Los autores desean agradecer a Chiyoko Kobayashi y Agata Kiyokazu de consejos útiles sobre el trasplante de planaria, así como los miembros anteriores y actuales del laboratorio de Sánchez de discusión muy valiosa durante el desarrollo de estas técnicas. Este trabajo fue apoyado por el NIH Formación Grant (5T32 HD0791) a la Oficina del Contralor General y los NIH R37GM057260 a ASA. ASA es un Médico Howard Hughes, investigador del Instituto.

Nota: este protocolo sugiere el uso de materiales potencialmente peligrosos (plomo y cloretona). Adquirir, lea y siga las MSDS para todos los materiales potencialmente peligrosos. 1. Cultura Animal, selección y preparación <ol><li> Para el cultivo y uso de animales manejo del agua planaria (1X sales de Montjuïc 9) y pipetas de plástico de transferencia. </li><li> Sexual biotipo Schmidtea mediterranea se puede utilizar cuando se crían en el laboratorio bajo condiciones de cultivo normales 10. Para producir muestras asexuales de tamaño requerido, S. mediterranea elevado a temperatura ambiente bajo condiciones normales 9 debe ser alimentado al doble de la frecuencia normal de triples (2-3 veces por semana) durante uno o dos meses antes de usar. Alternativamente, los animales asexuales alimentados a la frecuencia normal puede ser mantenida a 10 grados Celsius indefinidamente a fin de aumentar su tamaño medio. </li><li> Seleccione los animales que se encuentran entre 1 a 2 cm delargo y ancho de 2 mm, se mueren de hambre los animales de 3-7 días antes de su uso. </li><li> Si se realiza algún tratamiento farmacológico o radiológicas en los ejércitos destinados, los donantes, o los animales irradiados parte, realizar el tratamiento (s) en este punto. </li><li> Si los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo la necesaria alimentación de los animales, los animales mueren de hambre otros 3 a 7 días antes de su uso. </li></ol> 2. Preparación de Soluciones y Materiales <ol><li> Preparar una solución cloretona, un leve anestésico local, mediante la disolución de 0.1-0.2% w / v en agua cloretona planaria y enfriando la solución en hielo. </li><li> Si se realiza la irradiación parcial sólo, vaya al paso 2.7. Para el trasplante de tejido continúe con el paso 2.3. </li><li> El uso de un mechero Bunsen, doblar 0,75 mm de diámetro interior, que se utiliza para cortar el tejido del injerto, y 0,7 mm de diámetro exterior, que se utiliza para crear un agujero en el huésped que recibirá el injerto, tubos capilares a un ángulo de 90 ° a 1-2 cm desde el extremo de EAch tubo. Para guardar los materiales, doble ambos extremos de cada tubo capilar y romper por la mitad para producir dos herramientas. Tenga cuidado de no a las llamas de los confines de los tubos. </li><li> Corte los siguientes documentos a los tamaños indicados: <ul><li> Negro filtro de papel (cortado en rectángulos de aprox. 2,5 cm x 1,5 cm) </li><li> Whatman # 3 filtro de papel (cortado en rectángulos de aprox. 2 cm x 0,5 cm) </li><li> Kimwipe (doblada y cortada en tacos aprox. 3 cm x 0,5 cm x 4 capas) </li><li> Rollos de papel de cigarrillos (retire la tira de goma de mascar y cortar en rectángulos de aproximadamente 3 cm x 2 cm) </li></ul></li><li> Preparar modificada Holtfreter la solución (3,5 g / L de NaCl, 0,2 g / L de NaHCO 3, 0,05 g / l de KCl, 0,2 g / l MgSO 4, 0,1 g / l de CaCl 2, pH 7,0-7,5) y solución saturada de caseína Holtfreter y frío tanto a 4 ° C. </li><li> Adjunte una Kimwipe doblada a un cuadrado de Parafilm y colóquelo en un plato refrigerador Peltier o un dispositivo de refrigeración otra situada bajo un microscopio de disección. Saturar la Kimwipe con Holtf refrigeradasolución de reter y el lugar de dos rectángulos negros de papel de filtro en la Kimwipe. </li><li> Línea de cajas de Petri con papel Whatman n º 2 de papel de filtro. Humedezca el papel de filtro con una solución de Holtfreter y enfriar los platos de hielo. Para la irradiación parcial un plato más grande y el forro de papel de filtro puede ser utilizado. </li></ol> 3. Anestesia y Inmovilización <ol><li> Llene una caja de Petri con una solución de cloretona refrigerados y los gusanos de pipeta en el plato. Para el transplante sólo anestesiar un anfitrión y un donante a la vez. Para la irradiación parcial de muchos (n&gt; 10) los animales pueden ser anestesiados a la vez. </li><li> Deje que los gusanos en remojo en la solución cloretona hasta que se convierten inmóvil (5-10 min). </li><li> Enjuague los gusanos con la pipeta en un plato lleno de solución fría de Holtfreter. </li><li> Inmovilizar a los animales con la pipeta que sobre el papel negro de filtro saturado con la solución Holtfreter refrigerada y orientarlos parte ventral hacia abajo con unas pinzas. Si los animales son capaces de locOmote, tomar una solución Holtfreter exceso, ligeramente disminuir la temperatura de la placa Peltier o frío, o aumentar la duración del tratamiento cloretona. </li></ol> 4. La irradiación parcial Nota: Siga estos pasos para preparar los animales para la irradiación parcial. Si se realiza el trasplante en su lugar, vaya a la sección 5. <ol><li> Coloque una fría placa de Petri de la etapa 2.7 en el hielo en un cubo de hielo que se ajuste dentro de una principal fuente de irradiación de rayos-X. </li><li> Organizar animales anestesiados en una placa de Petri moviendo el papel negro filtro en el que están inmovilizados. El uso de pinzas para mover los gusanos anestesiados directamente los puede dañar. </li><li> Transporte dispuestos los animales a una parte superior-fuente de rayos X irradiador y situar el cubo de hielo de tal manera que la distancia desde el tubo de cátodo a los animales se reduce al mínimo, maximizando así la tasa de dosis efectiva. </li><li> Posición de liderazgo escudo (s) (Figura 1) entre los animales y el cátodo de TUbe como se desee. Los blindajes deben ser de 4,5 a 6 mm de espesor para permitir la atenuación del 97% a 99 de un 325kV haz de rayos X 11. </li><li> Entregar dosis de rayos X. Si la ablación completa de células madre de la no-blindados regiones se desea, entregar 30 Gy o más con un irradiador de rayos-X. Para referencia, 30 Gy es equivalente a 3,6 minutos a 320 kilovoltios y 10 miliamperios en una precisión de Rayos-X Inc. XRAD320 con una distancia campo-fuente de 30 centímetros. </li><li> Inmediatamente después de la dosis se ha completado, el manejo de los gusanos por el filtro de papel negro, de transferencia de los animales en el agua fría planaria. Permitir que el agua planaria calentar a temperatura ambiente y los animales a sí mismos desalojar del papel de filtro negro. El procedimiento de irradiación parcial se ha completado. </li></ol> 5. Trasplante de tejido <ol><li> Utilizando una pipeta de transferencia y fórceps, organizar anfitrión anestesiados y gusanos donantes en rectángulos separadas de papel de filtro negro en la Kimwipe que ha sido enfriado en el Peltier o enfriador de placas bajo el microscopio de disección. </li><li> El uso de un tubo de 0,75 mm de diámetro capilar interno cortar el enchufe del injerto del donante, y el uso de fórceps, colóquelo en un cabo de la forma en la parte del host. Si el material de injerto se queda atascado en el tubo capilar, desprender con una pinza. </li><li> El uso de un tubo de 0,7 mm de diámetro del capilar externa desconectar un enchufe de la máquina y el uso de pinzas de la posición del injerto en el agujero que se deja atrás. </li><li> Transferir el anfitrión trasplantado en su rectángulo negro papel de filtro en la placa de Petri preparada en la etapa 2.7. </li><li> Moje un pedazo de papel laminado con una solución saturada de caseína Holtfreter y colóquelo en la parte superior de la máquina trasplantado como diagramado en la Figura 2A. </li><li> Remoje cuatro trozos de papel de filtro en la caseína Holtfreter saturada de solución y se encajona en el de acogida trasplantado como diagramado en la Figura 2B. </li><li> Remoje cuatro fajos de Kimwipe corte en la caseína saturada Holtfreter la solución y las ponen sobreel papel de filtro de paso 5,6 (Figura 2B). Vuelva a colocar la tapa y coloque la placa de Petri en el hielo. </li><li> Transferir el gusano planaria de los donantes en el agua para recuperar, reparar y regenerar. </li><li> Cuando todos los trasplantes se han completado, coloque los gusanos trasplantados en un incubador de 10 ° C durante la noche. </li><li> A la mañana siguiente, teniendo cuidado de no perturbar el injerto, descubrir el gusano y la transferencia (en su papel de filtro negro) a una placa de Petri con agua planaria. </li><li> O permiten que el gusano se desplazan desde el papel de filtro o retírela con unas pinzas. </li><li> Cambie el agua planaria una vez cada 2-3 días. </li></ol> 6. Los resultados representativos Inmediatamente después de la irradiación parcial de la planaria se parecen normales y no afectados. Dependiendo de la dosis suministrada y la geometría del escudo utilizado, el tejido irradiado puede retroceder e incluso desintegrarse 7. Tejido blindado debe permanecer intacto. Follregresión del tejido debido y una pérdida de la integridad del tejido, un blastema se forman estructuras que faltan y se regeneran (Figura 3A). Si una amputación se realiza en la región parcialmente irradiado, el tejido irradiado serán rescatados (es decir, impide la regresión o de desintegración) (Figura 3B). En tanto la lesionada y la regeneración caso amputado se retrasará en comparación con un amputado no irradiado planaria (Figura 3C). Si una dosis de rayos-X de 30 Gy fue entregado y el animal parcialmente irradiado fue la ablación no lesionado, el éxito de células madre en un patrón que corresponde con el escudo de plomo que se utiliza puede ser confirmado 2 a 3 días después de la irradiación parcial de la hibridación in situ de las células madre marcador de Smed-piwi-1 12 (también conocido como smedwi-1) (Figura 4). A la mañana después de un trasplante, un injerto con éxito del tejido trasplantado debe ser evidentes wn el tejido del huésped, que se han adherido tanto a las superficies dorsal y ventral de la máquina (Figura 5). Ocasionalmente, el injerto se adhiere sólo a la superficie ventral o dorsal. Si el trasplante fue completamente satisfactoria, ninguna señal de que el injerto será visible desde cualquiera de la superficie dorsal o ventral del huésped (Figura 5B). Poco después de un injerto exitoso de tejido no irradiado en un huésped que había sido extirpada de las células madre por la irradiación letal 13,14, hibridación in situ para Smed-piwi-1 se ponen de manifiesto que las células madre están presentes principalmente en el injerto (Figura 5C ). Además, los injertos exitosos de los tejidos no irradiados letalmente irradiados en los ejércitos se traducirá en el rescate de los tejidos del huésped y la supervivencia a largo plazo de la serie 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" /> Figura 1. Disposición general de los componentes básicoss para la irradiación parcial. En un irradiador de rayos X con una parte superior posicionado fuente de rayos X (tubo catódico) la planaria anestesiados se coloca directamente debajo de la fuente de rayos X dentro del campo de irradiación. Con el fin de maximizar la tasa de dosis de rayos X, la distancia entre la planaria y la fuente de rayos X debe ser minimizado. Un protector de plomo debe colocarse entre el tubo de cátodo y el gusano anestesiado, lo más cerca posible del gusano como sea posible. El blindaje del cable debe ser diseñado, fabricado y colocado de modo que protege el tejido deseado, pero expone completamente el resto del gusano. Muchos fabricantes comerciales va a producir escudos personalizados de plomo de su diagrama de diseño simple, hemos utilizado con éxito Alpha Systems Corp. (Bluffdale, UT). El plomo debe ser suficientemente gruesa para permitir la cantidad deseada de blindaje. Por ejemplo, si casi completa de un blindaje 320 kV haz de rayos X se desea, el plomo debe ser de 4,5 a 6 mm de espesor. La planaria y el escudo se colocan enun Holtfreter de papel de filtro empapado en fila placa de Petri que descansa en un cubo de hielo. Dado un número suficientemente amplio campo de rayos X de radiación y una serie de protectores de plomo idénticas, muchos ejemplares pueden ser parcialmente irradiado a la vez (no se muestra). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" /> Figura 2. La construcción de la cámara de recuperación. (A) una vista en despiece de la cámara de tejido recuperación del trasplante, mostrando todos los componentes que están en capas sobre una encima de otra después de ser empapado en caseína saturado Holtfreter de solución. (B) Una cámara de recuperación casi terminado, que ilustra la colocación de enclavamiento de la Whatman # 3 rectángulos de papel de filtro que encierra el ajustadamente planaria anestesiados, impidiendo el movimiento durante la curación. La construcción cuidadosa de la cámara de recuperación evita el movimiento de los animales y la desecación, la promoción de una curación rápida y una mayor eficacia del trasplante de tejido. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" /> Figura 3. Resultados representativos de sencilla irradiación parcial posterior. Como Dubois descritas 7, (A) cuando la mitad posterior de las planarias estaban protegidos con plomo y luego expuestos a irradiación con rayos X del tejido anterior se observó que regresar de nuevo a la frontera entre los irradiados y blindado tejido de punto en el que blastemas no pigmentadas formado y los animales comenzaron a regenerar. (B) Por otro lado, cuando los animales fueron decapitados después de la irradiación mismo parcial realizada en (A), la regresión del tejido no se observó y el restante tejido anterior irradiado fue rescatado. El decapitado animales parcialmente irradiadas cabezas regenerada (B), sin embargo, la regeneración se retrasó considerablemente en comparación con los no irradiados controles decapitados (C). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" /> Figura 4. Representante outcome de la ablación parcial de células madre después de la irradiación parcial. todo el montaje hibridación in situ (WISH) para el marcador de células madre Smed-piwi-1 revela que planaria tipo salvaje células madre han distribuido a lo largo de sus cuerpos, con la excepción de que el tejido anterior al fotorreceptores (punta de flecha) y la faringe adecuada 14 (asterisco). (A) Deseo de Smed-piwi-1 en el control irradiado, pero totalmente protegidos planaria fijado tres días después de la irradiación muestra una distribución de células madre que es indistinguible de la de la planaria de tipo salvaje. (B) Por otro lado, deseo de Smed-piwi-1 en los animales que fueron sólo parcialmente protegidos, dejando a la exposición anterior y posterior, pero también se han fijado tres días después de la irradiación muestra que las células madre se realiza la ablación de las regiones no blindados . Las barras de escala son 500 micras. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" /> Figura 5. Examples de trasplante de tejidos con y sin éxito. (A) Imágenes en directo de puntos de vista dorsal y ventral de una planaria trasplantado con éxito tres días después del trasplante. El injerto (indicado) es claramente visible en ambas caras dorsal y ventral, y está rodeada por tejido sin pigmentación característica en la interfaz de injerto-huésped. (B) En consecuencia, los trasplantes fallidos de no mostrar ningún injerto de tejido visible en el sitio del trasplante (indicado) y en lugar de mostrar un curado, la herida no pigmentado, lateral desde el trasplante fracasó. Un injerto que se adhiere a sólo el dorsal o la superficie ventral puede parecerse a un trasplante con éxito (A) cuando se ve desde un lado y un trasplante de éxito (B) cuando se ve desde el otro. (C) Cuando el tipo salvaje (wt) el tejido se injerta en un huésped irradiado que ha sido extirpada de las células madre residentes y las células madre trasplantadas se reveló más tarde por el deseo de Smed-piwi-1 dos días después del trasplante,el éxito del trasplante se muestra claramente por la presencia específica de las células madre sólo en o alrededor de la ubicación del injerto (puntas de flecha). Las barras de escala son 500 micras.

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Zo&#246;l. 3, 269-294 (1906).</li><li>Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+&#225;+l+'&#232;tude+de+la+migration+des+cellules+de+règènèration+chez+les+Planaires+dulcicoles.">Contribution &#225; l '&#232;tude de la migration des cellules de règènèration chez les Planaires dulcicoles.</a> Bull. Biol. Fr. Belg. 83, 213-283 (1949).</li><li>Purton, L. E., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limiting+factors+in+murine+hematopoietic+stem+cell+assays.">Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays.</a> Cell Stem Cell. 1, 263-270 (2007).</li><li>Cebria, F., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+homologs+of+netrin+and+netrin+receptor+are+required+for+proper+regeneration+of+the+central+nervous+system+and+the+maintenance+of+nervous+system+architecture.">Planarian homologs of netrin and netrin receptor are required for proper regeneration of the central nervous system and the maintenance of nervous system architecture.</a> Development. , 132-3691 (2005).</li><li>Newmark, P. A., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+specifically+labels+the+regenerative+stem+cells+of+planarians.">Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians.</a> Dev. Biol. 220, 142-153 (2000).</li><li>Miller, W., Kennedy, R. 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C., S&#225;nchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMEDWI-2+is+a+PIWI-like+protein+that+regulates+planarian+stem+cells.">SMEDWI-2 is a PIWI-like protein that regulates planarian stem cells.</a> Science. 310, 1327-1330 (2005).</li><li>St&#233;phan-Dubois, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Les+cellules+de+r&#233;g&#233;n&#233;ration+chez+la+planaire+Dendrocoleum+lacteum.">Les cellules de r&#233;g&#233;n&#233;ration chez la planaire Dendrocoleum lacteum.</a> Bulletin de la Société Zooologique de France. 86, 172-185 (1961).</li><li>Gurley, K. 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No hay conflictos de interés declarado.

Importancia de la inmovilización La inmovilización es, con mucho, el paso más crítico para la correcta realización de cualquiera de estos procesos. Si planaria no están bien inmovilizados antes de la irradiación parcial, que puede moverse por debajo de la placa de plomo, produciendo resultados inconsistentes y confusión. Además, si los animales no están lo suficientemente inmovilizada después del trasplante, el gusano anfitrión probable se alejará del tejido del injerto, lo que res...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> De uso general con una pipeta de transferencia </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> Los tubos capilares (ID 0,75 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> Tubos capilares (OD 0,7 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> Papel de filtro negro </td><td> Schleicher y Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> Whatman # 2 filtro de papel 1002-055 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-810B </td></tr><tr><td> Whatman # 3 filtro de papel 1003-185 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> Rollos de papel de cigarrillos </td><td> Zig-Zag, original </td><td> NA </td></tr><tr><td> Petriplatos </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> Pinzas DUMONT, INOX # 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Cloretona </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 112054 </td></tr><tr><td> Caseína </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> Escudos de plomo </td><td> Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT </td><td> Diseño personalizado </td></tr><tr><td> XRAD-320 Irradiador Biológica </td><td> La precisión de rayos X, North Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

La planaria, un gusano plano de agua dulce, ha demostrado ser un potente sistema para la disección de la regeneración de los metazoos y 1,2 de células madre biología. La regeneración de las planarias de todos los tejidos perdidos o dañados es posible gracias a las células madre adultas denominado neoblastos 3. A pesar de estas células madre han sido definitivamente demostrado ser pluripotentes y singularmente capaz de reconstituir un animal entero 4, la heterogeneidad en la población de células madre y la dinámica de sus comportamientos celulares siguen siendo en gran medida sin resolverse. Debido al gran número y amplia distribución de las células madre a través del plan corporal planaria, métodos avanzados para la manipulación de las subpoblaciones de células madre para el estudio molecular y funcional in vivo son necesarios. El trasplante de tejidos y la irradiación parcial de dos métodos por los que se puede una subpoblación de células madre de las planarias aislados para estudios posteriores. Cada técnica tiene sus propias ventajas. Tel trasplante de tema permite la introducción de células madre, en un huésped ingenuo, que son intrínsecamente genéticamente distinta o han sido previamente tratados farmacológicamente. Alternativamente, la irradiación parcial permite el aislamiento de células madre dentro de un huésped, yuxtapuesto al tejido desprovisto de células madre, sin la introducción de una herida o cualquier violación de la integridad del tejido. El uso de estos dos métodos, uno puede investigar los factores celulares autónomos y no autónomos-que controlan las funciones de células madre, como la proliferación, diferenciación y migración. Tanto el trasplante de tejido de 5,6 y la irradiación parcial de 7 se han utilizado históricamente en la definición de muchas de las preguntas acerca de la regeneración de las planarias que permanecen en estudio en la actualidad. Sin embargo, estas técnicas han permanecido infrautilizada debido a la naturaleza laboriosa e inconsistente de los métodos anteriores. Los protocolos que se presentan aquí representan un gran paso adelante en la reducción del tiempo de unaND esfuerzo necesario para generar de forma reproducible un gran número de animales injertados o parcialmente irradiado con eficacias se aproximan al 100 por ciento. Cubrimos la cultura de los animales grandes, la inmovilización, la preparación para la irradiación parcial, el trasplante de tejido, y la optimización de la recuperación de los animales. Además, el trabajo descrito aquí se muestra la primera aplicación del método de irradiación parcial para su uso con la planaria más ampliamente estudiado, Schmidtea mediterranea. Además, el tejido eficiente de injerto en los gusanos abre la puerta a las pruebas funcionales de las subpoblaciones de células madre no tratados previamente o tratados en los ensayos de repoblación, lo que ha sido durante mucho tiempo el método estándar de oro para ensayar el potencial de células madre adultas en los mamíferos 8. La amplia adopción de estas técnicas, sin duda, conducen a una mejor comprensión de los comportamientos celulares de células madre adultas durante la homeostasis del tejido y la regeneración.

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Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.

La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

planarian-immobilization-partial-irradiation-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K vistas.  University of Utah School of Medicine. Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.

Video: Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Trasplante de piel murina

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Investigación

Biología

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentación de ensayo, pues el análisis de proteína de unión a la F-actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generación de humanos CD40 activado por células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

Los ensayos farmacológicos y genéticos funcionales para manipular la regeneración de la planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germen de Trasplante de Células y Tejidos Testículos xenotrasplante en ratones

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Aislamiento rápido y purificación de mitocondrias para el trasplante por disociación de tejidos y filtración diferencial

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Un modelo de ratón de la obstrucción Intestinal parcial

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Exploración planarian como una lectura cuantitativa del comportamiento para la detección de estímulos nocivos

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.