such as environmental monitoring of endocrine disruptors or stress research.

We describe the procedure and data analysis of a chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling using zebrafish larvae: the Glucocorticoid Responsive In vivo Zebrafish Luciferase activitY (GRIZLY) assay. The assay sensitively and specifically detects effects on glucocorticoid signaling by compounds that require metabolization or affect endogenous glucocorticoid production.

Un procedimiento de detección química de glucocorticoides Señalización con un sistema indicador de pez cebra Larva luciferasa

Glucocorticoid stress hormones and their artificial derivatives are widely used drugs to treat inflammation, but long-term treatment with glucocorticoids ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

El aislamiento de hepatocitos humanos por una colagenasa perfusión Procedimiento de dos pasos

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedimiento para evaluar la eficacia de floculantes para la eliminación de partículas dispersas en extractos de plantas

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Procedure and Key Optimization Strategies for an Automated Capillary Electrophoretic-based Immunoassay Method

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. However, similar to other antibody-based protein assays, optimization of capillary-based immunoassay parameters, such as protein concentration, antibody dilution, and exposure time is an important prerequisite to the generation of meaningful and reliable data. Measurements must fall within the linear range of the assay where changes in signal are directly proportional to changes in lysate concentration. The process of choosing appropriate lysate concentrations, antibody dilutions, and exposure times in the human bronchial epithelial cell line, BEAS-2B, is demonstrated here. Assay linearity is shown over a range of whole cell extract protein concentrations with p53 and &#945;-tubulin antibodies. An example of signal burnout is seen at the highest concentrations with long exposure times, and an &#945;-tubulin antibody dilution curve is shown demonstrating saturation. In addition, example experimental results are reported for doxorubicin-treated cells using optimized parameters.

A capillary-based immunoassay using a commercial platform to measure target proteins from total protein preparations is demonstrated. In addition, assay parameters of exposure time, protein concentration, and antibody dilution are optimized for a cell culture model system.

Procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado

New technologies that utilize capillary-based immunoassays promise faster and more quantitative protein assessment compared to traditional immunoassays. ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

Un procedimiento ChIP-Seq semiautomatizado para estudios epigenéticos a gran escala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Mejora de la supervivencia y el desarrollo de los titíes mediante un enfoque de cría manual

Hand-Rearing Method for Infant Marmosets

The common marmoset (Callithrix jacchus) is a small and highly social New World monkey with high reproduction rates, which has been proven to be a compelling non-human primate model for biomedical and neuroscience research. Some females give birth to triplets; however, the parents cannot raise all of them. To save these infants, we have developed a hand-rearing method for raising newborn marmosets. In this protocol, we describe the formula of the food, the time for feeding, the configuration of the temperature and humidity, as well as the adaptation of the hand-reared infants to the colony environment. This hand-rearing method significantly increases the survival rate of marmoset infants (without hand-rearing: 45%; with hand-rearing: 86%) and provides the opportunity to study the development of marmoset infants with similar genetic backgrounds raised in different postnatal environments. As the method is practical and easy to use, we anticipate that it could also be applied to other labs working with common marmosets.

Autor destacado: Investigación sobre el tití - Alcance y desafíos 

Here, we describe a hand-rearing method for raising infant marmosets in an animal incubator. This method greatly increases the survival rate of marmoset infants, which provides the opportunity to study the development of marmoset infants with similar genetic backgrounds raised in different postnatal environments.