Los autores agradecen a J. Priscu, Chiuchiolo A. y el equipo de McMurdo LTER la limnología de asistencia en la recolección y preservación de las muestras en la Antártida. Damos las gracias a Ratheon Servicios polares y helicópteros PHI para el apoyo logístico. Micrografías de luz se han generado en el Centro de Miami de Microscopía Avanzada y el Centro de Imagen. Este trabajo fue apoyado por la Oficina de Programas de subvenciones NSF Polar 0631659 y 1056396.

1. Ejemplo de Adquisición <ol><li> Elija y prepare el sitio de muestreo un día antes de muestreo de la columna de agua. Esto permitirá que las capas estratificadas de la columna de agua a la reforma después de una perturbación debido a la perforación y la fusión del hielo-agujero. Identificar la ubicación del sitio de perforación con el GPS. </li><li> Para acceder a la columna de agua, comience por la perforación de un agujero en el hielo con un taladro del hielo Jiffy conectado a una extensión de Jiffy de 4 pulgadas de vuelo y un poco de corte. Para evitar la congelación de la broca en el agujero, trate de evitar la perforación en el agua en estado líquido mediante la detención de perforación de aproximadamente 4-6 cm por encima de la parte superior de la columna de agua. </li><li> El taladro tendrá que ser ampliado de un diámetro de 15 a 60 cm antes del muestreo. Esto se logra mediante el uso de un horno de fusión agujero (Modelo Hotsy) que circula glicol polietileno caliente a través de un tubo de cobre. Agujero de fusión suele durar hasta 18 horas. </li><li> Antes de que el muestreo de la columna de agua, asegúrese de que todo el equipo necesario y la muestra de Sanvasos orage se ensamblan en el sitio de muestreo. Materiales de muestreo incluyen: botella de Niskin (L de capacidad 5-10), cabrestante con la profundidad calibrada por cable, Messenger, botellas suficientes muestras para cada profundidad de muestreo y refrigeradores para el transporte de muestras. </li><li> Comenzar el muestreo temprano en el día (~ 5 horas), como el filtrado de agua de los lagos debe ser completado en el día del muestreo. Recoger muestras de agua (1.5 L) de las profundidades deseadas (para este estudio: 6-m, 15 m, y de 18 m profundidad de muestreo, medidos desde el nivel del agua piezométrico en el agujero de hielo) con un sampler Niskin conectado a un calibrado la mano del cabrestante. Para evitar la perturbación de la columna de agua antes de recolectar poca profundidad más profundos. </li><li> Tienda lago muestras en cámaras frigoríficas y transporte desde el sitio de la muestra al laboratorio de campo con un trineo conectado a un ATV (vehículo todo terreno). Las muestras deben ser tratados o estabilizados (por ejemplo: congelación de flash en nitrógeno líquido) en el laboratorio de campo inmediatamente después de la toma de muestras. </li></ol> 2. Development de cultivos de enriquecimiento <ol><li> Para el cultivo de cultivos de enriquecimiento, concentrado 0,5-1 litros de agua del lago a 47 mm de 0,45 micras de tamaño de poro de filtración con filtros de polietersulfona suave (&lt;0,3 atm). Si la diversidad de la comunidad natural que se desea, se filtra una segunda muestra en 47 mm de 0,45 micras de tamaño de poro filtros de polietersulfona y seguir los protocolos de acuerdo a Bielewicz et al. 4 para eucariota diversidad filogenética. </li><li> Transferir filtros a 50 ml tubo estéril halcón contiene ~ 20 ml de agua del lago filtrada obtenida de la profundidad de muestreo igual a la del filtro. Lave suavemente las células del filtro utilizando una pipeta estéril. </li><li> Transferir suspensión celular a un 25 cm 2 matraz estéril de cultivo celular. Añadir agua filtrada lago recogidos de cada profundidad de la muestra para aumentar el volumen de cultivo a 45 ml. Crear múltiples repeticiones para cada profundidad de muestreo, si enriquecimiento en diferentes medios de cultivo de los deseados. </li><li> Suplemento frascos de cultivo con 50X ssoluciones terile a una concentración final de 1X de los siguientes medios de cultivo: Medio Basal de Bold, BG11 y F / 2. Si el cultivo de organismos mixotróficos se requiere, configuración dos buques F/2-supplemented y añadir 2-3 granos de arroz estéril a uno de los matraces. </li><li> Incubar los frascos de cultivo a baja temperatura (4 ° C) y baja radiación (fotones de 20 mol m -2 s -1) en un crecimiento con control de temperatura de la incubadora al menos 4 semanas en la Antártida antes de su envío al laboratorio de EE.UU.. Si se desean aislamientos, la placa de 250 ml del cultivo de enriquecimiento en placas de agar que contienen los medios apropiados de crecimiento después de dos semanas de incubación. </li><li> Para el envío a los EE.UU., los cultivos de enriquecimiento de transferencia a estériles de 50 ml tubos Falcon. Requisito de solicitar el envío de &quot;no congelar&quot; y &quot;mantener la calma&quot; en el envío de solicitud. Si bien el proceso de envío de la Antártida es relativamente rápido (2 semanas por vía aérea comercial) y muy fiable, hay una posibilidad de pérdida de órgano fastidiosoismos durante el proceso de transporte. Por lo tanto, los investigadores pueden querer preservar una submuestra antes de su envío de manera que la pérdida de algunas especies durante el proceso de envío se puede evaluar. </li><li> A la llegada en los EE.UU., la transferencia de 5 ml de cultivo de enriquecimiento en 45 ml de medio de crecimiento apropiados en un matraz Erlenmeyer de 125-ml estéril tapado con una esponja estéril. Los cultivos de enriquecimiento debe mantenerse como culturas de pie en una temperatura de la cámara controla el crecimiento del medio ambiente (cámara de crecimiento diurno, VWR) a 4 ° C/20 mol fotones m -2 s -1. Los cultivos deben ser transferidos a medio fresco cada 30 días. </li></ol> 3. La extracción de la célula lisado de Enriquecimiento filtrados <ol><li> Filtro de 5 ml de cultivo de enriquecimiento en un 25 mm Whatman GF / F con filtro de vacío suave (menos de 10 psi). El filtro se puede almacenar durante varias semanas a -80 ° C antes de analizar la actividad Rubisco. </li><li> Cortar el filtro en secciones de 4-5 con una tijera de acero estériles ytransferencia de las piezas con pinzas estériles a un tubo de 2 ml tapón de rosca llena de una quinta parte de la forma completa con 0,1 mm de diámetro de circonio / sílice cuentas. </li><li> Añadir 1,25 mL de tampón de extracción del filtro (50 bicina mM, 10 mM de MgCl 2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml de BSA, y 0,1% de Triton X-100; añadir fresco: 10 mM NaHCO $ 3, 10 mM de DTT, 3,3 mM de aminocaproico ácido, 0,7 benzamidina mM, pH 7,8) 13 e interrumpir las células utilizando un batidor Minibead tres veces durante 30 s con el ajuste de velocidad 48. Para evitar un calentamiento de la muestra, beadbeating alternan con 1 incubación hielo min. </li><li> Centrifugar suspensión filtro durante 2 minutos a 3000 xga 4 ° C para formar un gránulo suelto de GF / F fibras de filtro y los restos de la pared celular. </li><li> Quitar una parte alícuota de 200 uL y se sumergen en 800 l de helado de acetona al 90%. Medir la clorofila extraíble (chl) una en un espectrofotómetro a los valores de longitud de onda de 664 nm y 647 nm 14. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar remaining sobrenadante a 4 ° C durante 2 min a 15.000 xg, y transferir el sobrenadante (evitar el sedimento de las membranas celulares insolubles y restantes GF / F fibras de filtro) a un tubo de microcentrífuga limpio 1,5 ml. Este lisado celular soluble ahora se puede utilizar en el ensayo de la actividad Rubisco carboxilasa. </li><li> Lisado puede ser almacenada a -80 ° C después de la adición de 12,5% de glicerol y la congelación de flash en nitrógeno líquido. Una pérdida de actividad puede producirse después de múltiples de congelación / descongelación ciclos dependiendo de la sensibilidad de las enzimas en el lisado. Por lo tanto, la actividad de lisado de fresca congelada frente debe ser probado antes en gran escala de células lisado extracciones. </li></ol> 4. RubisCO actividad carboxilasa Ensayo filtro <ol><li> Transferir 125 l de lisado soluble a un tubo de 15 ml tornillo microcentrífuga tapa (la tapa no es necesario) que ha sido enfriada en hielo. Para las muestras de control negativo, añadir 125 lisado soluble l a 15 ml tubo de microcentrífuga de tornillo tapa, pero no añadir sustrato (en el paso 4,7). Ejecutarduplicar las reacciones de todas las muestras y los controles negativos. </li><li> Preparar 10 ml de tampón de ensayo fresco (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO 3, 25 mM de MgCl 2) y enfriar en hielo. Alícuota suficiente del tampón de ensayo para todas las muestras y los controles negativos (100 l por muestra / control más 100 l adicional) a un tubo de 5 ml. Lleve a cabo todos los pasos subsiguientes en una campana extractora. </li><li> Añadir 40 l de NaH 14 CO 3 (500 Ci / ml) por ml de tampón de ensayo para el buffer de alícuotas y mantener el buffer en hielo. </li><li> Retirar 10 l del tampón de ensayo que contenía 14 C y se diluye en 1 ml de tampón de ensayo. Después de invertir para mezclar, añadir 100 ml de la mezcla diluida 1:100 a 3 ml de Bio-Safe II centelleo contando cóctel en un vial de centelleo. Invertir para mezclar. Recuento de centelleo (Beckman LS6500) debe ser más de 18.000 copias por minuto antes de continuar con el ensayo. </li><li> Cuando un número suficiente de NaH 14 CO 3 ha sido añadido a la tampón de ensayo,mover los tubos de reacción a un baño seco preajustado a 25 ° C y se incuba durante 3-5 minutos. </li><li> Añadir 100 l de tampón de ensayo a los lisados ​​e incubar durante 5 min a 25 ° C. </li><li> Añadir 20 l de 15 mM de ribulosa bisfosfato, a las muestras y permitir que la reacción proceder durante 5-10 minutos a 25 ° C. </li><li> Añadir 100 l de ácido propiónico (100%) (Fisher) para detener la reacción. Centrifugar durante 1 hora a 2.000 xg de agotamiento de los no incorporada 14 C. </li><li> Transferir el volumen total de las muestras a viales de centelleo que contenían 3 ml de Bio-Safe II cóctel de centelleo contando. Determinar cpm de productos ácidos finales estables por recuento de centelleo (B. Witte, R. comunicación Tabita personal). </li><li> Calcular las tasas de actividad de Rubisco en un chl una base 14. </li></ol> 5. Los resultados representativos Hemos utilizado el cultivo de enriquecimiento para aislar fototróficas adaptado al frío y protistas mixotróficos que residían en la Antártida LAke Bonney. Para capturar una mayor diversidad de organismos, hemos probado tres tipos de medios de cultivo: Medio basal de Bold (BBM) 15, F/2-Si Medio Marino 16, 17 y 18 BG11 Medio. La inspección visual de los cultivos de enriquecimiento por microscopía óptica reveló que los cultivos fueron dominada por protistas fototróficas (indicado por la presencia de pigmento clorofila en la mayoría de las células) y albergaba una variedad de morfologías celulares en función de la profundidad de muestreo de la cual se tomó el inóculo y el tipo de medios utilizados en el cultivo (Fig. 1). Se midió los niveles máximos de actividad carboxilasa catalizada por la enzima RubisCO como una aproximación a la potencial fijación de carbono. Chl a la abundancia ha sido monitorizada como una estimación de la biomasa fototróficas protistas (Fig. 2). A pesar de cultivo de todas las culturas en las mismas condiciones de temperatura / luz de régimen (es decir, 4 ° C/20 mol m -2 s -1), el potencial de fijación de carbonoy la biomasa fototróficas varió dramáticamente entre los cultivos de enriquecimiento. Máxima actividad RubisCO se observó en cultivos de enriquecimiento de cultivo, ya sea en BBM (Enriquecimientos 4 y 6) o BG11 (Enriquecimientos 13 y 14) medios de crecimiento, mientras que los cultivos enriquecidos en medio de crecimiento F / 2 (Enriquecimientos 19, 21, 23) exhibió un 4 - a 34 veces menor actividad carboxilasa máximos. Estas diferencias no se deben a los niveles más bajos de biomasa en los cultivos de F / 2, ya que la actividad carboxilasa se expresó en un Chl una base. Por otra parte, la actividad Rubisco no se correlacionó con la concentración de chl a (r = -0,023, p&gt; 0,1;. La figura 2, recuadro). Las culturas BBM inoculados con el agua del lago de 6 my 15 m (Enriquecimientos 4 y 5) tuvo el mayor Chl a los niveles, mientras que todas las otras culturas exhiben chl relativamente bajo a, independientemente de la actividad de la enzima rubisco (Fig. 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" /> Figura 1.Representante microbianos eucariotas culturas enriquecimiento que hemos seleccionado para el crecimiento de organismos diferentes. Identidad de la cultura se da en la parte inferior izquierda de los paneles. Todas las imágenes representan micrografías de luz generados usando aceite de inmersión con un aumento de 1000X. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" /> Figura 2. La capacidad potencial de fijación de carbono y clorofila extraíble unos niveles en los cultivos de la Antártida microbianos eucariotas aislados de enriquecimiento del lago Bonney y se cultiva en diversos medios de cultivo. Ver Tabla 1 para más detalles cultura Recuadro:. De correlación de Pearson entre la clorofila un potencial de fijación de carbono en abundancia y culturas microbianas antárticas enriquecimiento eucariotas.

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No tenemos nada que revelar.

Estudios moleculares recientes han reportado una gran diversidad de eucariotas unicelulares a través de una amplia gama de entornos de 3, 19, 20, sin embargo, debido a la falta de aislados en toda la gama de hábitats protist el papel funcional de estas especies individuales en las redes alimentarias son en gran parte desconocido. En este estudio, se han descrito métodos para enriquecer a las especies eucariotas microbianas presentan versatilidad metabólica de un ambiente relativamente undersampled, una pe...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> BBM </td><td> Sigma </td><td> B5282 </td><td></td></tr><tr><td> BG11 </td><td> Sigma </td><td> C3061 </td><td></td></tr><tr><td> F / 2 </td><td> Sigma </td><td> G9903 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtro, 25 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-64 </td><td></td></tr><tr><td> GF / F filtro, 47 mm </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-874-71 </td><td></td></tr><tr><td> Polietersulfona filtro, 0,45 micras de poro, 47 mm </td><td> Pall Life Sciences </td><td> 61854 </td><td></td></tr><tr><td> Estéril frasco de cultivo celular, 25 cm2 </td><td> Corning </td><td> 430639 </td><td></td></tr><tr><td> Diurnal cámara de crecimiento </td><td> VWR </td><td> 35960-076 </td><td></td></tr><tr><td> Zirconia / perlas de sílice, 0,1 mm diamter </td><td> BioSpec Productos </td><td> 11079101z </td><td></td></tr><tr><td> Mini-bolas batidor </td><td> BioSpec Productos </td><td> 3110BX </td><td></td></tr><tr><td> Con tapón de rosca del tubo de microcentrífuga (1,5 l) </td><td> EE.UU. Científico </td><td> 1415-8700 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 14 CO 3 </td><td> ViTrax </td><td> VC 194 </td><td> Mantener en alícuotas de 400 l a -20 ° C </td></tr><tr><td> RuBP </td><td> Sigma </td><td> R0878-100mg </td><td> Disolver en 10 mM Tris-propiónico (pH 6,5) </td></tr></tbody></table>

establishment of microbial eukaryotic enrichment cultures from a chemically stratified antarctic lake and assessment of carbon fixation potential

Lago Bonney es uno de los numerosos permanentemente cubiertas de hielo lagos situados en los valles secos de McMurdo en la Antártida. La capa de hielo perenne, mantiene una columna de agua estratificada y químicamente a diferencia de otros cuerpos interiores de agua, impide en gran medida la entrada externa de carbono y los nutrientes de los ríos. Biota están expuestos a múltiples presiones ambientales, incluyendo el año severa deficiencia de nutrientes, las bajas temperaturas, sombra extrema, hipersalinidad, y la oscuridad de 24 horas durante el invierno 1. Estas condiciones ambientales extremas limitar la biota del lago Bonney casi exclusivamente a los microorganismos 2. Unicelulares eucariotas microbianos (llamados protistas &quot;) son actores importantes en el ciclo biogeoquímico global de 3 y desempeñan importantes funciones ecológicas en el ciclo del carbono en los lagos secos de los valles, ocupando ambos roles primario y terciario en la cadena alimentaria acuática. En los valles secos de alimentos acuáticos web, los protistas que fijannorganic de carbono (autotrofia) son los principales productores de carbono orgánico para los organismos organotrófico 4, 2. Phagotrophic o protistas heterótrofos capaces de ingerir bacterias y protistas más pequeños actúan como los principales depredadores en la cadena alimenticia 5. Por último, una proporción desconocida de la población protista es capaz de metabolismo combinado mixotrófica 6, 7. Mixotrofía de protistas implica la capacidad de combinar la capacidad fotosintética con la ingestión de los microorganismos phagotrophic presa. Esta forma de mixotrofía difiere de metabolismo mixotrófico en especies bacterianas, que generalmente implica moléculas de absorción de carbono disuelto. En este momento hay muy pocos aislamientos protistas de forma permanente cubierta de hielo polares, lagos, y los estudios de la diversidad de los protistas y la ecología en este entorno extremo ha sido limitada de 8, 4, 9, 10, 5. Una mejor comprensión de la versatilidad metabólica protista en la web simple alimento seco valle del lago ayudará en el desarrollo de modelos para la role de los protistas en el ciclo global del carbono. Se empleó un enfoque de enriquecimiento de la cultura para aislar a los protistas potencialmente fototróficas y mixotrófica del lago Bonney. Profundidades de muestreo en la columna de agua fueron elegidos en base a la ubicación de la producción primaria máximos y protista diversidad filogenética 4, 11, así como la variabilidad en los principales factores abióticos que afectan los modos de protistas tróficos: poca profundidad de muestreo están limitados por los nutrientes importantes, mientras que a mayores profundidades de muestreo están limitados por la disponibilidad de luz. Además, las muestras de agua del lago se complementaron con múltiples tipos de medios de crecimiento para promover el crecimiento de una variedad de organismos fototróficas. RubisCO cataliza el paso limitante en la Bassham Calvin Benson (CBB) del ciclo, la principal vía por la cual organismos autótrofos fijar el carbono inorgánico y carbono orgánico para proporcionar los niveles tróficos más altos en las cadenas alimentarias acuáticas y terrestres 12. En este estudio, we aplica un ensayo de radioisótopos modificado para 13 muestras filtradas para controlar la actividad carboxilasa máxima como una aproximación a la potencial fijación de carbono y la versatilidad metabólica en los cultivos de enriquecimiento del lago Bonney.

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Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Eucariotas microbianos son tanto una fuente de carbono derivado de la fotosíntesis y las principales especies depredadoras en forma permanente lagos cubiertos de hielo del Antártico. Este informe describe un enfoque de enriquecimiento de la cultura para aislar microbios eucariotas metabólicamente versátiles desde el lago de la Antártida, el lago Bonney, y evalúa el potencial de fijación de carbono inorgánico utilizando un ensayo de radioisótopos para la ribulosa-1 ,5-bisphophate carboxilasa oxigenasa (Rubisco) la actividad.

Establecimiento de cultivos de enriquecimiento microbianos eucariotas a partir de un estratificado químicamente lago de la Antártida y evaluación del potencial de carbono de fijación

Lake Bonney is one of numerous permanently ice-covered lakes located in the McMurdo Dry Valleys, Antarctica. The perennial ice cover maintains a ...

establishment-microbial-eukaryotic-enrichment-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K vistas.  Miami University. Eucariotas microbianos son tanto una fuente de carbono derivado de la fotosíntesis y las principales especies depredadoras en forma permanente lagos cubiertos de hielo del Antártico. Este informe describe un enfoque de enriquecimiento de la cultura para aislar microbios eucariotas metabólicamente versátiles desde el lago de la Antártida, el lago Bonney, y evalúa el potencial de fijación de carbono inorgánico utilizando un ensayo de radioisótopos para la ribulosa-...

Video: Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer and infections, but are also implicated in the early stages of pregnancy and transplant rejection. These cells are present in peripheral blood, from which they can be isolated. Cells can be isolated using either positive or negative selection. For positive selection we use antibodies directed to a surface marker present only on the cells of interest whereas for negative selection we use cocktails of antibodies targeted to surface markers present on all cells but the cells of interest. This latter technique presents the advantage of leaving the cells of interest free of antibodies, thereby reducing the risk of unwanted cell activation or differenciation. In this video-protocol we demonstrate how to separate NK cells from human blood by negative selection, using the RosetteSep kit from StemCell technologies. The procedure involves obtaining human peripheral blood (under an institutional review board-approved protocol to protect the human subjects) and mixing it with a cocktail of antibodies that will bind to markers absent on NK cells, but present on all other mononuclear cells present in peripheral blood (e.g., T lymphocytes, monocytes...). The antibodies present in the cocktail are conjugated to antibodies directed to glycophorin A on erythrocytes. All unwanted cells and red blood cells will therefore be trapped in complexes. The mix of blood and antibody cocktail is then diluted, overlayed on a Histopaque gradient, and centrifuged. NK cells (&gt;80% pure) can be collected at the interface between the Histopaque and the diluted plasma. Similar cocktails are available for enrichment of other cell populations, such as human T lymphocytes.

Natural killer cells are a small population of lymphocytes. Here we show how to isolate these cells from human blood by negative selection, using a kit from StemCell Technologies. The cells obtained are viable and untouched by antibodies, and therefore ready to be used for a number of procedures.

Enriquecimiento de las células NK a partir de sangre humana con el Kit de RosetteSep de Tecnologías de la StemCell

Natural killer (NK) cells are large granular cytotoxic lymphocytes that belong to the innate immune system and play major roles in fighting against cancer ...

Investigación

Biología

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Un híbrido método de extracción de ADN para la Evaluación de las comunidades bacterianas cualitativa y cuantitativa de Aves de Corral en muestras de producción

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Genome-wide Purification of Extrachromosomal Circular DNA from Eukaryotic Cells

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs contribute to genetic variation among somatic cells in multicellular organisms and to evolution of unicellular eukaryotes. Sensitive methods for detecting eccDNA are needed to clarify how these elements affect genome stability and how environmental and biological factors&#160;induce their formation in eukaryotic cells. This video presents a sensitive eccDNA-purification method called Circle-Seq. The method encompasses column purification of circular DNA, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification of eccDNA, deep sequencing, and mapping. Extensive exonuclease treatment&#160;was&#160;required for sufficient linear chromosomal DNA degradation. The rolling-circle amplification step by &#966;29 polymerase enriched for circular DNA over linear DNA. Validation of the Circle-Seq method on three S. cerevisiae CEN.PK populations of 1010 cells detected hundreds of eccDNA profiles in sizes larger than 1 kilobase. Repeated findings of ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30,&#160;HXT6, HXT7 genes on circular DNA in both S288c and CEN.PK suggests that DNA circularization is conserved between strains at these loci. In sum, the Circle-Seq method has broad applicability for genome-scale screening for eccDNA in eukaryotes as well as for detecting specific eccDNA types.

This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.

La purificación de todo el genoma de ADN circular Extracromosómica a partir de células eucariotas

Extrachromosomal circular DNAs (eccDNAs) are common genetic elements in Saccharomyces cerevisiae and are reported in other eukaryotes as well. EccDNAs ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocolo para el uso de gen Set enriquecimiento análisis para identificar el modelo Animal adecuado para la investigación traslacional

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment and maintenance of gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana). This approach includes built-in sterility checks for ongoing quality control. Gnotobiotic insects are defined here as cockroaches that still contain their vertically transmitted endosymbiont (Blattabacterium) but lack other microbes that normally reside on their surface and in their digestive tract. For this protocol, egg cases (oothecae) are removed from a (nonsterile) stock colony and surface sterilized. Once collected and sterilized, the oothecae are incubated at 30 &#176;C for approximately 4&#8722;6 weeks on brain-heart infusion (BHI) agar until they hatch or are removed due to contamination. Hatched nymphs are transferred to an Erlenmeyer flask containing a BHI floor, sterile water, and sterile rat food. To ensure that the nymphs are not housing microbes that are unable to grow on BHI in the given conditions, an additional quality control measure uses restriction fragment-length polymorphism (RFLP) to test for nonendosymbiotic microbes. Gnotobiotic nymphs generated using this approach can be inoculated with simple or complex microbial communities and used as a tool in gut microbiome studies.

Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches Periplaneta americana

This protocol is used in establishing and maintaining gnotobiotic American cockroaches (Periplaneta americana) by surface sterilizing the egg cases (oothecae) prior to hatching. These gnotobiotic insects contain their vertically transmitted Blattabacterium endosymbionts but have axenic guts.

Establecimiento y Mantenimiento de Cucarachas Americanas Gnotobiotic (Periplaneta americana)

Gnotobiotic animals are a powerful tool for the study of controls on microbiome structure and function. Presented here is a protocol for the establishment ...

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf can measure PSII absorption cross-section (&#963;PSII), maximum photochemical efficiency (Fv/Fm), effective photochemical efficiency (Fq&#8242;/Fm&#8242;), and non-photochemical quenching (NPQNSV) for various eukaryotic algae and cyanobacteria, almost all FRRf studies to date have focused on phytoplankton. Here, the protocol describes how to measure PSII photophysiology of an epizoic alga Colacium sp.&#160;Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in its attached stage (attached to zooplankton), using cuvette-type FRRf. First, we estimated the effects of substrate zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. M&#252;ller 1776, Cladocera, Daphniidae) on baseline fluorescence and &#963;PSII, Fv/Fm, Fq&#8242;/Fm&#8242;, and NPQNSV of planktonic Colacium sp. To validate this methodology, we recorded photophysiology measurements of attached Colacium sp. on S. mucronata and compared these results with its planktonic stage. Representative results showed how the protocol could determine the effects of calcium (Ca) and manganese (Mn) on Colacium sp. photophysiology and identify the various effects of Mn enrichment between attached and planktonic stages. Finally, we discuss the adaptability of this protocol to other periphytic algae.

Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II photophysiology and primary productivity. Here we describe a protocol to measure PSII photophysiology of epizoic alga, Colacium sp. on substrate zooplankton using cuvette-type FRRf.

Medición de la fotofisiología de la etapa adjunta de Colacium sp. por un fluorómetro de tasa de repetición rápida tipo Cuvette

Fast repetition rate fluorometer (FRRf) is a beneficial method for measuring photosystem II (PSII) photophysiology and primary productivity. Although FRRf ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Aislamiento de microARN de cultivos de garrapatas ex vivo de glándulas salivales y vesículas extracelulares

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...

Collection, Fixation, and Mounting of Caudal Penduncle from Zebrafish after Cryoinjury

To begin, prepare two milliliters of 4%formalin or any other appropriate fixative. Also keep a petri dish, forceps, and surgical scissors ready before starting the procedure. Place the properly euthanized cryoinjured fish in a petri dish containing deionized water.Using scissors, perform a cut through the body, anterior and posterior to the caudal peduncle. Let the tissue bleed out in the deionized water inside the petri dish. Using forceps, collect and transfer the caudal peduncle into the prepared fixative solution in a microcentrifuge tube.Carefully invert the tube several times. Before mounting, wash the fixed tissue in PBS for 10 minutes on a rocker. Then transfer it into a two-milliliter microcentrifuge tube containing a solution of 30%sucrose in deionized water, pre-cooled to four degrees Celsius and gently invert the tube several times.Leave the tube upright at 4 degrees Celsius for at least 24 hours. Fill an embedding mold with a five-millimeter layer of OCT mounting medium. Using forceps, place the caudal peduncle at the bottom of the mold.Adjust its orientation for either transversal or coronal sections. Let the medium freeze in a box of dry ice. As soon as the tissue is stabilized in the desired position, fill up the rest of the mold before the OCT completely freezes over.Store the mold at 80 degrees Celsius for at least one hour before sectioning the tissue using a cryostat. The extent of cryoinjury at different days post-cryoinjury, or DPCI, was analyzed in the caudal peduncle sections using trichrome staining composed of Aniline Blue, Acid Fuschin, and Orange-G. The damaged areas were determined by the absence of orange staining.At 4 and 7 dpci, the transverse section displayed extensively degenerated skeletal muscle in the cryoinjured flank of the body. Immunofluorescence analysis showed that, at 4 DPCI, the injured side of the caudal peduncle contained abundant DAPI-positive cells but little to no F-actin and tropomyosin 1, indicating degenerated muscles. At 7 dpci, tropomyosin 1 and F-actin could be detected in the wound, close to the vertical body midline, indicating the start of new myofiber formation.At 30 dpci, both sides of the body displayed a similar distribution of F-actin staining, indicating efficient skeletal muscle restoration.